用于生物材料提取的方法、芯片、設備以及系統的制作方法

專利名稱：用于生物材料提取的方法、芯片、設備以及系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于從生物細胞中提取生物材料的方法、芯片、設備和系統。本發明包括將生物微粒在樣品室中暴露到交替電場下，并且還可以包括在提取后對生物材料進行后續的分析。
背景技術：
針對生物恐怖的威脅，進行生物戰劑的快速和精確檢測變得越來越重要。炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)細菌是形成蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)群內生孢子的成員。炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)是高度致命的生物戰劑，其容易獲得、儲藏并作為生物武器進行應用。為了對炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)進行可靠的檢測，必須要對DNA進行分析，因為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)群成員的表型差異在某些情況下小于1％。
作為例子，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)與炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)的區別僅僅在于因為后者含有兩個另外的被稱作pXO1和pXO2的質粒。缺少pXO1和pXO2的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)無毒性株與蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)實質上是難以區分的。理論上，將pXO1和pXO2質粒轉入蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)群的膜內會將這些細菌變成有功能性的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)。由于這個原因，如果所檢測的生物是炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)的話，通過DNA雜交、測序或者PCR進行DNA分析以及對質粒pXO1和pXO2的辨別是進行確定的唯一可行的方法。
由于它們對惡劣環境的抵抗能力，從內生孢子中釋放和提取DNA是困難的任務。在檢測炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)中所使用的通常程序是在培養基質中使孢子發育，收集細菌，以及接著從無性細菌中提取DNA，程序會耗費幾個小時最多達到1天的時間(Levi等人2003)。其它的方法包括精巧的技術例如機械破碎、凍/融循環或者化學處理(Johns等人1994)。然而，芽孢的外殼和皮層是為長期的休眠所發育的生化結構，其能夠持續數千年。著名的例子是在琥珀中所包含蜜蜂的腸道中所發現的內生孢子所復蘇的細菌(Cano和Borucki1995)。而且，機械破碎(使用珠子進行打碎(bead beating))會導致所釋放DNA的質量差(Levi等人2003)。使用目前的技術通過結合物理、機械和化學處理有可能在5～10分鐘內從內生孢子中釋放DNA，但是當該應用是檢測由浮質所攜帶的生物恐怖襲擊時，即使是5分鐘對于DNA提取也被認為是時間長的。使用精巧的多步驟程序在可能的炭疽襲擊的緊迫情況下不是最佳的。由于這個原因，需要一種技術其能夠快速(幾秒鐘內)無干涉的單一步驟從革蘭氏陽性菌的內生孢子提取DNA。
芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的革蘭氏陽性菌能夠在對數生長期的末期能夠經歷被稱作形成孢子的過程。在形成孢子的過程中，細菌形成了有皺紋的孢子，其能夠忍受惡劣的環境。孢子是休眠的結構，其只有幾種代謝活性的酶，當將孢子暴露到營養物時這些酶會誘導發育。
如表1所示，孢子在生化組成上非常不同。
表I.在芽孢桿菌屬(Bacillus)種類的孢子和無性細胞之間所存在的生化組成上的區別。

生化結構和休眠的生理狀態使內生孢子成為對機械、化學和熱極端抵抗的整體，這對快速制備樣品和生物戰劑的DNA提取以快速鑒定提出了特別的問題。這些孢子可以抵抗例如長時間的煮沸而不破裂。對于孢子的環境歸宿(environmental fate)知道得并不詳細。孢子可以“不確定地”在干燥和受保護的環境中存活。在南非Kruger國家公園中的挖掘顯示了壽命為200年以上的炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)孢子(通過14C方法確定日期)，其仍能夠在實驗室中發育。
檢測細菌和病毒的最靈敏的方法依賴獲得得到生物細胞內組分(例如遺傳材料)的途徑。
US 2003/0,146,100公開了通過雙向電泳從血中分離細胞，接著對所分離的細胞在流動室的帶有電極陣列的芯片上進行電裂解以及消化。在10KHz的正弦電場中進行電泳，裂解通過一系列400個500V和持續時間50μs的脈沖或者40個200V和持續時間10μs的脈沖(矩形波)進行的。
US 2002/0115201公開了使用2.45～310GHz范圍內的微波裂解細胞，進而從液體懸浮液的細胞中釋放DNA。其還公開了帶有平行的平面外電極的室用于施加微波，該室具有流體通道以提供室內的樣品。
US 4,970,154公開了一種使用脈沖射頻將外源基因注入細胞內的方法。其還描述了使用室內電極之間的脈沖射頻震蕩電場對懸浮在室中溶液內的細胞進行電穿孔和融合。頻率在60Hz～10MHz之間變化，電場強度為100-400V/cm。

發明內容
本發明的目的涉及提供用于提取的方法、芯片、設備以及系統，即得到生物細胞的生物材料的途徑。
本發明的另一個目的涉及提供用于以高釋放率提取生物細胞的生物材料的方法、芯片、設備以及系統，即從高百分比的生物細胞中提取或者釋放出生物材料。
本發明的另一個目的涉及提供用于從生物細胞中提取生物材料而不損傷生物材料的方法、芯片、設備以及系統。
本發明的另一個目的涉及提供能夠容易對所提取的生物材料進行進一步分析的方法、芯片、設備以及系統。
本發明的再一個目的涉及提供在相同的結構中(優選相同的室中)進行生物材料的提取以及對所提取生物材料進行后續分析的方法、芯片、設備以及系統。
通過閱讀說明書和實施例，本發明的其它目的將變得清楚。
本發明的一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，其中第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料。
在本發明的優選實施方式中，該方法還包括對部分暴露的液體樣品進行分析的步驟(d)，所述部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。該分析可以例如包括遺傳分析或者蛋白質分析。
本發明的另一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的芯片，該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設備的流體連接；以及-第一電極和第二電極，其被安置在樣品室相對的兩側。
本發明的另一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的設備，該設備包括-芯片位點，芯片位于此處以便能夠功能上與該設備相連；-設備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設備實現進行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-檢測芯片是否與該設備功能上相連；
-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進行分析，其中該部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。
本發明的另一個方面涉及用于從生物細胞中提取生物材料的系統，其中該系統包括與這里所述設備功能上相連的所述芯片。


通過參考附圖將對本發明的下面一些實施方式進行描述，其中圖1表示暴露到交替電場的持續時間對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實時PCR和熒光進行檢測)，圖2表示長時間暴露到交替電場對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實時PCR和熒光進行檢測)，圖3表示更長的暴露時間對目標DNA的質量也沒有負面影響，圖4表示交替電場的頻率對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實時PCR和熒光進行檢測)，圖5表示交替電場的強度對DNA/RNA釋放百分率的影響(通過實時PCR和熒光進行檢測)，表6表示芯片兩個實施方式的截面。
發明的詳細描述本發明的一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，其中第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料。
在本發明的優選實施方式中，該方法還包括對部分暴露的液體樣品進行分析的步驟(d)，所述部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。該分析可以例如包括遺傳分析或者蛋白質分析。
遺傳分析可以例如包括諸如使用限制性酶的孵化處理、諸如PCR的核酸擴增反應、電泳以及檢測諸如例如熒光檢測或者電化學檢測。PCR處理以及檢測可以根據例如審理中的PCT申請“用于增強嵌套式PCR的方法、試劑盒和系統(Method，kit and system for enhanced nested PCR)”(其申請號為No.YYYYYYY)的方法和使用試劑盒來進行，這里將其引入作為參考。
在發明的優選實施方式中，對其進行進一步遺傳分析的部分所暴露的液體樣品，包括樣品室中液體樣品的至少20％，例如樣品室中液體樣品的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中液體樣品的至少幾乎100％。
根據本發明，術語“提取”涉及釋放一種或者多種生物細胞的生物材料，也就是說例如使可以得到的生物材料進行液體樣品的進一步分析。術語“提取”還涉及例如將生物細胞的細胞壁或者細胞載體充分地打開和/或破碎以使生物材料溢出進入周圍液體。在提取生物材料后，其可能仍位于生物細胞的附近或者可以被轉運到其它位置例如通過電泳力。生物材料可以例如在電泳轉運后被吸附到電極上。
在本文中，術語“生物細胞”涉及包括例如微生物、病毒、真核細胞或其碎片的顆粒。
真核細胞可以為例如植物細胞、植物孢子、動物細胞例如哺乳動物細胞。所述哺乳動物細胞可以為例如人細胞諸如白細胞或者有核的紅細胞。
所述微生物可以是例如選自古微生物、真核細菌微生物或者真核微生物。
例如微生物可以選自由細菌、細菌孢子、病毒、真菌和真菌孢子所組成的組。
在本發明優選的實施方式中，生物細胞是氣生微生物。
在本發明優選的實施方式中，生物細胞是細菌孢子。
例如，細菌孢子可以由選自芽孢桿菌屬(Bacillus)和/或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的細菌形成。
在本發明優選的實施方式中，細菌孢子是由炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)所形成的孢子。生物細胞可以例如包括是由炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)所形成的細菌孢子。同時，生物細胞可以基本上由一種或者多種由炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)所形成的細菌孢子組成。
同時，生物細胞可以是無性細菌或者孢子。
從生物細胞中所提取的生物材料通常包括選自細胞器官、遺傳材料以及蛋白質所組成的組的組分。
遺傳物質可以例如包括染色體DNA和/或質粒DNA和/或任何類型的RNA。
蛋白質可以例如選自由酶、結構蛋白質、轉運蛋白質、離子通道、毒素、激素以及受體所組成的組。
優選地，生物材料包括DNA和/或RNA。
根據本發明術語“液體樣品”涉及液體物質、溶液或者懸浮液，其可以包括或者不包括一種或者多種有關的化合物。液體樣品可以是例如生物樣品或者非生物樣品。
生物樣品可以例如為選自由皮膚拭子、腦脊液、血液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、支氣管吸出物、肺組織和尿所組成的組。
非生物樣品可以例如為一種液體懸浮液，其含有來自空氣樣品的粉末、顆粒以及來自土壤樣品和表面清掃(surface swipes)的顆粒。
可以對生物樣品或者非生物樣品進行培養。接著可以使用本發明的方法、試劑盒、芯片、設備以及系統來評估該培養是否出現例如微生物諸如炭疽芽孢桿菌(B.Anthracis)。
另外，液體樣品可以含有一種或者多種需要進行核酸擴增的試劑。
液體樣品可以含有一種或者多種從下列所組成組選擇的試劑引物、核酸、三磷酸脫氧核苷酸以及核酸聚合酶。
該液體樣品可能還含有添加劑例如2-巰基乙醇例如濃度為10mM、BSA例如濃度為1mg/ml和/或濃度為例如0.5％～6％(w/v)的去污劑。去污劑可以選自由下列所組成的組Triton X-100、Triton X-114、NP-40、吐溫-20、吐溫-80以及類似的非離子去污劑。
在本文中，術語“核酸”、“核酸序列”或者“核酸分子”應當被廣義解釋，可以例如為核糖核酸(RNA)或者脫氧核糖核酸(DNA)及其模擬物的寡聚物或者多聚物。該術語包括含有自然出現的核苷、糖和共價核苷酸間鍵合(骨架)以及功能相似的具有非自然出現的核苷、糖和共價核苷酸間鍵合(骨架)的分子或其組合。這樣的被修飾和被取代的核酸可以比原始形式要優選，因為其期望的性能諸如例如核酸目標分子的增強的親和力，以及在有核酸酶和其它酶存在的情況下的提高的穩定性，在本文中使用術語“核酸類似物”或者“核酸模擬物”來描述被修飾和被取代的核酸。核酸模擬物的優選例子是含有肽核酸(PNA-)、鎖定核酸(Locked Nucleic Acid，LNA-)、木糖-LNA-(xylo-LNA-)、硫代磷酸、2’-甲氧基、2’-甲氧乙氧基、嗎啉和氨基磷酸酯的分子或者功能相似的核酸衍生物。
術語“核酸聚合酶”涉及依賴DNA-或者RNA-的DNA聚合酶，其優選是熱穩定性的，即該酶催化與模板互補的引物延伸產物的形成，并且在對于雙鏈模板核酸的變性所必要的提高的溫度下一段時間內不會發生不可逆的變性。通常，在每條引物的3′末端開始合成并按照5′到3′的方向沿著模板鏈進行。已經從嗜熱或者極端嗜熱菌株中分離了熱穩定的聚合酶，例如Thermusflavus、T.ruber、T.thermophilus、T.aquaticus、T.lacteus、T.rubens、Thermococcus litoralis、Pyrococcus furiosus、Bacillus stearothermophilus和Methanothermus fervidus。但是盡管如此，不是熱穩定的聚合酶也能夠用于核酸擴增中，只要進行補充該酶。
液體樣品還可以含有可以被5′-3′核酸外切酶降解的寡聚核酸探針，所述核酸探針的降解會導致釋放氧化還原活性組分。
氧化還原活性組分可以例如為金屬茂諸如例如二茂絡鐵。
在本發明的實施方式中，第一和第二電極被分開最多20mm的距離，優選的是最多20mm，例如最多15mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm或者最多4mm，更優選的是最多3mm，更加優選的是最多0.5mm例如最多0.3mm、0.2mm和0.1mm例如最多0.05mm。
例如第一和第二電極可以被分開0.05-20mm范圍內的距離，例如在0.05-0.1mm、0.1-0.2mm、0.2-0.3mm、0.3-0.4mm、0.4-0.5mm、0.5-1mm、1-2mm、2-5mm、5-10或者10-15mm的范圍內，例如15-20mm的范圍內。
通常第一和第二電極被分開至少0.02mm的距離，例如至少0.03mm或者0.05mm。
通常至少部分樣品室中的液體樣品被置于第一電極和第二電極之間。例如，至少液體樣品體積的40％被置于第一電極和第二電極之間，例如，至少液體樣品體積的50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％被置于第一電極和第二電極之間，例如至少液體樣品體積的100％被置于第一電極和第二電極之間。
優選的是，在步驟(c)的過程中將生物細胞安置在第一電極和第二電極之間。甚至可以至少在步驟(c)的開始并可能在步驟(c)的過程中，將生物細胞附著在第一電極或者第二電極上。
本文在“X和/或Y”中所使用術語“和/或”應當被解釋為“X”或“Y”或“X和Y”。
本發明的芯片包括帶有第一開口的樣品室。
第一開口可以用于將樣品倒入樣品室中。第一開口可以與樣品(例如周圍空氣)以流體連接。可以選擇的是，第一開口被連接到一個或者多個閥門上，這些閥門可以被打開以將樣品室與樣品流體相連。
在本發明重要的實施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)帶有第二開口。第二開口可以例如用于通過將樣品室的空氣或者樣品排出而輔助將新樣品導入樣品室中。第二開口也可以用于將第一液體試劑導入樣品室中。可以替換的是，第一液體可以通過第一開口進入樣品室。
樣品室(例如芯片的樣品室)通常是微量樣品室。在本發明的實施方式中，樣品室的體積為最多500μL，例如最多400μL、300μL、200μL、100μL、50μL、25μL、15μL、10μL、5μL、4μL、3μL或者最多2μL，例如最多1μL。例如樣品室的體積可以為最多500nL，例如最多400nL、300nL、200nL、100nL、50nL、25nL、15nL、10nL、5nL、4nL、3nL或者最多2nL，例如最多1nL。
通常，樣品室的體積為至少10nL。在本發明優選的實施方式中，樣品室的體積在1μL-50μL的范圍內，例如5μL-30μL。
在本發明的實施方式中，一對相對的壁之間的最小距離為最多20mm，例如最多15mm、10mm、8mm、6mm、4mm、3mm或者2mm，例如最多1mm。例如，一對相對的壁之間的最小距離為最多800μm，例如最多600μm、500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、50μm、25μm、15μm、10μm、5μm、4μm、3μm或者最多2μm例如最多1μm。
通常，一對相對的壁之間的最小距離為至少5μm。在本發明優選的實施方式中，一對相對的壁之間的最小距離在50μm-500μm的范圍內，例如100μm-400μm和150μm-350μm。
在本發明的一個實施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的長度在1mm～50mm的范圍內，例如在1mm-10mm、10mm-20mm、20mm-30mm、30mm-40mm或者40mm-50mm的范圍內。在優選的實施方式中，樣品室的長度在2mm-8mm、例如3mm-7mm或者4mm-6mm的范圍內。例如樣品室的長度為大約4.5mm。
在本發明的實施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的寬度在0.2mm-10mm的范圍內，例如在0.2mm-1mm、1mm-3mm、3mm-5mm、5mm-7mm或者7mm-10mm的范圍內。在優選的實施方式中，樣品室的寬度在0.2mm-2mm的范圍內，例如在0.5mm-1.5mm和0.75mm-1.25mm的范圍內。例如樣品室的寬度可以為大約1mm。
在本發明的實施方式中，樣品室(例如芯片的樣品室)的高度在50μm-2mm的范圍內，例如在100μm-1mm、200μm-900μm、300μm-800μm、500μm-700μm的范圍內。在優選的實施方式中，樣品室的高度在100μm-400μm的范圍內，例如200μm-300μm的范圍內。
在本發明的實施方式中，樣品室例如芯片的樣品室的長度度為大約4.5mm，樣品室的寬度為大約1mm，樣品室的高度為300μm。
在本發明的實施方式中，芯片還包括第一和第二電極。
第一和/或第二電極可以具有不同的外形或者尺寸。例如，第一和/或第二電極可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀、棒狀或其任意組合中所選擇的實質的形狀。
在本發明優選的實施方式中，第一電極和第二電極可以例如為薄片電極。
在本發明優選的實施方式中，第一電極和第二電極相對。例如它們可以被安置在樣品室的對邊上。
第一電極和/或第二電極可以例如被安置在樣品室的內部，不貼著樣品室或者附著到樣品室的一個或者多個壁上。
第一和/或第二電極可以植入樣品室的壁中。例如，第一和第二電極可以植入樣品室中的壁中。可以選擇的是，第一和/或者第二電極可以被安置在芯片的外表面中。
優選的是，第一電極和第二電極安置在樣品室相對的兩邊。
第一電極和第二電極之間的電勢差可在一個范圍內，該范圍引起相同或不同尺寸的顆粒被捕獲至一個表面或偏離某個給定的方向，這樣可以提供選擇或捕獲感興趣的粒子。
電極，如第一電極和/或第二電極可以由許多種不同的材料構成。典型地，電極是由金屬或合金構成。第一電極和第二電極可以例如包含從由下列金屬所組成的組中選擇的金屬銀、金、鉑、銅、碳、鐵、石墨、鉻、鎳、鈷、鈦、水銀或者其合金。
也可以預想到，電極可包含一種導電的液體，甚至基本上由一種導電的液體組成。導電的液體可以是例如水銀。
電極的尺寸或/和結構通常依賴于樣品室的尺寸和/或結構。電極的長度和寬度與樣品室的長度和寬度具有相同的數量級。
電極可以由小至幾個原子層的表面的導電材料構成。
在本發明的一個實施方式中，電極如第一和/或第二電極具有在0.001μm-2000μm范圍內的厚度，如0.001μm-1μm、1μm-20μm、20μm-200μm和200μm-2000μm。
在本發明的一個實施方式中，芯片的樣品室還包括一組檢測電極如兩個或者三個檢測電極，用于檢測氧化還原活性組分的出現或者缺失，該氧化還原活性組分可以是如從探針中釋放出來的。兩個檢測電極可分別作為工作電極和反電極。該組檢測電極還可以包括一個參比電極。通常，檢測電極是由金屬或合金構成。電極可以如包括從有下列所組成的組中選擇的材料碳、銀、金或鉑。檢測以后，在電極表面會有膜形成。為了允許進一步檢測所消化的探針，可以在芯片的樣品室內安置更多組檢測電極。
在本發明優選的一個實施方式中，第一電極和第二電極可以是檢測電極組。
在本發明優選的一個實施方式中，芯片還包括一種溫度敏感元件，其例如可以是溫度敏感的金屬基的電阻器(電熱調節器)，具有正溫度系數(PTC)，即隨著環境溫度的增加，電熱調節器表現出電阻增加；隨著環境溫度的降低，電熱調節器的電阻減小。
電熱調節器可以是例如從包含下列材料的組中選出的銅、鎳、鐵、鋁、鉑或其合金。
電熱調節器可以有不同的形狀或維度，例如，電熱調節器可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀的組中選擇的實質形狀。
電熱調節器可以是例如線狀的電極。
加熱電極可以有不同的形狀或者尺寸，例如，加熱電極可以具有從薄片、平板狀、圓盤狀、線狀或者棒狀的組中選擇的實質形狀。
在本發明優選的一個實施方式中，加熱電極可以是例如薄片狀電極。本發明中優選的一個實施方式中，加熱電極可以被安置成能夠從反應室的至少一邊進行加熱。
在另一個實施方式中，一個或者多個補充的加熱電極可以被安置在反應室的對邊上。
加熱電極由電導材料制成，優選為從鎳鉻合金(NiCr)、鐵鉻鋁合金(FeCrAl)、鐵鎳鉻合金(FeNiCr)或者其它加熱元素合金的組中選取的材料。
本發明優選的一個實施方式中，芯片包括一個或者多個導電接觸襯墊，該襯墊與芯片的電極電接觸。芯片可包括與芯片的第一電極電接觸的導電接觸襯墊。芯片可包括與芯片的第二電極電接觸的導電接觸襯墊。芯片可包括與加熱電極的每個末端電接觸的兩個導電接觸襯墊。芯片可包括兩個或三個導電接觸襯墊，并且與該組檢測電極的每個電極電接觸。
在圖1中，表示了兩個代表性的芯片實施方式。在圖1A)中，芯片(1)包含樣品室(2)、第一電極(3)和第二電極(4)。第一電極(3)附著到芯片的上部(5)，第二電極(4)附著到在芯片的下部(6)。第一電極和第二電極都被電絕緣層(7)覆蓋，以防止樣品室(2)中的液體成分的不必要電解。加熱電極被植入第二電極頂部的絕緣層。通過間隔部分(9)形成樣品室，間隔部分被夾在芯片(1)的第一部分(5)和第二部分(6)的中間。檢測電極和溫度敏感元件在圖1中沒有被示出。
芯片可以含有大批不同的材料。可以例如包括有機聚合物如塑料，金屬和半導體(如硅、玻璃和陶瓷)等。
關于圖1，第一部分和第二部分可能如包括諸如塑膠、半導體(如硅、玻璃和陶瓷)的材料。第一電極和第二電極可以例如含有金屬如金或銅。絕緣層可以例如是二氧化硅或聚酰亞胺的薄膜。加熱電極可以例如是NiCr電極，間隔層可以例如是聚二甲基硅氧烷(PDMS)彈性體的鑄件。
圖1B)中，第一電極和第二電極并不被包括在芯片里，但可以如包括在操作芯片的設備中。
芯片可以僅包括單一的樣品室或者它可以包括多個樣品室。
芯片通常具有在0.5mm-50mm范圍內的厚度，優選在2mm-8mm的范圍內。
芯片通常具有在10mm-500mm范圍內的長度或者直徑，優選在40mm-200mm的范圍內。
芯片通常具有在5mm-200mm范圍內的寬度，優選在20mm-100mm的范圍內。
在步驟c)中，液體樣品被暴露到交替電場下，其由第一電極和第二電極提供。重要的是交替電場具有充分的強度并被施加充分的持續時間以從生物細胞中提取生物材料。
根據本發明，術語“交替電場”涉及隨時間變化的電場。交替電場可以例如為通過在正/負以及負/正之間周期性地改變兩個電極極性而出現的電場，例如通過將交流電源連接到電極上。交替電場可以例如包括或者是交流電場。交替電場可以例如包括一個或者多個直流脈沖。
重要的是交替電場具有充分的強度并被施加充分的持續時間以提取生物材料。同時重要的是交替電場還具有充分的頻率以提取生物材料。
本發明優選的實施方式中，交替電場的頻率為至少5kHz，優選為至少20kHz，更優選為至少50kHz。
在本發明優選的實施方式中，交替電場的頻率為至少100kHz，例如至少250kHz，更優選為至少500kHz。
例如交替電場的頻率可以為至少5kHz，例如至少10kHz、20kHz、50kHz、100kHz、200kHz、300kHz或者400kHz，例如至少500kHz。也能夠預想到更高的頻率例如1000kHz、2000kHz或者5000kHz。
交替電場的頻率優選為最多750kHz，例如最多500kHz。
這樣，交替電場的頻率可以例如在5-750kHz的范圍內，例如在5-10kHz、10-20kHz、20-50kHz、50-100kHz、100-200kHz、200-300kHz、300-400kHz、400-500kHz的范圍內，例如在500-750kHz的范圍內。
在優選的實施方式中，通過調節兩個電極的極性來提供交替電場。
交替電場可以具有從由下列所組成的組中選擇的實質形式矩形、正弦、鋸齒、不對稱三角形、對稱三角形或者其任何組合。
同時，頻域中的交替電場可以至少含有第一頻率分量和第二頻率分量。
交替電場的強度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差通常為最多30V，例如最多25V、20V、15V、10V、8V、6V、5V、4V、3V或2V例如最多1V。
交替電場的強度即第一電極和第二電極之間的最大電勢差可以例如在1-100V的范圍內，例如在1-2V、2-3V、3-4V、4-5V、5-6V、6-8V、8-10V、10-15V、15-20V或者20-30V的范圍內，例如在30-100V的范圍內。優選的是，第一電極和第二電極之間的最大電勢差在5-50V的范圍內，例如10-25V。
對生物材料提取產量的可用性測試是DNA/RNA釋放百分率。“DNA/RNA釋放百分率”是樣品室中由于在步驟c)中暴露到交替電場中而釋放其染色體DNA和/或染色體RNA的生物細胞的百分率。DNA/RNA釋放百分率是根據實施例5中所描述的標準化的方法確定的。
在樣品室或者帶有樣品室的芯片中的生物細胞的提取百分率或者DNA/RNA釋放百分率強烈依賴于第一電極和第二電極的設計和之間的距離、樣品室的結構和材料以及施加到第一電極和第二電極上的電勢。
在本發明高度優選的實施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進而第一電極和第二電極之間的交替電場進行調節以得到至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優選為至少50％，更優選為至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如大約100％。
在本發明的另一個優選實施方式中，對第一電極的第一電勢、第二電極的第二電勢以及進而第一電極和第二電極之間的交替電場進行調節以得到樣品室中細菌孢子的至少30％的DNA/RNA釋放百分率，例如樣品室中細菌孢子的至少40％的DNA/RNA釋放百分率，優選為至少50％，更優選為樣品室中細菌孢子的至少60％，例如至少70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、99.5％或者99.9％，例如樣品室中細菌孢子的大約100％。
在本發明的實施方式中，將液體樣品暴露到交替電場中的持續時間最多為3600秒，例如最多3000秒、2000秒、1000秒、500秒、250秒、100秒、50秒、40秒、30秒、20秒、10秒、5秒、4秒或者3秒，例如最多1秒。
例如，將液體樣品暴露到交替電場中的持續時間為0.01-3600秒的范圍內，例如在0.1-1秒、1-5秒、5-10秒、10-25秒、25-50秒、50-100秒、100-250秒、250-500秒、500-1000秒或者1000-2000秒的范圍內，例如在2000-3600秒的范圍內。在本發明的優選實施方式中，將液體樣品暴露到交替電場中的持續時間為5-100秒的范圍內，例如6-90秒、7-80秒、8-70秒、9-60秒和10-50秒的范圍內。
在本發明優選的實施方式中，液體樣品被暴露到交替電場中最多250秒，優選為最多100秒，例如最多30秒。
本發明的另一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的芯片，其中該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設備的流體連接；-第一電極和第二電極，其被安置為在樣品室相對的兩側。
在本發明優選的實施方式中，芯片的樣品室還包括含有生物細胞的液體樣品。
該芯片還包括通過第一電極和第二電極提供的在第一電極和第二電極之間的交替電場，所述交替電場具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料。
在本發明的實施方式中，芯片的第一電極和第二電極被安置在樣品室的第一開口和第二開口之間。
生物細胞優選位于芯片的第一電極和第二電極之間。
需要注意的是在本發明一個方面中所描述的實施方式和特征也可以用于本發明的其他方面。
本發明的另一個方面涉及一種用于從生物細胞中提取生物材料的設備，該設備包括-芯片位點，芯片位于此處以便能夠功能上與該設備相連；-設備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設備實現進行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-檢測芯片是否與該設備功能上相連；-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進行分析，其中該部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。
在本發明中，術語“功能上相連”的意思是指該芯片與該設備相連接，因此該設備可以進行一個或多個影響該芯片的行為。
在本發明的一個實施方式中，當該設備能影響樣品室中成分的電場時，該芯片是與該設備功能上相連。
在本發明的一個實施方式中，當該設備能控制該芯片至少一個電極的電勢時，該芯片是與該設備功能上相連。例如，當該設備能控制第一電極和/或第二電極的電勢時，該芯片是與該設備功能上相連。
功能上相連還可以包括該芯片的樣品室用流體控制裝置以流體相連。
在本發明的一個實施方式中，該設備包括一組收集電極，并且當電極與該組收集電極之間的電場功能上相連時，會輔助在樣品室中收集氣體樣品的生物細胞。在這個實施方式中，芯片不必包括該組收集電極。
該設備也可以包括一個接受和/或儲藏第一液體試劑的第一試劑室。通常，第一試劑室有至少一個開口，當芯片與設備功能性相連時，該開口與樣品室流體連接。可以替換的是，第一試劑室的至少一個開口與樣品室是流體連接，如通過使用控制流體的裝置。在貯存期間，可以通過一個可移動的障礙物來關閉第一試劑室。當使用該設備時，所述的障礙物被可逆或者不可逆地移開。
該設備還可以包括一個用于提供能量的電能供應器，如產生流動的裝置、和/或給可編程的單元、第一電極和第二電極。
在本發明的實施方式中，芯片是通過芯片位點與該設備功能上相連的。芯片位點可以例如包括一個塑料界面，該塑料界面既可以當作連接材料，也可以當作襯墊，該襯墊保證芯片口和裝置口緊密連接，以消除漏氣和漏液現象。芯片位點可以如包括表面和/或接受芯片的支架。通常，芯片位點包括至少一個導電的接觸襯墊。優選的是，芯片位點包括至少一個導電的接觸襯墊，該接觸襯墊提供與芯片第一電極的電接觸，和提供與第二電極的電接觸。
可編程的單元包含指令，優選計算機可以讀取的，如可適合利于控制、監視的軟件，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調控設備的軟件。
可編程單元優選包括至少一個在所連接的存儲設備上儲存了一個或多個計算機程序的計算機，該計算機可適合用于控制該設備。本發明中的可編程單元可以是從以下非詳盡組中選擇通用計算機、個人計算機(PC)、可編程的邏輯控制單元(PLC)、軟程序的邏輯控制單元(soft-PLC)、硬程序邏輯控制單元(hard-PLC)、工業個人計算機或一個專用的微處理器。
本發明也涉及計算機程序產品，該產品適合使具有至少一個在其連接的存儲設備上儲存了計算機程序的計算機的計算機系統能控制、監視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調控該設備。本發明還涉及一種計算機可讀取的存儲了一套工藝路線的媒介，該套工藝路線適應性使計算機系統能控制、監視，和/或在操作之前、在操作中和/或操作后調控該設備，該計算機系統包括至少一個在其連接的存儲設備上儲存了計算機程序的計算機。
在操作之前、在操作中和/或在操作后，用于控制、監控和/或調控該設備的程序單元，優選能適應在惡劣的條件下操作，如北方氣候、熱帶氣候和戰斗環境，特別是，遭受原子、生物和/或化學戰(ABC-戰爭)攻擊的戰斗地區。優選的是，可編程的單元應遵照該單元的相關軍事說明書。
在本發明的一個實施例中，可編程的單元包括軟件，如果芯片與設備功能上相連的話，該軟件還可實現設備檢查。
可編程的單元包括能夠進一步使該設備完成一種或者更多種行為的軟件，例如從由下列所組成的組中選擇的2或3個行為-提供樣品室中的液體樣品；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料；-對所暴露的液體樣品的生物材料進行分析。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操作用于提供氣體樣品的流動產生裝置，設備提供樣品室中的氣體樣品。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即設備對第一電極施加第一電勢，對第二電極施加第二電勢。
可編程的單元包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過調節至少兩個電極的電勢(例如這里所述的第一電極和第二電極或者交替電場專用的其他電極組)，設備將反應混合物暴露到所述樣品室的交替電場中。
可編程的單元包括包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操縱這里所述的加熱電極，設備進行目標核酸序列的核酸擴增。
可編程的單元包括包括軟件，其能夠例如具有這樣的作用，即通過操縱涉及差值脈沖伏安法的檢測電極，設備檢測是否出現了所擴增的目標核酸序列和/或檢測來自目標核酸序列擴增的產物。
在本發明優選的實施方式中，該設備還包括設備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的第一和電極之間施加交替電場。
裝置另外可測量參比信號，即來自于包括沒有生物細胞的樣品或包括確定量的給定生物細胞的樣品的信號。該參比信號可以例如被從距樣品室較遠的另一個室中得到，例如位于芯片另一個位置的室或者位于另一個芯片的室。
裝置還可以包括一個內部的能量供應。
內部的能量供應可以例如包括電池。在PCR反應期間使用的能量，可以根據加熱一定體積的水所需熱量來估計，該體積的水應等同于在PCR循環中最小和最大溫度之間的流體樣品的量。溫度的差別大約為50K，因此對于30μl的樣品，每個循環的轉移的熱量大約為6焦耳。例如運行60個循環，一個PCR反應的總能量消耗達到60×6＝360焦耳。使用與商業熱循環器(即每秒2℃)相差不大的等變率(ramping time)，能量需要量為360×2/50＝14.4W。
電池電壓被認為是電池的定額電壓，如每個鎳-鉻(NiCr)和鎳-金屬氫(NiMH)電池電壓為1.2伏，每個鋰離子(Li離子)電池電壓為3.6伏。電池的蓄電量通常以毫安-小時(mAh)為單位，并且稱為電池的C-定額(C-rating)。例如，一個具有C-定額1200mA-小時的電池的負載電流1C，就是指1200毫安。當電池電量耗盡至負載電流低于0.1C時(Linden D.1984，電池和燃料電池手冊，紐約McGraw-Hill)，一個電池可以看作是理想的(即保持固定的電容量)。因而，當釋放出14.4W的能量如用一個電池釋放10.8V時，該電池的C-定額應該在14.4/(10.8*0.1)＝13300mAh范圍，以避免劇烈減小電池容量的峰值電量消耗。
為了使能量消耗和電量釋放，以及進一步確保真正的可攜帶，可充電池是優選的。在本發明的優選實施方式中，可充電池可以從由下列所組成的組中選擇鎳金屬氫(NiMH)類電池和鋰離子(Li離子)類電池。
同時，內部的電量供應可以包括發電機例如可攜帶的發電機。可攜帶的發電機可以用作外部的能量供應。可攜帶的發電機可以是日光模塊、電池充電器(例如交流或者汽車電池充電器)、燃料燃燒發電機等進行充電或者只是由其所組成。
可以替換的是，來自外部能量供應的電能可被提供到該設備，例如使用備用電池進行補充。
在本發明的實施方式中，設備還包括一個流動產生裝置，如為提供芯片樣品室中的氣體樣品，和當芯片插入設備中時，與樣品室的第二開口流體連接。
流動產生裝置可包括泵，如活塞泵、膜泵或者正排量泵。
在本發明的實施方式中，在選擇加樣(在10ml/min-500ml/min的范圍內)的過程中，泵能夠釋放適量的氣流通過芯片。優選的是，泵應該按照以下一個或者多個標準來選擇尺寸小、重量輕、沒有脈沖流動、通過改變馬達的極性使媒介可逆流動、通過控制電壓可調節流量。在本發明的實施方式中，流動產生裝置可以包括用于制造小滴試劑的噴射分配器，或者是類似的微分配設備。
在本發明的實施方式中，能夠以通過芯片的被動流提供氣體樣品。這將要求在芯片和作為樣品的周圍氣體之間的一個流速差。例如芯片可以被移動通過空氣，如按第一開口與周圍空氣是流動相連的方式安裝在飛機上，最佳的是與飛行方向相反。可以替換的是，如果空氣在芯片周圍移動，芯片與空氣相比沒有速度，如安置在出氣口，會發生這種情況。
在本發明的實施方式中，設備還包括用于控制的裝置，如通過樣品室的流動。
流動可以是，如液體流動或者氣體流動。
控制流動的裝置通常包括一個或者是多個閥。閥可以是，如從由下列所組成的組中選擇單向閥、兩路閥、多位置閥和夾管閥。
閥可以是例如微型組裝的閥，在實施方式中閥被集成在芯片上。
在本發明的實施方式中，第一試劑液體能夠使用噴墨微分配工藝進行釋放。噴墨色帶盒含有一個或多個隔間，隔間里包含有第一液體試劑或者第一液體試劑的分開組分，噴墨色帶盒以這樣一種方式安裝，該種方式能使液體微分配到反應室中。
本發明的另一個實施方式中，將第一液體試劑或者其分開的各個組分裝入塑料聚合物組成的密封的封套。塑料聚合物封套配置有一個內置的加熱電極，可以通過使用適當的電流使塑料聚合物融化，接著將封套里的液體釋放到芯片中。在另一個實施方式中，從密封的塑料聚合物封套中釋放液體，能夠通過機械的或者物理方式破裂封套如用尖的東西刺破來進行。
在本發明的一個實施方式中，設備可以裝備一個視覺上讀出結果的顯示器，顯示器可以是光發射源形式的(LED，燈泡或者類似物)、顯示屏、數字的讀取器或者是上述的任何組合。在本發明的另一個實施方式中，讀取器可以以聲音信號來交流。
在本發明的優選實施方式中，設備包括可以允許無線通訊的組件。無線通訊的例子是802.11移動無線局域網，蜂窩通訊、藍牙(Bluetooth)、全球定位系統(GPS)、和超寬頻帶。通訊可以是單向的如從設備傳輸數據或者是給設備傳輸數據，或者是通訊可以是組合的如雙向的。建立的通訊可進一步擴展為互聯網和設備之間的通訊，如建立一個ad-hoc網絡，該網絡可以使一個設備觸發另一個設備的樣品，因此有利于監控如氣霧云的進程。
在本發明的優選實施方式中，設備為重量輕和/或可攜帶的設備。
在本發明的實施方式中，設備重量至多10kg，如至多8kg、6kg、4kg、3kg或2kg，如至多1kg。甚至更為優選的設備的重量至多800g、如至多600g、500g、400g、300g、200g、150g、100g、80g、60g、50g、40g、30g、20g、10g或5g，如至多1g。
通常，設備總重量在20g-1kg的范圍，如20g-50g、50g-100g、100g-250g、250g-500g或500g-1000g。
本發明的一個方面涉及用于從生物細胞中提取生物材料的系統，其中該系統包括與這里所述設備功能上相連的所述芯片。
在本發明的實施方式中，系統的芯片和設備被集成在一起，并且不意味著互相物理上分開。在本發明的實施方式中，系統的芯片和設備被集成在一起以便他們不能夠被相互物理上分開而不損壞芯片或者設備。
在本發明重要的實施方式中，該設備是一次性系統例如只能使用一次。
在另一個實施方式中，系統的芯片是一次性的，但是該設備可以被重復使用。
在本發明另一個重要的實施方式中，系統的芯片是一次性的，但是該設備可以被重復使用。
本發明特定的方面涉及方法和微結構，其簡化了從來自芽孢桿菌屬(Bacillus)群細菌的內生孢子提取DNA的方法。
本發明的目的是從高度機械、化學、熱抗性的革蘭氏陽性菌(包括炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis))的內生孢子中快速提取DNA，以能夠進行快速DNA檢測。
該目的是通過包括對孢子結合使用脈沖電場的方法和結構而獲得的，所述用法包括被植入電場之間或者與電場相鄰的含有孢子溶液的流體結構，所述電場可以以一定頻率和強度變換并施加可變的時間，以及一組用于所述用法的最佳參數設置。
本發明描述了一種方法，其能夠對含有孢子的溶液施加脈沖電場。所述方法的結果是在開始所述方法5秒鐘的時間內釋放出DNA。
在特定的實施方式中，本發明提供了一種用于快速從孢子提取DNA的方法，其利用兩個電極結構以及插入的含有內生孢子的溶液。所述電極被連接到電壓源和頻率發生器，這使得在溶液上可以誘導產生脈沖電場。
在另外特定的實施方式中，本發明利用微流體設備，該設備能夠進行與上面相同的功能，并能夠被集成為用于快速提取DNA的樣品制備系統的一部分。
在本發明再一個特定的實施方式中，作為應用所述方法的結果，在通過后續的進行PCR或者視覺觀察DNA的質量(在進行瓊脂糖凝膠電泳和染色之后)，所釋放DNA的質量不受影響。
在使用兩個電極結構以對細胞或者孢子溶液施加電穿孔電壓的微結構中，關于在溶液中實際出現的所施加電勢的量是特別重要的。由于這一點，在電極-溶液界面上的壓降與所施加的電壓相比是顯著的。對于本領域技術人員，公知的是在實驗中所使用的溶液對勢能隨時間的斜率設定了限制。例如低施加電壓(＜2V)導致在電極中有非常小的電壓斜率，即使在長脈沖時間內(＞100μs)，這產生了峰狀的斜率。在溶液中所施加電壓的最大強度可以通過繪制設備提高時間和充電時間的指數函數來計算。例如，8μs的設備提高時間和20-40μs范圍內的充電時間會提供最大15-18％的所施加強度。在應用脈沖后的約10-15μs后達到最大值。50-75μs后，壓降有效地為零，因為所有所施加的電壓出現在電極-溶液界面。在更高的電壓下，界面的阻抗會成為不可忽視的，并且在電極之間通過的電流受到溶液電導系數的限制。
通常發現距離大于10μm的100mM KCl溶液的電阻在30±3kΩ的范圍內。
孢子的表層由蛋白質組成，其為整個孢子結構提供機械保護。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)具有由一種蛋白質組成的孢子表層，而枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在表層中已經被鑒定出了20種以上的蛋白質。而且，表層是功能性分子篩，其保護孢子內部免受除最小的分子外的全部的影響，盡管該孢子表層與對鹵素(如氯和碘)的抗性相關。表層還參與發育，已經表明孢子中帶有突變的孢子表層也會大部分在發育方面有缺陷。
在芽孢桿菌(Bacillus)類的無性細胞中，細胞壁肽聚糖由通過β-1，4連接的N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)組成。肽鏈(開始為L-丙氨酸-D-谷氨酸酯-內消旋-二胺基庚二酸[Dpm]-D-丙氨酸-D-丙氨酸)附著到NAM殘基上；在無性細胞中全部PG的大約35％參與交聯。與無性細胞PG(其表現出與芽孢桿菌(Bacillus)種類之間顯著的不同)相反，皮質PG結構的基本特征在全部種類中是相似的。皮質PG的結構在兩個主要方面與無性細胞PG有區別。
1.位于皮質的大約50％的NAM殘基作為胞壁酸-ρ-內酯出現，其中大部分MAL殘基被多糖鏈中的每兩個胞壁酸位置隔開。
2.大約25％的NAM殘基只帶有一個L-丙氨酸，并且由于MAL殘基不帶有肽側鏈，因此與生長中的細胞相比，只能有1/4的Dpm殘基用于參與孢子皮質中交聯的形成。結果是，孢子PG比無性細胞中的交聯要少得多。然而，孢子皮質中確切的分子排布是未知的。已經顯示孢子皮質參與到孢子的滲透性吸水和孢子的收縮。
作為所施加和交替電勢的結果，由于在電極上的氧化反應或者還原反應，會出現DNA核苷酸堿基的化學變化。這可能會導致通過熱穩定的DNA聚合酶在后續的DNA擴增、產生降低的擴增效率或者核苷酸的錯誤插入的差的核苷酸識別。
因此，本發明的特定方面涉及通過采用高頻率交替電場使細胞內組分可以從孢子得到的方法。
在本發明特定的實施方式中，該方法可以例如針對提取DNA和/或純化DNA。
在本發明特定的實施方式中，該方法也可以針對用于DNA檢測，例如在診斷分析中。
在本發明特定的實施方式中，該方法可以例如針對PCR中的應用，例如用于集成的PCR設備。
在本發明特定的實施方式中，該方法可以例如針對用于可移動的PCR設備或者生物戰劑檢測。
在本發明特定的實施方式中，該方法可以例如針對細菌孢子。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對來自革蘭氏陽性菌的孢子。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對來自芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)的孢子。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對來自蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)群的孢子。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對來自炭疽芽孢桿菌(Bacillus Anthracis)類的孢子在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對檢測原核細胞。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對從細菌細胞中釋放DNA。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對熱抗性細菌細胞。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對嗜熱或者極端嗜熱細菌。
在本發明特定的實施方式中，該方法針對通過PCR檢測熱抗性細菌。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對檢測熱裂解抗性細菌。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對分枝桿菌(Mycobacteria)的應用。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對真核細胞的應用。
在本發明特定的實施方式中，這里所描述的方法針對哺乳動物細胞的應用。
在本發明特定的實施方式中，該方法用于人類細胞、真菌細胞、植物細胞或者病毒。
在本發明特定的實施方式中，該方法用于毛細管設計，其中細胞或者孢子懸浮液含在兩個或者多個電極表面之間。
在本發明特定的實施方式中，所述裂解是通過應用高頻率交替電場所誘導的。
在本發明特定的實施方式中，對高頻率交替電場所施加的頻率在8000-200,000Hz的范圍內。
在本發明特定的實施方式中，在1和60秒之間的脈沖順序施加交替電場。
在本發明特定的實施方式中，該方法包括應用脈沖之間的短暫間隔。
在本發明特定的實施方式中，所施加的電壓在6-40V之間。
在本發明特定的實施方式中，將該方法用于懸浮在去離子水中的細胞或者孢子。
在本發明特定的實施方式中，所述細胞或者孢子被懸浮在PCR緩沖液配方中。
在本發明特定的實施方式中，該方法與捕獲設備結合使用。
在本發明特定的實施方式中，該方法與孢子捕獲設備結合使用。
在本發明特定的實施方式中，該方法與細胞捕獲設備結合使用。
在本發明特定的實施方式中，該方法與靜電捕獲設備結合使用。
在本發明特定的實施方式中，靜電捕獲設備是集成的孢子捕獲和裂解設備的一部分。
在本發明優選的實施方式中，所述方法、芯片、設備和系統不用于電穿孔和/或生物細胞的融合。
需要說明的是，根據本發明，在本發明的一個方面中所描述的實施方式和特征也可以用于本發明的其它方面。
實施例實施例1通過應用交替電勢檢測DNA質量使用含有緩沖液、dNTP的和Taq聚合酶集成溶液的TaqMan UniversalPCR Master Mix系統(Applied Biosystems)，在Opticon DNA設備(MJ research)上進行實時PCR分析。以900nM的最終濃度加入兩條引物269-16-23間隔子1 5’-TAT GAG CTA CAC TGT TAT CTA GTT TTC AAA GAA-3’(SEQID NO 1)和270-16-23間隔子2 5’-TTT CCG TGT TTC GTT TTG TTCAG-3’(SEQ ID NO 2)，和以100mM的濃度加入熒光TAQMAN探針(FAM-ACT TCT CTC ATA TAT AAA TGT-MGB-NFQ)(SEQ ID NO 3)，其全部針對擴增蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurgiensis)16S和23S tRNA基因的基因間隔子。標準PCR使用15μl樣品體積，并通過在95℃下孵育15分鐘活化Taq聚合酶以開始PCR。接著進行40個循環的兩步PCR反應94℃下解鏈15秒以及60℃下退火和延伸結合的步驟60秒。在每個循環的最后，在線檢測熒光以分析PCR產物的形成。
使用Boe等人的方法(Boe等人1989)從2ml(大約109個細胞/ml)過夜培養的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thurgiensis)亞種kurstaki分離染色體DNA。將所純化的DNA溶解在75μl TE緩沖液中，即進行10-6稀釋，其應該含有來自大約27個細胞/μl的DNA。
使用10-6稀釋的染色體DNA溶液中的4μl(相當于~100個基因組拷貝)分析高頻率電場對所稀釋DNA樣品可能的損傷影響。進行標準的檢測PCR以探測所施加電場的影響。詳細的說，將10-6稀釋的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)染色體DNA溶液中的20μl進行10V，100kHz高頻率電解5秒、10秒、20秒或30秒。接著，將4μl(相當于100個染色體拷貝)被處理的DNA進行實時PCR分析。將所有的樣品置于電解條件，在34個PCR循環后進行檢測，沒有觀察到檢測靈敏度的損失。在相同的CT點檢測到全部不同處理的DNA樣品的事實進一步說明核苷酸堿基的化學還原或者氧化對檢測PCR靈敏度有較少的影響(參見圖1)。然而，更進一步提高電解程序的持續時間(30、90或180秒)表示電解時間在時間延長的程序時沒有影響(參見圖2)。推測，超過30秒的電解會導致目標DNA的釋放和過飽和，接著出現了通過定量PCR檢測到的不佳的PCR檢測。
實施例2通過定量PCR檢測應用交替電勢進行孢子裂解將含有3.2×109個孢子/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，并在12000rpm下離心90秒。重復該步驟4次。去上清。最終溶液含有大約3.2×108個孢子。將該溶液稀釋到最終濃度為3.2×105個孢子/ml，并接著用于電解和PCR。
保持頻率和電壓穩定(分別為100kHz和10V)，使用不同的暴露時間(從5秒鐘到30秒鐘)檢測電解程序的持續時間。從圖3中可以清楚看出，對CT值沒有顯著的影響，這說明孢子的裂解實際上是不依賴時間的。然而，進一步提高電裂解程序的持續時間(分別為30秒、90秒和180秒)，便顯出當應用延長的程序時，電解時間有影響(參見圖4)。推測，超過30秒的電解會導致目標DNA的釋放和過飽和，這樣導致不佳的PCR檢測。
實施例3不同的頻率(10-100kHz)對孢子電裂解效率的影響將含有3.2×109個孢子/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，并在12000rpm下離心90秒。重復該步驟4次。去上清。最終溶液含有大約3.2×108個孢子。將該溶液稀釋到最終濃度為3.2×105個孢子/ml，并接著用于電解和PCR。
保持電壓和時間穩定(分別為10V和30秒)。圖4表示該實驗的結果，顯然，100kHz的高頻率表現了CT(極限循環，threshold cycle)的降低，這樣說明從孢子釋放了可擴增的DNA。將頻率降低到50kHz或者10kHz不會對CT值的改進有任何提高(即與未處理的對照相比降低了CT)。
實施例4確定用于孢子電解的最低有效電壓保持頻率和時間穩定(分別為100kHz和30秒)，使用不同的暴露電壓3～10V的范圍內(分別為3V、5V、7V和10V)檢測電解程序的電壓。從圖5可以清除看出，對于膜/孢子捕獲明顯存在極限電壓值VT。因此，所施加的電壓是高度依賴界面電極阻抗的重要參數，例如低施加電壓(＜2V)對電極提供了非常小的電勢梯度，即使在長脈沖時間內(＞100μs)；并形成了峰狀梯度。
在溶液中所施加電壓的最大強度可以通過繪制設備提高時間和充電時間的指數函數來計算。例如，8μs的設備提高時間和20-40μs范圍內的充電時間會提供最大15-18％的所施加強度。在應用脈沖后的10-15μs后達到最大值。50-75μs后，壓降有效地為零，因為所有所施加的電壓出現在電極-溶液界面。在更高的電壓下，界面的阻抗會成為不可忽視的，并且在電極之間通過的電流受到溶液電導系數的限制。
實施例5確定DNA/RNA釋放百分率將含有大約109CFU/g的100mg Biobit蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthurigiensis)亞種kurstaki(Valent BioSciences Corp，Libertyville，USA)懸浮在1ml去離子水中，接著在70℃下用巴氏法滅菌5分鐘，接著對溶液進行離心(5000xg，5分鐘)。去上清。再重復該步驟(Tyndalisation)2次。最終的1ml溶液含有大約108個孢子。
將該溶液稀釋成105個孢子/ml的最終濃度，這樣得到了儲藏溶液。
使用儲藏溶液的樣品填充樣品室，并將樣品暴露到交流電場中，所述交流電場具有選定的頻率、強度和持續時間。
為了確定樣品生物細胞的DNA/RNA釋放百分率，將所暴露的樣品和含有存儲溶液的對照都使用熒光染料4’，6-二咪基-2-聯苯基吲哚(DAPITM)處理。DAPI是廣泛應用的DNA染料，其在結合到雙鏈DNA小凹陷中富含A-T的序列時會形成熒光復合物。染料溶液是含有2.0μg/ml DAPI的水溶液。而且，DAPI限制了細胞的滲透性，并且因此對于顯示遺傳物質的細胞釋放是最佳的。
使用一定體積的染料溶液對樣品室進行洗脫，其體積是樣品室體積的三倍。將來自樣品室的洗脫液在室溫下孵育5分鐘。
在是對照體積大約3倍體積的染色溶液中，將與所暴露樣品體積相當的體積的對照分別染色5分鐘。
接著將適當體積的對照和適當體積的所暴露樣品在相差顯微鏡和熒光顯微鏡(配有DAPI過濾器)下進行觀察。使用相差顯微鏡對于對照和所暴露的樣品計算孢子的數目，表示所釋放的染色體DNA分子(可以看到的藍點)的孢子的數目通過熒光顯微鏡計算。接著按照下式確定DNA/RNA釋放百分率 ，其中ds是所計算的藍色DNA點的數目，ss是孢子的總數。
也可以確定背景DNA/RNA釋放百分率作為對照，如果表示背景釋放高于5％，則建議所確定的被認為無效，需要對生物細胞的新儲藏溶液進行重復。
參考文獻Levi等人 Levi，K.，Higham，J.L.，Coates，D.，& Hamlyn，P.F.(2003)Molecular detection of anthrax spores on animal fibres(在動物纖維上對炭疽孢子的分子檢測).Letters in AppliedMicrobiology36，418-422.
Boe等人 Boe L，Gros MF，te Riele H，Ehrlich SD，Gruss A.(1989)Replication origins of single-stranded-DNA plasmid pUB110(擴增單鏈DNA質粒pUB110的起始區).J Bacteriol.171(6)3366-72Cano和Borucki Cano RJ，Borucki MK.(1995).Revival and identification ofbacterial spores in 25-to 40-million-year-old Dominicanamber(多米尼加2500萬～4000萬年的琥珀中細菌孢子的發育和鑒定).Science.2681060-4.
Johns等人. Johns，M.，L.Harrington，R.W.Titball，and D.L.Leslie.(1994).Improved methods for the detection of Bacillusanthracis spores by the polymerase chain reaction(用于通過聚合酶鏈式反應對炭疽芽孢桿菌孢子檢測的改進的方法).Lett.Appl.Microbiol.18236-238.
Linden，D. Linden，David.(1984).Handbook of Batteries and Fuel Cells(電池和燃料電池手冊).New YorkMcGraw-Hill.
權利要求
1.一種用于從生物細胞中提取生物材料的方法，該方法包括下列步驟a)提供樣品室和第一電極以及第二電極，第一電極和第二電極以及樣品室被安置成至少部分樣品室在第一電極和第二電極之間；b)提供樣品室中的液體樣品，該液體樣品含有生物細胞；c)將所述液體樣品暴露到所述樣品室中的交替電場下，其中所述交替電場是通過第一電極和第二電極提供的，并且具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料；以及d)可選擇地，對部分暴露的液體樣品進行分析，其中所述部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。
2.根據權利要求1所述的方法，其中第一和第二電極被分開最多20mm的距離，優選最多10mm，更優選最多5mm。
3.根據權利要求1所述的方法，其中將生物細胞附著到第一電極和第二電極上，和/或者被安置在第一電極和第二電極之間。
4.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中交替電場的頻率為至少5kHz，優選為至少20kHz，更優選為至少50kHz。
5.根據權利要求4所述的方法，其中交替電場的頻率為至少100kHz，優選為至少250kHz，更優選為至少500kHz。
6.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中交替電場是通過調節第一電極和第二電極的極性形成的。
7.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中交替電場可以具有從由下列所組成的組中選擇的實質形式矩形、正弦、鋸齒、不對稱三角形、對稱三角形或者其任何組合。
8.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中在頻域中交替電場至少含有第一頻率分量和第二頻率分量。
9.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中所述生物材料包括選自細胞器、遺傳材料以及蛋白質所組成組的組分。
10.根據權利要求9所述的方法，其中遺傳材料包括染色體DNA和/或質粒DNA和/或任何類型的RNA。
11.根據權利要求9所述的方法，其中蛋白質選自由酶、結構蛋白質、轉運蛋白質、離子通道、毒素、激素以及受體所組成的組。
12.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中生物細胞選自由細菌、古細菌、或真核微生物和真核細胞。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述細菌是形成孢子的細菌。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述形成孢子的細菌選自芽孢桿菌屬(Bacillus)和/或梭狀芽孢桿菌屬(Clostridia)。
15.根據前面權利要求任何一項所述的方法，其中所述細菌來自芽孢桿菌屬(Bacillus)群。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述細菌是炭疽芽孢桿菌(BacillusAnthracis)。
17.根據權利要求12～16任何一項所述的方法，其中生物細胞是無性細菌或者孢子。
18.一種用于從生物細胞中提取生物材料的芯片，該帶有樣品室的芯片包括-樣品室，其包括與周圍空氣流體連接的第一開口以及第二開口以形成與設備的流體連接；-第一電極和第二電極，其被安置在樣品室相對的兩側；-可選擇地，樣品室還包括含有生物細胞的液體樣品；以及-可選擇地，在第一電極和第二電極之間有交替電場，所述電場具有充分的強度以便從生物細胞中提取生物材料。
19.根據權利要求18所述的芯片，其中第一電極和第二電極被安置在第一開口和第二開口之間。
20.根據權利要求18或19所述的芯片，其中生物細胞位于第一電極和第二電極之間。
21.一種用于從生物細胞中提取生物材料的設備，該設備包括-芯片位點，芯片位于此處以便能夠功能上與該設備相連；-設備和芯片之間的電接口，以用于在樣品室的電極之間施加交替電場；以及-可編程的單元，其包括能夠使該設備實現進行從由下列所組成組中選擇的一種或者多種行為的軟件-提供樣品室中的液體樣品，其中液體樣品含有生物細胞；-將所述液體樣品暴露到所述樣品室的交替電場下，所述交替電場具有充分的強度以從生物細胞中提取生物材料；以及-對部分所暴露的液體樣品進行分析，其中該部分包括從生物細胞中所提取的生物材料。
22.一種用于從生物細胞中提取生物材料的系統，其中該系統包括根據權利要求18～20中任何一項所述的芯片，該芯片與根據權利要求21所述的設備功能上相連。
全文摘要
本發明涉及用于從生物細胞中分離生物材料的方法、芯片、設備和系統。本發明包括將生物粒子暴露到樣品室的交替電場中，并還可以包括在提取后對生物材料的后續分析。
文檔編號C12N13/00GK1965081SQ200580006151
公開日2007年5月16日 申請日期2005年2月25日 優先權日2004年2月26日
發明者格特·博蘭德·詹森, 拉爾斯·湯姆森, 厄恩·羅伯特·韋爾特曼 申請人:湯姆森生物公司