專利名稱：一種5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的產生菌及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種可產生5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的微生物菌株及利用該菌株發酵生產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(以下簡稱AICAR)的方法。
背景技術：
目前市場上銷售的鳥苷酸及其鈉鹽鳥苷酸鈉對人體有促進白細胞的增生、促進血管平滑肌舒張和活化肝功能的作用，臨床上用于各種原因引起的白細胞減少癥，也可用于急慢性肝炎和中毒性肝炎，同時，鳥苷酸鈉與肌苷酸鈉混合做成的食品增鮮劑的I+G(肌苷酸鈉+鳥苷酸鈉)的市場需求量越來越大，而鳥苷酸一般是由5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)通過有機化學合成方法制造；同時，AICAR還可作為合成2-巰基肌苷及異丙肌苷的原料，而2-巰基肌苷及異丙肌苷作為飼料添加劑有增強動物免疫的作用，目前用量越來越大；但現在的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)是由各種有機材料通過化學合成法進行生產，該方法存在成本較高、對環境污染大及產生的污染物難處理等缺點。
發明內容
本發明的目的是提供一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷產生菌以及采用該菌株發酵制備5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的方法，以避免用化學合成法生產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)所存在的問題。
本發明所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷產生菌是經選育的枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)XG15，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCC M205040。該菌株以下簡稱枯草芽孢桿菌XG15 CCTCCM 205040。
本發明所提供的菌株是以枯草桿菌肌苷產生菌GMI-741為出發菌株，采用菌體亞硝基胍、硫酸二乙酯、紫外線、氯化鋰等多因子誘變選育出一株的，具有腺嘌呤脫氨酶缺失、非精確嘌呤缺陷型的枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15，該菌株搖瓶發酵72小時可產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)20.3g/L。
本枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040在保藏斜面上28～34℃培養12～18小時，保藏斜面培養物呈乳白色，其適宜培養條件為1.培養物(肉湯平皿或保藏斜面培養基同)蛋白胨3～6g/l，牛肉膏10～18g/l，酵母膏5～10g/l，瓊脂15～25g/l。2.培養溫度25℃～35℃。培養物pH值6.5～7.5；在液體活化培養基中，28℃～34℃，培養12～18小時，每毫升菌數在2.0×109以上，pH值約6-8，培養后的液體靜止一段時間有乳白色菌體沉淀，其適宜生長條件為1.培養物葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥嘌呤0.010～0.040。2.培養溫度25～35℃。3.培養pH值6.0～8.0。4.培養方法培養18-24小時的斜面種子接入裝有20ml液體活化培養基的500ml三角瓶(0.07Mpa滅菌10min.)中，32℃于往復式搖床振動培養12-20小時。
本發明所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特點是用枯草芽孢桿菌XG15CCTCC M 205040做發酵菌株，利用糖質原料進行發酵。所說的糖質原料可為葡萄糖、淀粉雙酶水解糖(用糖化酶和α-淀粉酶水解)等，搖瓶發酵50-80小時，可產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)10-20g/l。它為工業發酵生產AICAR核苷提供了一種可行方法。
利用本枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040搖瓶發酵制備5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)的具體工藝過程如下(1)斜面菌種活化將培養好的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M205040斜面種劃線于新配制的活化斜面上進行菌種活化。所述的活化斜面組成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥嘌呤0.010～0.040，瓊脂20-25g/l，pH6.5-7.5。28-34℃培養18-24小時。
培養好的保藏斜面種保藏時間最長不要超過半年。
(2)菌種的液體活化將培養好的活化斜面種接一環于液體活化培養基中，使液體種的菌數達2.0×109個/ml以上。所述的液體活化培養基組成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥嘌呤0.010～0.040，起始pH6.5-7.5。液體活化培養基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28-34℃往復式搖床振蕩培養12-18小時，搖床轉速為80-110r/m，沖程為65-75mm。液體種的菌數可達2.0×109個/ml以上。
(3)搖瓶發酵按體積百分比為2～10％接種量，接入糖質原料發酵培養基中，在往復式搖床振蕩培養，待殘糖下降至3g/l以下時，停止發酵。所述的發酵培養基(組成同液體活化培養基)可用500ml三角瓶裝，裝量20ml，于32-38℃，沖程65-80mm，轉速90-130r/m的往復式搖床振蕩培養60-80小時，待殘糖下降至3g/l以下時，停止發酵。
適宜的發酵培養基成份如下(按每升培養基所含克重g/l計算)糖100～140，玉米漿10～20，酵母粉15～20，硫酸銨8～15，磷酸二氫鉀1～3，碳酸鈣10～30，尿素2～6，硫酸鎂0.5～1.5，pH6.5～7.5，其中碳酸鈣單獨稱入三角瓶中，尿素分開滅菌。
(4)將發酵完畢的搖瓶發酵醪液離心，取上清液，即得含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發酵醪液。
對含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發酵醪液，可采用以下紙層析分析AICAR核苷含量發酵液下搖瓶后，用4000r/m轉速的離心機離心10分鐘，用50ul微量進樣器點3號層析紙，硫酸銨作展開劑，展層5～10小時，烘干，用紫外分析儀照出AICAR核苷斑點，剪下斑點，用0.001mmol/l的HCl浸泡1-4小時。用752紫外分光光度計于260nm波長處測定紫外光吸收值，計算發酵醪液含AICAR核苷量。
本發明中最大的特點在于用微生物發酵法生產AICAR核苷，比以往通常采用的化學合成法的成本有較大的降低，且對環境的污染小，；本發明在最佳搖瓶發酵工藝條件下，產AICAR核苷最高可達20.3g/l。
具體實施例方式
實施例一將4℃冰箱內保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養基的組成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，鳥嘌呤0.05，瓊脂20，pH7.0。]，轉接到新配置的活化斜面培養基上，活化斜面培養基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，鳥嘌呤0.025，瓊脂20，pH7.0。經32℃恒溫培養20小時后，接一環于液體活化培養基中，液體活化培養基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，鳥嘌呤0.025，pH7.0。液體活化培養基于32℃水浴搖床(沖程70mm、轉速96r/m)振蕩培養15小時，這時，菌液濃度一般0D(菌液稀釋20倍，用721分光光度計650nm波長、1cm比色皿，蒸溜水作參比，測定光吸收值)達0.7以上。取1ml菌液(5％接種量)，接入發酵培養基中，發酵培養基的組成(g/l)如下葡萄糖110，玉米漿12，酵母粉18，硫酸銨10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1，尿素5(分開滅菌)，CaCO320(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 1，pH7.0。
發酵培養基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉速120r/m往復式搖床振蕩培養，溫度控制方式如下0～12小時，32℃；12～24小時，33℃；24～36小時，34℃；36～48小時，35℃；48～61小時，36℃。搖瓶發酵完畢后，發酵液用紙層析法測定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發酵72h產AICAR核苷最高可達到20.3g/l。
實施例二將4℃冰箱內保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養基的組成(g/l)蛋白胨3，牛肉膏10，酵母膏5，鳥嘌呤0.03，瓊脂20，pH6.7。]，轉接到新配置的活化斜面培養基上，活化斜面培養基的組成(g/l)如下葡萄糖10，尿素3.0，玉米漿4，蛋白胨5，酵母膏5，鳥嘌呤0.001，瓊脂20，pH6.7。經32℃恒溫培養14小時后，接一環于液體活化培養基中，液體活化培養基的組成(g/l)如下葡萄糖10，尿素3，玉米漿4，蛋白胨5，酵母膏5，鳥嘌呤0.001，pH6.7。液體活化培養基于30℃水浴搖床(沖程65mm、轉速80r/m)振蕩培養12小時，培養后，取1ml菌液(5％接種量)，接入發酵培養基中，發酵培養基的組成(g/l)如下葡萄糖100，玉米漿10，酵母粉15，硫酸銨8，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，尿素2(分開滅菌)，CaCO310(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 0.5，pH6.5。
發酵培養基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于65mm沖程、轉速90r/m往復式搖床振蕩培養，溫度控制方式32℃。搖瓶發酵完畢后，發酵液用紙層析法測定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發酵60h產AICAR核苷8.5g/l。
實施例三將4℃冰箱內保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillud substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養基的組成(g/l)蛋白胨6，牛肉膏18，酵母膏10，瓊脂25，pH7.5。]，轉接到新配置的活化斜面培養基上，活化斜面培養基的組成(g/l)如下葡萄糖30，尿素6.0，玉米漿10，蛋白胨15，酵母膏15，鳥嘌呤0.04，瓊脂25，pH7.5。經34℃恒溫培養24小時后，接一環于液體活化培養基中，液體活化培養基的組成(g/l)如下葡萄糖30，尿素6.0，玉米漿10，蛋白胨15，酵母膏15，鳥嘌呤0.04，pH7.5。液體活化培養基于34℃水浴搖床(沖程75mm、轉速110r/m)振蕩培養18小時，培養后，取1ml菌液(5％接種量)，接入發酵培養基中，發酵培養基的組成(g/l)如下葡萄糖140，玉米漿20，酵母粉20，硫酸銨15，磷酸二氫鉀3，硫酸鎂1.5，尿素6(分開滅菌)，CaCO330(先稱入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 1.5，pH7.5。
發酵培養基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于80mm沖程、轉速130r/m往復式搖床振蕩培養，溫度控制方式38℃。搖瓶發酵完畢后，發酵液用紙層析法測定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發酵80h產AICAR核苷18.1g/l。
權利要求
1.一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的產生菌，其特征在于該微生物菌株是經選育的枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040。
2.一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于用枯草芽孢桿菌XG15 CCTCCM 205040做發酵菌株，利用糖質原料進行搖瓶發酵。
3.根據權利要求1所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于所說的糖質原料為葡萄糖或淀粉雙酶水解糖，搖瓶發酵50-80小時。
4.根據權利要求1所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于所說的搖瓶發酵生產5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的工藝過程如下(1)斜面菌種活化將培養好的保藏枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040斜面種劃線于新配制的活化斜面上進行菌種活化；(2)菌種的液體活化將培養好的活化斜面種接一環于液體活化培養基中，使液體種的菌數達2.0×109個/ml以上；(3)搖瓶發酵按體積百分比為2～10％接種量，接入糖質原料發酵培養基中，在往復式搖床振蕩培養，待殘糖下降至3g/l以下時，停止發酵；(4)將發酵完畢的搖瓶發酵醪液離心，取上清液，即得含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發酵醪液。
5.根據權利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進行斜面菌種活化時，活化斜面組成為葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15g/l，鳥嘌呤0.010～0.040g/l，瓊脂20-25g/l，pH6.5-7.5。
6.根據權利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進行菌種的液體活化時，液體活化培養基組成為葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15g/l，鳥嘌呤0.010～0.040g/l，起始pH6.5-7.5。
7.根據權利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進行搖瓶發酵時，發酵培養基成份按每升培養基所含克重g/l計算，組成如下糖100～140，玉米漿10～20，酵母粉15～20，硫酸銨8～15，磷酸二氫鉀1～3，碳酸鈣10～30，尿素2～6，硫酸鎂0.5～1.5，pH6.5～7.5。
全文摘要
本發明提供一種5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的產生菌及生產5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的方法，所提供的微生物菌株是經選育的枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040。用該菌株做發酵菌株，利用糖質原料進行發酵，搖瓶發酵50－80小時，可產5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷(AICAR)10－20g/l。它為工業發酵生產5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷(AICAR)提供了一種可行方法。
文檔編號C12N1/20GK1710065SQ20051003440
公開日2005年12月21日 申請日期2005年4月28日 優先權日2005年4月28日
發明者施慶珊, 林小平, 許虹, 李良秋, 邱玉棠, 陳儀本, 歐陽友生, 謝小保, 黃小茉 申請人:廣東省微生物研究所