維生素d衍生物異構物的分離及異構化的方法

專利名稱：維生素d衍生物異構物的分離及異構化的方法
技術領域：
本發明是關于一種純化一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物的方法，尤指一種適用于選擇性酵素酯化與選擇性酵素溶劑分解、以及異構化反應的方法。
背景技術：
目前具有生物活性的維生素D衍生物已陸續被開發出來，例如1α，25-dihydroxylvitaminD2的支鏈C-25羥基取代為C-24羥基，且不同支鏈的修飾與取代，可具有不同性質的藥物活性。一C-24羥基維生素D衍生物的結構中，由于C-24位置為一對掌中心(chiral center)的碳原子，所以包含有C-24R羥基與C-24S羥基的兩種異構物形式。其中，又以C-24S羥基維生素D衍生物具有較佳的生物活性。因此，傳統上C-24羥基維生素D衍生物工藝的關鍵步驟即是分離出C-24羥基的兩種異構物形式。然而，公知方法中，有人是將C-24酮基進行不對稱還原反應、或利用合成法將具有正確位向的支鍵直接與維生素D骨架連結，但是由于反應條件過于嚴苛且反應時所需原料過于昂貴，導致生產成本提高，而不易量產。另有建議傳統管柱層析的方法，由于C-24R羥基與C-24S羥基的異構物極性相當且結構差異不大，因此分離效果不彰，即應用性不佳。此外，有人采用酵素反應進行異構物位向的選擇，但是傳統方法中對于制程所獲得的C-24R羥基維生素D衍生物大都不再處理而廢棄。如此，不僅造成環境污染，亦增加工藝成本等問題。
因此，目前亟需一種用以純化一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物的方法，其不僅可有效地分離出C-24R羥基與C-24S羥基的異構物，且可將較不具有生物活性的C-24R羥基維生素D衍生物再回收利用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種選擇性酵素酯化一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物的方法，其步驟包含有提供一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物、將C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物與一酯化試劑溶于一有機溶劑中或直接溶于該酯化試劑中，而獲得到一混合物、以及將一酵素(lipase)加入于上述的混合物中，進行選擇性酯化反應后，即得到一C-24羥基維生素D衍生物的酯化異構物。
于本發明中所提及異構物的混合物是選自包括下列式(I)或式(II)的化合物 其中，R1為氫或羥基保護基；且R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、或C6-C12芳基。此外，R2較佳可為環丙烷基或異丙烷基。
另外，于本發明中所使用的有機溶劑是為直鏈或支鏈型碳數12以內的烷類、烷基酸烷基酯類、二烷基醚類、或其組合，且本發明較佳適用的有機溶劑可為hexane、diisoproyl ether、ethyl acetate、vinyl butyrate、tert-butylmethyl ether、diethyl ether或其組合。于本發明中所提及的酯化試劑是為酰鹵素類(acyl halides)、酸酐類(acid anhydrides)、具有C2至C6低碳烷羧酸的乙烯酯類(vinyl esters)、或其組合，且較佳可為酰氯(acyl chloride)、醋酸酐(acetic anhydride)、醋酸乙烯酯(vinyl acetate)、丁酸乙烯酯(vinyl butyrate)、或其組合。由此，本發明能將C-24(R，S)羥基維生素D衍生物進行選擇性酯化，而易于分離出異構物的混合物。
于本發明的一態樣中，本發明選擇性酵素酯化方法所使用的酵素可為公知任一種酵素，較佳可為產堿菌屬脂肪酶(Alcaligenes sp.Lipase)、或假單胞菌屬脂肪酶(Pseudomonas sp.Lipase)。此外，該酵素的使用可為一固定化(fixed)技術或一非固定化(free)技術。
一較佳具體例中，本發明C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物為[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol.，且該混合物的異構物被選擇性酯化者為[5E，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
另一較佳具體例中，本發明C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物為[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol.，且該混合物的異構物被選擇性酯化者為[5Z，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
為了增加本發明的應用，本發明選擇性酵素酯化一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物的方法可選擇性含有一步驟，利用一管柱層析法，以便分離經由酵素酯化后的C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物、與未經酵素酯化后的C-24羥基維生素D衍生物異構物，而使本發明中所提的異構物的混合物可達到易于分離與純化的目的。此外，本發明還可于上述選擇性步驟后，可選擇性地再包含另一步驟，是將上述管柱層析法分離所獲得的C-24-acetoxy維生素D衍生物的酯化異構物進行一水解反應，以取得至少一C-24羥基維生素D衍生物的表異構物(epimer)。
于本發明的一具體例中，本發明C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物可為[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol，且經由酵素選擇性酯化而利用管柱層析法分離后，即可分別獲得[5E，7E，22E，24(R)]-24-acetoxy-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯、以及一表異構物(epimer)[5E，7E，22E，24(S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。最后，將上述C-24-acetoxy異構物進行一水解反應，即可獲得另一表異構物(epimer)[5E，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
在傳統C-24羥基維生素D衍生物異構物的制備中，所產生較不具商業價值R-form的C-24羥基維生素D衍生物，大都廢棄而不再回收處理。但是，上述本發明水解反應所獲得的R-form的C-24羥基維生素D衍生物可更利用以下本發明異構化的化學反應，重新獲得反應起始物C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物。此外，可再由上述本發明酵素酯化方法重新再合成出具有商業價值的S-form的C-24羥基維生素D衍生物。如此循環的反應路徑，不僅可促使反應的回收率增加，且提高了本發明的產業利用性。
上述異構化方法是將上述本發明水解反應所獲得的R-form的C-24羥基維生素D衍生物進行一Mitsunobu反應，而獲得C-24(R，S)酯類維生素D衍生物異構化的混合物。其中，本發明Mitsunobu的反應條件可為公知的條件，較佳可將R-form的C-24羥基維生素D衍生物加入一酯化試劑、一有機酸與一非質子性溶劑存在的環境下，于-30℃至80℃的反應溫度范圍內，進行一異構化反應，而得到C-24(R，S)酯類維生素D衍生物異構物的混合物。最后，將C-24(R，S)酯類維生素D衍生物異構化的混合物進行一水解反應或一還原反應，可重新得到C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物。
于本發明的一具體例中，本發明是將表異構物(epimer)[5E，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol進行一Mitsunobu反應，而獲得[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯的異構混合物。接著，再進行一水解反應或一還原反應，即重新得到可供進行選擇性酵素酯化反應的起始產物[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
另一具體例中，本發明是將表異構物(epimer)[5Z，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol進行一Mitsunobu反應，而獲得[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯的異構混合物。并且，再進行一水解反應或一還原反應，而重新得到可供進行選擇性酵素酯化反應的起始產物[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
本發明亦提供一種用于選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)一C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物的方法，其包含有提供一C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物、將C-24-acetoxy異構物的混合物加入一含有一酵素、一緩沖劑與一溶劑的混合液中，進行選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)，以得到一溶劑分解后的C-24羥基維生素D衍生物的異構物與一未經酵素溶劑分解的C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物。最后，分離C-24羥基維生素D衍生物異構物與C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物即可。一具體例中，本發明是利用管柱層析法來分離兩者，但不限于此方法。
本發明所適用的C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物是選自包括下列式(III)或式(IV)的化合物 其中，R1為氫或是羥基保護基；R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、或C6-C12芳基。此外，R2較佳可為環丙烷基或異丙烷基。
本發明選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)方法所使用的酵素是為產堿菌屬脂肪酶(Alcaligenes sp.Lipase)、或假單胞菌屬脂肪酶(Pseudomonas sp.Lipase)，且該酵素的使用可為一固定化(fixed)技術或一非固定化(free)技術。另外，于本發明中所適用的緩沖劑為水、低級烷醇類(lower alkylalcohol)、弱酸鹽水溶液或其組合的溶液，較佳可為乙醇、含有磷酸鹽的水溶液、或水。其中，低級烷(lower alkyl)是指一1至10個直鏈碳或支鏈碳型的烷基，且不限為環狀或非環狀結構。
上述本發明所提及的溶劑可為公知任一種溶劑，較佳可為直鏈或支鏈型碳數12以內的烷類、烷基酸烷基酯類、二烷基醚類、或其組合，且更佳適用的有機溶劑可為hexane、diisoproyl ether、ethyl acetate、vinyl butyrate、tert-butyl methylether或其組合。
于本發明的一具體例中，本發明C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物是為[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯，且該混合物的異構物可被選擇性酵素溶劑分解者為[5E，7E，22E，24(R)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
另一具體例中，本發明C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物可為[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯，且該混合物的異構物可被選擇性酵素溶劑分解者為[5Z，7E，22E，24(R)]-24-酯類-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
為了獲得C-24(S)羥基維生素D衍生物異構物，本發明選擇性酵素溶劑分解的方法可選擇性地還包含一步驟，將未經酵素溶劑分解的C-24(S)-acetoxy維生素D衍生物的異構物進行一水解反應，以得到一C-24(S)羥基維生素D衍生物的表異構物(epimer)。
然而，為了回收經由選擇性酵素溶劑分解后的C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物，本發明選擇性酵素溶劑分解的方法亦可選擇性地還包含一步驟，將C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物進行一Mitsunobu反應，而獲得C-24(R，S)酯類維生素D衍生物異構物的混合物。最后，將C-24(R，S)酯類維生素D衍生物異構物的混合物進行一水解反應或一還原反應，即可獲得C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物。由此，可將選擇性酵素solvolysis后較不具價值C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物，再次反應而重新獲得C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物，以提升本發明的回收率并增加產業的應用性。在此，所提及的Mitsunobu反應可如同前述本發明異構化反應的條件。
本發明還提供一種異構化一立體異構物(stereoisomer)的方法，其包括的步驟有提供一C-24羥基維生素D衍生物的異構物、將該立體異構物在一酯化試劑、一有機酸與一非質子性溶劑的存在下，于-30℃至80℃的反應溫度內，進行一異構化反應，以得到一C-24(R，S)-酯類維生素D衍生物異構物的混合物、且最后將上述C-24(R，S)-酯類維生素D衍生物異構物的混合物進行一水解反應或一還原反應，以得到一C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物。
上述本發明異構化方法所提及的異構物是為下列式(Ia)或式(IIa)
其中，R1為氫或是羥基保護基，與R2為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基。
本發明中任何所提及的酯化試劑可為公知Mitsunobu反應所需的組成，較佳可包含一膦化物(phosphine)、與一偶氮化合物。一較佳具體例中，膦化物可為一具有下列化學式的化合物(R)3-P其中，R可為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基。偶氮化合物較佳地可為一具有下列化學式的化合物 其中，R9與R10獨立地分別可為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基，更佳的偶氮化合物可為diisopropyl azodicarboxylate(DIAD)、diethylazodicarboxylate(DEAD)或其組合。
另外，本發明所適用的有機酸可不限其種類，較佳可為含有羧酸(Carboxylic Acid)的化合物；更佳可為含有C1-C6的飽和酸(aliphatic acid)、或含有苯環的有機酸(aromatic acid)，其化學式可如下所示 其中，R1、R2、R3、R4及R5可分別獨立為H、NO2、OCH3、CH3或鹵素。然而，本發明最適用的有機酸可為benzoic acid、chloroacetic acid、o-anisic acid、3-nitrobenzoic acid、3，5-dinitrobenzoic acid或其組合。
再者，于本發明所使用的非質子性溶劑可為公知任一種非質子性溶劑，較佳可為四氫呋喃、甲苯、二甲基甲酰胺(N，N-dimethyl formamide)或其組合。
其中，本發明中任何水解反應的條件可為公知水解反應條件，并不限于酸性或堿性水解，較佳可為一堿性水解反應，更佳為一堿金族或堿土族氫氧化物水解反應。
本發明中所提及的任何還原反應的條件，可為任何公知任一種還原試劑，較佳可為硼氫化物、或金屬氫化物，更佳可為硼氫化鈉、四氫化鋰鋁(LiAlH4)或其組合。
再者，本發明所提及的選擇性酵素酯化或選擇性酵素溶劑分解反應，其反應溫度無限制，較佳可介于10至60℃的范圍，且更佳可介于20至40℃的范圍。另外，其反應時間亦無限制，較佳可介于1至100小時的反應時間，且更佳可介于42至72小時。
對于C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物，于本發明一態樣中，本發明選擇性酵素酯化反應可使特定位向的異構物達到80mole％以上的酯化效果，而另一位向的異構物則不超過20mole％(diastereomer ratio80∶20)。此外，反應參數可取決本發明選擇性酵素酯化的成效。一較佳具體例中，本發明選擇性酯化的成效diastereomer ratio可達90∶10以上。一更佳具體例中，選擇性酯化的成效diastereomer ratio可達95∶5以上。
于本發明的另一態樣中，本發明選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)反應可使特定位向的異構物達到80mole％以上的分解效果，而另一位向的異構物則不超過20mole％(diastereomer ratio 80∶20)。此外，反應參數亦可取決本發明選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)的成效。一較佳具體例中，本發明選擇性solvolysis成效其異構物比例可達90∶10以上。一更佳具體例中，選擇性酯化的成效其異構物比例可達95∶5以上。
本發明方法不僅有效地分離出C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物，且將C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物重新回收再利用后，即可再次生成R-form與S-form的C-24羥基維生素D衍生物異構物。因此，本發明除了降低制程成本，亦可減少廢棄物的排放，且提升C-24(S)羥基維生素D衍生物異構物的總產率。
具體實施例方式
本發明選擇性酵素酯化或選擇性酵素溶劑分解的反應過程中，皆可利用HPLC及TLC檢測其反應程度。其中，本發明實施例中是使用JasscoHPLC(si-60，250×4mm；5μm)，其分析條件為ethyl acetate/hexane＝1/10進行分析。藉由HPLC可分析生成物C-24(R，S)的diastereomeric excess(d.e.值)，進而可決定其反應終點。當d.e.值大于80％時，即可結束反應的進行，且最佳的反應終點其d.e.值可大于95％。待反應結束后，即可利用一般過濾法將酵素分離，如離心過濾或抽真空過濾，并且再濃縮濾液，即獲得粗產物。最后，再利用管柱層析法分離出不同結構的異構物。
A.選擇性酵素酯化本發明選擇性酵素酯化的方法，可參照下列反應路徑1所示。其中，C-24羥基維生素D衍生物的A ring上具有-OH基時，并不會同時與C-24(R)OH發生競爭性的酯化反應，即C-24羥基維生素D衍生物其A ring上的-OH基，并不會發生選擇性酵素酯化反應。因此，無論C-24羥基維生素D衍生物其A ring上的-OH基是否接上保護基，都不影響本發明對于C-24羥基的選擇性酵素酯化反應。一具體例中，本發明所使用的保護基為第三丁基二甲基硅氧基(tert-butyldimethylsilyl)。
反應路徑1
實施例一提供10g(19.5mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl，且此混合物R∶S異構物比為56∶36。將上述10g異構物的混合物與10mL vinylacetate(107.5mmol)一并加入10mL正己烷后，再加入1.0g Alcaligenes sp.Lipase以非固定化方式反應，然后在35℃下持續攪拌反應。利用HPLC(廠牌Jassco，沖提管柱si-60，250×4mm；5μm)分析反應狀態，當混合物中C-24(R)羥基異構物幾乎完全轉換成酯類時，即停止反應，其反應時間約為48小時。經由HPLC分析結果，本反應的diastereomeric excess值(d.e.值)可達90％以上。
過濾反應完的溶液，并濃縮干燥的，即獲得一粗產物。然后，利用管柱層析法分離與純化此粗產物，在此系使用silica gel為沖提管柱，沖提液為含有6.0％ethyl acetate(EA)的hexane溶液，經分段收集及濃縮后獲得5.4g C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)與2.3g C-24(S)羥基化合物(Ib)。其中，C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)的NMR(200MHz，CDCl3)62.05(s，3H，CH3)、3.80～3.85(m，1H，3-H)、4.62～4.70(m，2H，19-H&24-H)、4.90(s，1H，19-H)、5.28～5.39(m，1H，22-H)、5.41～5.63(m，1H，23-H)、5.82(d，1H，J＝11.4Hz，6-H)、6.44(d，1H，J＝11.4Hz，7-H)。C-24(S)羥基化合物(Ib)的NMR(200MHz，CDCl3)63.42～3.44(br，1H，24-H)、3.82～3.84(m，1H，3-H)、4.62(s，1H，19-H)、4.90(s，1H，19-H)、5.42～5.54(m，2H，22-H&23-H)、5.83(d，1H，J＝11.4Hz，6-H)、6.44(d，1H，J＝11.4Hz，7-H)。
實施例二本實施例步驟相同于實施例一，除了取1.0g Alcaligenes sp.Lipase與4g作為載體(carrier)的Eupergit C(Rohm，Germany)以固定化方式反應，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取0.6g(1.17mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。另外，以1.0mL(10.8mmol)vinylacetate作為乙酰化試劑，而以1mL hexane為溶劑。在35℃下攪拌6小時后，以HPLC分析反應結果，即含有30％C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物(Ia)、35％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與35％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例三本實施例步驟相同于實施例一，除了將有機溶劑改用為2mLdiisopropyl ether，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。另外，取2mL(21.6mmol)vinyl acetate作為乙酰化試劑，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作為反應酵素。室溫下攪拌42小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與35％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例四本實施例步驟相同于實施例一，除了直接將20mL(216mmol)vinylacetate的乙酰化試劑作為有機溶劑的外，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl，并且以非固定化方式取100mg Alcaligenes sp.Lipase為反應酵素。室溫下攪拌42小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與35％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例五本實施例步驟相同于實施例一，除了將有機溶劑改用為2mL tert-butylmethyl ether，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。另外，取2mL(21.6mmol)vinyl acetate作為乙酰化試劑，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作為反應酵素。室溫下攪拌42小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與35％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例六選擇性酵素酯化本實施例步驟相同于實施例一，除了將有機溶劑改用為15mL carbontetrachloride，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。另外，取4.4mL(47.5mmol)vinyl acetate作為乙酰化試劑，而采用非固定化100mg Alcaligenes sp.Lipase作為反應酵素。室溫下攪拌20小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與34％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例七本實施例步驟相同于實施例一，除了改用非固定化100mgPseudomonas sp.Lipase作為反應酵素，carbon tetrachloride為溶劑，且反應物的摩爾數略作調整。本實施例是取1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。另外，以2mL(21.6mmol)vinylacetate作為乙酰化試劑，而以2mL carbon tetrachloride為溶劑。室溫下攪拌42小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、與34％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例八本實施例步驟相同于實施例一，除了乙酰化試劑為10mL(0.109mol)vinyl butyrate，以87mL hexane為溶劑，且反應酵素為非固定化的500mgPseudomonas sp.Lipase。其中，本實施例使用5g(9.7mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。在35℃下攪拌50小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有類似C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)結構的54％C-24(R)butanoate化合物、與34％C-24(S)羥基化合物(Ib)。
實施例九本實施例步驟相同于實施例一，除了有機溶劑為10mL Ethylacetate(EA)，使用2mL(21.6mmol)vinyl acetate為乙酰化試劑，且以非固定化500mg Pseudomonas sp.Lipase作為反應酵素。本實施例使用5g(9.7mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。在35℃下攪拌8小時后，以HPLC分析反應結果，所獲得的粗產物含有30％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)、34％C-24(S)羥基化合物(Ib)、以及26％未參與反應的C-24(R)羥基化合物(Ia)。
實施例十本實施例步驟相同于實施例一，除了有機溶劑為10mL tert-butylmethyl ether，以10mL(108mmol)vinyl acetate為乙酰化試劑，且以非固定化500mg Pseudomonas sp.Lipase作為反應酵素。本實施例使用5g(9.7mmol)如式(Ia)的C-24(R)羥基維生素D衍生物異構物，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。在35℃下攪拌80小時后，以HPLC分析反應結果，即獲得99％C-24(R)acetoxy化合物(IIIa)。
實施例十一本實施例步驟相同于實施例一，除了以非固定化100mg Pseudomonassp.Lipase作為反應酵素。其中，本實施例的乙酰化試劑為2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有機溶劑為2mL hexane。本實施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。在室溫下攪拌48小時后，以HPLC分析反應結果，其生成物即含有54％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、與34％C-24(S)羥基化合物(IIb)。
實施例十二本實施例步驟相同于實施例一，除了以非固定化1g Pseudomonas sp.Lipase作為反應酵素，且加入過量的乙酰化試劑。其中，本實施例的乙酰化試劑為2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有機溶劑為2mL ethyl acetate。本實施例使用0.1g(0.195mmol)如式(II)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為H；R2為cyclopropyl。在室溫下攪拌80小時后，以HPLC分析反應結果，其生成物即含有56％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、與35％C-24(S)羥基化合物(IIb)。由本實施例可證實，即使維生素D衍生物于A ring上具有-OH基，仍不會發生酯化反應，所以本發明的方法只會在C-24(R)羥基位置上進行選擇性酵素酯化反應。
實施例十三本實施例步驟相同于實施例一，除了有機溶劑為2mL tert-methylbutyl ether，使用2mL(21.6mmol)vinyl acetate為乙酰化試劑，且以非固定化100mg Pseudomonas sp.Lipase作為反應酵素。本實施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝56∶36)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。在35℃下攪拌48小時后，以HPLC分析反應結果顯示，C-24(R)羥基化合物幾乎已轉換為C-24(R)acetoxy化合物(IVa)，而剩余未經酯化的C-24(S)羥基化合物(IIb)其diastereomeric excess值[(S-R/S+R)×100％，在此S為C-24(S)羥基化合物(IIb)，R為C-24(R)羥基化合物(IIa)]大于80％以上。最后，將生成物進行管柱層析，利用silica gel為層析管柱，且沖提液為含有6.0％EA的hexane溶液，經分段收集及濃縮后獲得0.54g C-24(R)acetoxy化合物(IVa)與0.23g C-24(S)羥基化合物(IIb)。
實施例十四本實施例步驟相同于實施例一，除了以非固定化100mg Pseudomonassp.Lipase作為反應酵素。其中，本實施例的乙酰化試劑為2mL(21.6mmol)vinyl acetate，且有機溶劑為2mL hexane。本實施例使用1g(1.95mmol)如式(II)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R∶S＝55∶32)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為isopropyl。在室溫下攪拌48小時后，以HPLC分析反應結果，其生成物即含有52％C-24(R)acetoxy化合物(IVa)、與30％C-24(S)羥基化合物(IIb)。
B.選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)本發明在進行選擇性酵素溶劑分解的前，可由C-24-羥基維生素D衍生物異構物的混合物先進行傳統的酯化反應后，而得到C-24acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物。或者，直接取C-24acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物進行選擇性酵素溶劑分解。其反應步驟可如反應路徑2所示。其中，式(I)的化合物經由一傳統的酯化反應，而生成式(III)的化合物，且其酯化試劑可為公知的任一種酯化試劑。一具體例中，本發明采用aceticanhydride作為酯化試劑，但不限于此。相同地，式(II)的化合物系經由一傳統的酯化反應，而生成式(IV)的化合物。
反應路徑2選擇性酵素溶劑分解 實施例十五首先，提供1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl，且此混合物R∶S異構物比為56∶36。將上述1g異構物的混合物溶入8mL pyridine中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)，且于室溫下攪拌24小時。反應后所得的混合物以10mL hexane進行萃取，取得有機相溶液，再將溶劑揮發即獲得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物進行選擇性酵素solvolysis反應。將100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物(R∶S＝56∶36)、0.2mL Ethanol、2mL hexane、以及500mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合攪拌，并于35℃下反應180小時。反應所得的生成物經由HPLC分析的結果，其含有50％C-24(R)羥基化合物(Ia)與34％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
實施例十六將100mg(0.23mmol)如式(III)的C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物(R∶S＝56∶36)、5mL水、1.5mL hexane、以及250mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合攪拌，并于室溫下反應500小時，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。反應所得的生成物經由HPLC分析的結果，其含有50％C-24(R)羥基化合物(Ia)與25％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
實施例十七首先，提供1g(1.95mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl，且此混合物R∶S異構物比為56∶36。保持一低于20℃的環境下，將上述1g異構物的混合物溶入10mL pyridine與0.05g DMAP(0.39mmol，4-dimethylaminopyridine)中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)進行反應。反應后所得的混合物以10mL hexane進行萃取，取得有機相溶液，再將溶劑揮發即獲得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物進行選擇性酵素solvolysis反應。將100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物(R∶S＝56∶36)、1.2mL磷酸鉀緩沖溶液(pH＝7.0)、2mL acetone或2mL THF、以及200mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合攪拌，并于室溫下反應78小時。反應所得的生成物經由HPLC分析的結果，其含有56％C-24(R)羥基化合物(Ia)與約35％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
實施例十八首先，提供1g(1.mmol)如式(I)的C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為isopropyl，且此混合物R∶S異構物比為54∶32。將上述1g異構物的混合物溶入8mL pyridine中，再加入0.4mL acetic anhydride(4.2mmol)，且于室溫下攪拌24小時。反應后所得的混合物以10mL hexane進行萃取，取得有機相溶液，再將溶劑揮發即獲得如式(III)的0.8g C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物。
取上述如式(III)的C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物進行選擇性酵素solvolysis反應。將100mg(0.23mmol)C-24(R，S)acetoxy維生素D衍生物異構物(R∶S＝56∶36)1、0.2mL Ethanol、2mL hexane、以及500mg非固定化的Pseudomonas sp.Lipase混合攪拌，并于35℃下反應180小時。反應所得的生成物經由HPLC分析的結果，其含有約50％C-24(R)羥基化合物(Ia)與約34％C-24(S)acetoxy化合物(IIIb)。
C.異構化反應(Epimerization)C-24(R，S)羥基的維生素D衍生物，經由本發明酵素選擇性酯化方法、或先形成酯類再進行酵素選擇性solvolysis方法后，可利用管柱層析法，成功地分離出R-form與S-form兩種異構物。其中，本發明更提供一化學合成途徑，使較不具商業價值的C-24(R)羥基異構物經由一Mitsunobu反應以及一水解或還原反應，而重新異構化生成C-24(R)羥基及C-24(S)羥基的混合物。由此，可達到回收再利用的效果，并降低成本、減少廢棄物及提高產率。本發明異構化反應系如下列反應路徑3所示。
反應路徑3
實施例十九[5E，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol的異構化反應首先，提供一如式(I a)1.10g(2.15mmol)的C-24(R)羥基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。將此化合物與1.13g(4.31mmol)triphenyl phosphine、0.41g(4.33mmol)chloroacetic acid(其溶解于10mL除水tetrahydrofuran)混合后，再將所得的混合物加入一含有0.87g(4.30mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，將反應物冷卻至-10℃，攪拌1小時。反應結束后，每次以20mL hexane萃取三次后，將有機相溶液以減壓濃縮方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯類化合物的粗產物。
接著，將上述產物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g碳酸鉀的溶液中，進行水解反應。所獲得的混合物在室溫下攪拌1小時，即以減壓濃縮方式揮發有機溶劑，再以ethyl acetate(5ml)及水(5ml)進行萃取、分層后，有機層進行減壓濃縮后，即獲得1.0g內含約71％如式(I)的C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl)，且此混合物d.e.值約為-1.41％。
實施例二十首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羥基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。將此化合物與1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.60g(3.92mmol)o-Anisic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再將所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodiearboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，將反應物冷卻至-10℃，攪拌1小時。反應結束后，每次以20mLhexane萃取三次后，將有機相溶液以減壓濃縮方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯類化合物的粗產物。
接著，將上述產物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g氫氧化鉀的溶液中，進行水解反應。所獲得的混合物在室溫下攪拌1小時，即以減壓濃縮方式揮發有機溶劑，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)進行萃取、分層后，有機層進行減壓濃縮后，即獲得1.0g內含約70％如式(I)的C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl)，且此混合物d.e.值約為-26％。
實施例二十一首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羥基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。將此化合物與1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.48g(3.90mmol)benzoic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再將所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，將反應物冷卻至-10℃，攪拌1小時。反應結束后，每次以20mLhexane萃取三次后，將有機相溶液以減壓濃縮方式取得1.35g含有如式(III)的C-24(R，S)酯類化合物的粗產物。
接著，將上述產物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、2mL水以及0.2g氫氧化鉀的溶液中。所獲得的混合物在室溫下攪拌1小時，即以減壓濃縮方式揮發有機溶劑，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)進行萃取、分層后，有機層進行減壓濃縮后，即獲得1.1g內含約87.6％如式(I)的C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl)，且此混合物d.e.值約為-24.9％。
實施例二十二首先，提供一如式(Ia)1.0g(1.95mmol)的C-24(R)羥基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。將此化合物與1.03g(3.92mmol)triphenyl phosphine、0.65g(3.90mmol)3-nitrobenoic acid(其溶解于5mL除水tetrahydrofuran)混合后，再將所得的混合物加入一含有0.79g(3.92mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，將反應物冷卻至-10℃，攪拌1小時。反應結束后，每次以20mL hexane萃取三次后，將有機相溶液以減壓濃縮方式取得1.5g含有如式(III)的C-24(R，S)酯類化合物的粗產物。
接著，將上述產物溶解于5mL除水tetrahydrofuran中，并加入0.5mLLiAlH4(濃度為1M且溶解于HF中)，在室溫下攪拌1小時，以進行還原反應。然后，再加入10mL的5％KOH溶液，即結束反應。取反應后的混合物每次以20mL hexane進行萃取(3次)，再收集萃取后的有機溶液，以減壓濃縮方式揮發有機溶劑，即獲得0.8g內含約99％如式(I)的C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl)，且此混合物d.e.值約為-16.77％。
實施例二十三首先，提供一如式(II a)1.10g(2.15mmol)的C-24(R)羥基化合物(d.e.值＞92％)，其中R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl。將此化合物與1.13g(4.3lmmol)triphenyl phosphine、0.41g(4.33mmol)chloroacetic acid(其溶解于10mL除水tetrahydrofuran)混合后，再將所得的混合物加入一含有0.87g(4.30mmol)diisopropyl azodicarboxylate的3mL除水tetrahydrofuran溶液中。然后，將反應物冷卻至0℃，攪拌1小時。反應結束后，每次以20mL hexane萃取三次后，將有機相溶液以減壓濃縮方式取得1.5g含有如式(IV)的C-24(R，S)酯類化合物的粗產物。
接著，將上述產物溶解于5mL ethyl acetate、10mL methanol、以及2mL的水中，并加入0.2g碳酸鉀，在室溫下攪拌1小時，以進行水解反應，即以減壓濃縮方式揮發有機溶劑，再以Ethyl acetate(5ml)及水(5ml)進行萃取、分層后，有機層進行減壓濃縮后，即獲得0.85g內含約65％如式(II)的C-24(R，S)羥基維生素D衍生物異構物的混合物(R1為tert-butyldimethylsilyl；R2為cyclopropyl)，且此混合物d.e.值約為-1.0％。
實施例二十四至四十一實施例二十四至四十一的反應步驟是相同于實施例十九的方法。其中，各實施例的反應條件與結果如表1所示。
表1


注1.化合物Ia其D.E.值(diastereomeric excess)為92％2.化合物IIa其D.E.值為92％3.THF為tetrahyrofuran，Tol為toluene，DMF為N，N-dimethylformanamide4.D.E(％)[(Ia-Ib)/(Ia+Ib)]×100％5.D.E(％)[(IIa-IIb)/(IIa+IIb)]×100％異構化反應(Epimerization)于每一實施例中所提及的維生素D衍生物，其C-24位置R-form與S-form的比值，皆為其C-24(R，S)酯類的維生素D衍生物進行水解或還原后，而形成C-24(R，S)羥基維生素D衍生物，再經由HPLC分析所得到的結果。抑或，直接以HPLC來分析C-24(R，S)羥基維生素D衍生物的R-form與S-form的比值。
上述實施例僅為了方便說明而舉例而已，本發明所主張的權利范圍自應以申請專利范圍所述為準，而非僅限于上述實施例。
權利要求
1.一種用于選擇性酵素酯化一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物的方法，其包括下列步驟(a)提供一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物，其中該異構物的混合物選自包括下列式(I)或式(II)的化合物 其中，R1為氫或是羥基保護基；R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、或C6-C12芳基；(b)將該C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物與一酯化試劑溶于一有機溶劑中或直接溶于該酯化試劑中，以得到一混合物；以及(c)將一酵素加入于該混合物中，進行選擇性酯化反應，以得到一C-24羥基維生素D衍生物的酯化異構物；其中，該有機溶劑為直鏈或支鏈型碳數12以內的烷類、烷基酸烷基酯類、二烷基醚類、或其組合；且該酯化試劑為酰鹵素類、酸酐類、具有C2至C6低碳烷羧酸的乙烯酯類、或其組合。
2.如權利要求1的方法，其中該酵素為產堿菌屬脂肪酶、或假單胞菌屬脂肪酶。
3.如權利要求1的方法，其中該C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物為[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol、或[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
4.如權利要求3的方法，其中該C-24羥基維生素D衍生物的異構物可被選擇性酯化者為[5E，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol；或[5Z，7E，22E，24(R)]-24-環丙基-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-24-ol。
5.如權利要求1的方法，其中該酯化試劑為酰氯、醋酸酐、醋酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、或其組合。
6.如權利要求1的方法，其中還包括一步驟(d)，利用一管柱層析法，以分離一經由酵素酯化C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物與該未經酵素酯化的C-24羥基維生素D衍生物異構物。
7.如權利要求6的方法，其中還包括一步驟(e)，將由該管柱層析法分離所得的該C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物進行水解反應，以得到至少一C-24羥基維生素D衍生物的表異構物。
8.如權利要求7的方法，其中還包括下列步驟(f)在一酯化試劑、一有機酸與一非質子性溶劑的存在下，于-30℃至80℃的溫度內，將該至少一C-24羥基維生素D衍生物的表異構物進行一異構化反應，以得到一C-24-酯類維生素D衍生物異構物的混合物；以及(g)將該C-24-酯類維生素D衍生物異構物的混合物進行水解反應或是還原反應，以重新得到該C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物。
9.如權利要求8的方法，其中該酯化試劑包含(i)一膦，其具有下列的化學式(R)3-P其中，R為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基；以及(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化學式 其中，R9與R10獨立地為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基。
10.一種用于選擇性酵素溶劑分解一C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物的方法，其包括下列步驟(a)提供一C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物，其中該C-24-acetoxy異構物的混合物選自包括下列式(III)或式(IV)的化合物 其中，R1為氫或是羥基保護基；R2為C1-C6烷基、C3-C6環烷基、或C6-C12芳基；(b)將C-24-acetoxy異構物的混合物加入一含有一酵素、一緩沖劑與一溶劑的混合液中，進行選擇性酵素溶劑分解，以得到一溶劑分解后的C-24羥基維生素D衍生物的異構物與一未經酵素溶劑分解的C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物；以及(c)分離該C-24羥基維生素D衍生物異構物與該C-24-acetoxy維生素D衍生物的酯化異構物；其中，該酵素為產堿菌屬脂肪酶、或假單胞菌屬脂肪酶；且該緩沖劑為水、烷醇類、弱酸鹽水溶液或其組合。
11.如權利要求10的方法，其中該C-24-acetoxy維生素D衍生物異構物的混合物為[5E，7E，22E，24(R，S)]-24-acetoxy-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯；或[5Z，7E，22E，24(R，S)]-24-acetoxy-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
12.如權利要求10的方法，其中該C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物可被選擇性酵素溶劑分解者為[5E，7E，22E，24(R)]-24-actoxy-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯；或[5Z，7E，22E，24(R)]-24-acetoxy-24-環丙基-3β-(第三丁基二甲基硅氧基)-9，10-secochola-5，7，10(19)，22-四烯。
13.如權利要求10的方法，其中還包括一步驟(d1)，將該未經酵素溶劑分解的C-24-acetoxy維生素D衍生物的異構物進行一水解反應，以得到至少一C-24羥基維生素D衍生物的表異構物。
14.如權利要求10的方法，其中還包括一步驟(d2)，在一酯化試劑、一有機酸與一非質子性溶劑的存在下，于-30℃至80℃的溫度內，將該溶劑分解后的C-24羥基維生素D衍生物異構物進行一異構化反應，以得到一C-24-酯類維生素D衍生物異構物的混合物；以及(e)，將該異構物的混合物進行水解或還原反應，以重新得到該C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物。
15.如權利要求14的方法，其中該酯化試劑包含(i)一膦，其具有下列的化學式(R)3-P其中，R為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基；以及(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化學式 其中，R9與R10獨立地為C1-C4烷基、C3-C6環烷基、或C6-C12芳基。
16.如權利要求10的方法，其中該步驟(c)的分離由一管柱層析法進行。
17.一種異構化一立體異構物的方法，包括的步驟有(a)提供一C-24羥基維生素D衍生物異構物，其中該異構物為下列式(Ia)或式(IIa) 其中，R1為氫或是羥基保護基，與R2為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基；(b)在一酯化試劑、一有機酸與一非質子性溶劑的存在下，于-30℃至80℃的溫度內，將該立體異構物進行一異構化反應，以得到一C-24-酯類維生素D衍生物異構化的混合物；以及(c)將該C-24-酯類維生素D衍生物異構化的混合物進行水解反應或是還原反應，以得到一C-24羥基維生素D衍生物異構物的混合物。
18.如權利要求17的方法，其中該酯化試劑包含(i)一膦，其具有下列的化學式(R11)3-P其中，R11為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基；以及(ii)一偶氮化合物，其具有下列的化學式 其中，R9與R10獨立地為C1-C4烷基、C3-C6環烷基，或C6-C12芳基。
全文摘要
一含有C－24羥基支鍵的維生素D衍生物，由于C－24位置為一對掌中心(chiral center)的碳原子，所以其維生素D衍生物含有C－24R羥基與C－24S羥基的兩種異構物形式；其中，通常以C－24S羥基的結構具有較佳的生理活性。因此，本發明有關一種選擇性酵素酯化或選擇性酵素溶劑分解(solvolysis)一C－24羥基維生素D衍生物異構物的混合物方法，以分離出兩種C－24R羥基與C－24S羥基的異構物。此外，本發明方法不僅易于純化C－24R羥基與C－24S羥基的異構物，且更提供一種異構化反應，使C－24R羥基維生素D衍生物經由此方法可達到回收再利用的特色。
文檔編號C12P41/00GK1876828SQ20051007636
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月10日 優先權日2005年6月10日
發明者黃志強, 魏慶鵬 申請人:臺耀化學股份有限公司