專利名稱：生物催化制造(甲基)丙烯酰膽堿或(甲基)丙烯酸2－(n,n－二甲氨基)乙酯的制作方法
發明概述本發明涉及合成丙烯酸和/或甲基丙烯酸的膽堿酯和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇(＝DMAE)酯的生物催化方法，即丙烯酰膽堿、甲基丙烯酰膽堿(methacrylylcholine)、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(下文為DMAEA)和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(下文為DMAEMA)的制造方法或過程，其包括在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下膽堿和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇(下文為DMAE)與丙烯酰輔酶A(acrylyl-CoA)和/或甲基丙烯酰輔酶A反應，其中優選在能量提供物質以及具有S-乙酰輔酶A合成酶活性(乙酰輔酶A合成酶活性)的生物催化劑存在的情況下通過丙烯酸鹽和/或甲基丙烯酸鹽與輔酶A反應，或通過利用微生物例如從糖類例如經乳酸代謝產生的丙烯酸鹽或甲基丙烯酸鹽反應，形成丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A；涉及(尤其是轉化的，即基因修飾的)具有膽堿乙酰轉移酶活性并優選另外具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物及其在所述過程或方法中的用途；涉及為了制造一個或多個上述膽堿酯或DMAE酯，具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑在實現(甲基)丙烯酰部分從(甲基)丙烯酰輔酶A到膽堿和/或DMAE的轉移中的用途；以及涉及如下所述進一步的用途、生物、過程和方法。
背景技術：
微生物或生物催化介導的生物量(例如纖維素或淀粉)的轉化以提供技術原材料，是一種重要的礦物燃料替代法，并由于未來礦物燃料的耗盡變得越來越重要。重要的是在手邊擁有盡可能多的生物催化反應以使用生物或生物催化方法生產它們。
丙烯酰膽堿，其在工業上更普遍被稱為qDMAEA，丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的季鹽，和甲基丙烯酰膽堿，以及DMAEA或DMAEMA，是(甲基)丙烯酸的單體，其在聚合物的制造上有著廣泛應用。特別是水溶性均聚物或與其他可聚合單體例如(甲基)丙烯酰胺或N-乙烯吡咯烷酮或丙烯酸羥乙酯等的共聚物被用于此類聚合物的制造。這些聚合物在許多應用中有著用途，特別是在水處理中作為絮凝劑使用；但也有著其他用途，例如作為增稠劑，在造紙工業的粘合劑中作為助留劑，在用核酸，例如DNA轉染微生物中作為分散劑或作為助劑，等。
膽堿(2-羥乙基三甲銨(2-hydroxyethyltrimethylammonium))是一種季銨醇(quaternary amino alcohol)，其廣泛地存在于活的生物內作為某些類型磷脂的成分以及存在于神經遞質乙酰膽堿中。它也是日常飲食的一部分，因為它包含于多種食物中。
DMAE[2-(N，N-二甲氨基)乙醇]同樣廣泛地存在于活的生物內并且是例如磷脂酰乙醇胺生物合成的前體。
丙烯酸和甲基丙烯酸是單體，被廣泛用于制造聚合物，或者是通常的酸的鹽的均聚物，例如丙烯酸鈉或丙烯酸銨，或者是與其他可聚合單體例如丙烯酰胺等的共聚物。這些合成的聚合物被用于多種應用，包括用于水處理的絮凝劑；用于造紙、紡織和皮革工業的涂層、涂飾劑和粘合劑；以及在超吸收劑(superabsorbent)和分散劑等的生產中用于制造油漆、拋光劑和粘合劑。
1980年Dalal等(Biosources Digest vo.2p 89to 97)闡述了丙烯酸的代謝合成。作者報告在埃氏巨球形菌(Megasphera elsdenii)的乳酸鹽厭氧脫水中丙烯酰輔酶A被假定為中間體并且在丙酸梭菌(Clostridium propionicum)中它發生在β-羥基丙酰輔酶A(β-hydroxypropionly CoA)脫水作用之后。他們還提出利用丙酸梭菌的靜息細胞用丙酸鹽作為底物可以觀察到丙烯酸鹽積累。方案I給出了丙烯酰輔酶A合成的代謝方案。
方案I在丙酸梭菌中涉及丙烯酰AoA的代謝途徑(同樣參見于Dalal等，出處同上)
最近，一些生物合成丙烯酸鹽和丙烯酸酯的方法得到闡述，例如在WO 02/042418 A2或WO 02/42471 A2中，也參見關于丙烯酸合成的WO 00/71738。
這些文件無一闡述了制造丙烯酸或(甲基丙烯酸)2-(N，N-二甲氨基)乙酯或膽堿丙烯酸鹽(cholinylacrylates)或-甲基丙烯酸鹽(上文和下文中的丙烯酰膽堿或甲基丙烯酰膽堿)的可能性，而且它們通常要求丙烯酰輔酶A水解酶和脂肪酶活性的組合以首先從丙烯酰輔酶A中產生游離的丙烯酸鹽，隨后通過例如脂肪酶轉化為脂族醇的酯。
另一方面，EP 0 250 325和WO 00/43348闡述了丙烯酰膽堿合成的化學過程，其從例如丙烯酸2-二甲氨基乙酯和氯代甲烷開始，而JP 9255640和JP 6279371描述的化學合成方法或者從與硫酸反應的丙烯腈開始，經硫酸丙烯酰胺作為中間體并隨后與膽堿鹽酸鹽反應，或者例如在酸催化劑存在的情況下丙烯酸與膽堿鹽酸鹽在甲苯中反應。
然而，為了提供同樣可以利用可再生生物量的綜合的生物合成方法的最終步驟，生物催化反應，而不是這些化學反應，將更令人滿意。
丙烯酸和甲基丙烯酸是S-乙酰輔酶A合成酶(S-乙酰輔酶A合成酶、乙酸硫激酶或乙酸輔酶A連接酶)(EC 6.2.1.1)的已知底物，然而，發現的產物大體上似乎不相當于酰基輔酶A硫酯——相反，經邁克爾加成(Michael addition)雙鍵和通過酸的羰基形成硫羥酸酯發生了輔酶A的兩個等價物的結合，因此發現形成了雙加合物(參見例如Patel和Walt，Anal.Biochem.170，355-60(1988))。雙加合物有下式 與這個背景相反，提供合成(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A的生物方法將高度令人滿意，這種生物方法是簡單的和/或當前的化學方法的真正替代方法，并且也為綜合形成一種更普遍的生物技術方法，例如最終利用可再生資源，奠定了基礎。
發明概述令人驚訝地，現在已經發現在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下通過膽堿與丙烯酰輔酶A或甲基丙烯酰輔酶A反應可能直接從S-(甲基)丙烯酰輔酶A((甲基)丙烯酰輔酶A)獲得(甲基)丙烯酰膽堿。另外或可選擇地，利用相同類型的生物催化劑使DMAE與丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A反應可以獲得DMAEA和/或DMAEMA。
在具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑的幫助下，利用甲基丙烯酸和/或丙烯酸以及輔酶A甚至可能合成前體(甲基)丙烯酰輔酶A，因為顯示條件是可利用的，在所述條件下在體外已經利用具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑，例如通過最優化反應物的濃度，特別是相對于彼此而言，(甲基)丙烯酸的羧基基團與輔酶A的硫醇基團的反應優先于向雙鍵的加成，因此可以形成比雙鍵加合物或雙加合物相對多的硫酯。在這點上特別優選的是下面更詳細描述的補料分批方法。
體外條件允許合成(甲基)丙烯酰輔酶A這個令人驚訝的新發現構成了同樣在體外或通過體外和體內的步驟相組合合成(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A的基礎。
這構成了合成(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A的生物合成途徑的基礎，其大大地消除了對石油化學原料的依賴，例如也通過在體內或在體外合成(甲基)丙烯酰輔酶A與在體外合成(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A的組合或兩步驟均在體內合成(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A。
發明詳述本發明，在第一個方面，涉及丙烯酰膽堿(非常優選)、甲基丙烯酰膽堿(優選)、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的制造過程或方法，所述過程包括在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下使膽堿(優選)和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇與丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A反應。取決于原材料，獲得相應的產物。
在進一步的方面，本發明涉及基因修飾生物(GMO)，其用一個或多個(優選重組的)核酸轉化，所述核酸包含一個或多個編碼并允許具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑表達的片段。
在另一個方面，本發明涉及上一段中提及的GMO在制造丙烯酰膽堿(非常優選)、甲基丙烯酰膽堿(優選)、DMAEA和/或DMAEMA中的用途，其包括向所述微生物的培養物施用一個或多個適當的來自生物量的原材料以及優選也施用膽堿和/或DMAE，并且分離所得到的產物丙烯酰膽堿(非常優選)、甲基丙烯酰膽堿(優選)、DMAEA和/或DMAEMA。
本發明還涉及具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑在實現(甲基)丙烯酰部分從(甲基)丙烯酰輔酶A到膽堿(優選地)和/或DMAE的轉移中的(體外和/或體內)用途，以制造(甲基)丙烯酰膽堿(優選地)和/或DMAE(M)A。
本發明同樣進一步涉及具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑在制造丙烯酰輔酶A(尤其是有發生在體外的相應反應步驟)中的用途，其中伴隨低水平的雙加合物形成。
通過下列反應方案表示構成本發明基礎的反應方案II
在方案II中，原材料膽堿(作為鹽)和/或鹽形式的DMAE以及(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A鹽產物的陰離子可以是在各自反應系統中耐受的任何陰離子，例如有機酸的陰離子，例如磺酸鹽，如甲磺酸鹽或甲苯磺酸鹽，或羧酸鹽，如檸檬酸鹽或乙酸鹽，或尤其是無機酸，例如硫酸鹽，鹵化物，如氯化物或溴化物，硝酸鹽，磷酸鹽等。
優選地，按照下列方案III，通過具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑，由丙烯酸或甲基丙烯酸和/或其鹽，在下文中一般稱為丙烯酸鹽和/或甲基丙烯酸鹽，在體外或在體內合成丙烯酰-或甲基丙烯酰輔酶A
方案III 和上述文獻形成相反，如果(體外)反應條件經過適當改良，則可以得到非常令人驚訝的大量的(甲基)丙烯酰輔酶A而不是雙加合物。
因此結果是反應可以產生更多的期望的(甲基)丙烯酰輔酶A，如果(甲基)丙烯酸鹽和輔酶A的摩爾比是(甲基)丙烯酸鹽以摩爾過量的方式使用的話，例如超過2倍摩爾過量、更優選超過4倍摩爾過量，再更優選超過10倍，例如(甲基)丙烯酸鹽大約15倍摩爾過量于輔酶A；例如，(甲基)丙烯酸鹽的濃度可以在50-300，例如120-280mM，而輔酶A的濃度為其小部分，優選如可從剛才提到的有利于(甲基)丙烯酸鹽的優選摩爾過量比中推導出來的。
同樣存在其他所需成分(例如Mg2+鹽，如MgCl2；ATP(優選與(例如堿金屬，如鈉)(甲基)丙烯酸鹽相比為亞理想配比的摩爾量，例如小于(甲基)丙烯酸鹽摩爾量的1/5，如所述量的1/10)，當然還有生物催化劑，優選S-乙酰輔酶A合成酶，其以適當的活性存在，例如在ATP、乙酸鹽和輔酶A存在的情況下在37℃為0.5-15單位/ml。同樣優選存在緩沖物質，例如Tris緩沖液(三(羥甲基)氨基甲烷或其他允許適當的pH確定的緩沖物質，所述pH例如在5-9，例如6-8(如，pH大約為6.4-7.3)。這些包括任何合適的生物學兼容的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液等。
如果在反應過程中輔酶A不是突然添加而是更小批量添加(非常優選的補料分批方式)或連續添加，則所需(甲基)丙烯酰輔酶A產物超過雙加合物的產量仍然提高，因而使得硫酯形成可以發生在進一步的輔酶A可能加成到其產物(甲基)丙烯酰輔酶A的雙鍵之前。例如，在一個時間段內，例如，最高達3小時，輔酶A可以每隔一段時間以總最終量/濃度為1/20-1/3的量分批式添加，如1/10的總輔酶A分別在0、5分鐘、10、15和20分鐘使用，隨后在80、95、110、120分鐘145和155分鐘后以這些間隔再次使用1/10。另外，同樣可在適當時補充ATP，例如為了產生5mM濃度在t＝0時添加ATP，隨后在25分鐘后又添加ATP以產生5mM濃度并且在150分鐘后再次添加以產生5mM ATP濃度。
需要時，同樣可在適當的時間段后補充酶。
因此在每個單獨的時間點將游離輔酶A的亞理想配比濃度優選保持在低于(甲基)丙烯酸鹽初始濃度1∶100的比率，例如1∶150，例如2mM或更低，例如大約1mM或更低，并且更優選在每個時間點將ATP濃度同樣保持在低于(甲基)丙烯酸鹽初始濃度的1/20，例如低于10mM，例如等于或低于大約5mM。
本發明的一個有趣的變形涉及利用丙烯酸作為唯一的碳源(例如被同化為乳酸鹽隨后為丙酮酸鹽，后者經三羧酸循環可以被利用)，其同樣平行地供應給方案III中提供的反應。這個方法可以為丙烯酰膽堿和/或DMAEA合成提供尤其良好的條件。
在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下，同樣可能利用適當的來自生物量的原材料，代替提供丙烯酸鹽或甲基丙烯酸鹽，作為與膽堿和/或DMAE反應的前體。這些前體是生物過程的產物(包括但不限于廢棄的生物量材料，例如能夠被處理，例如被水解，以釋放出適當的原材料的農業材料)并且經生化途徑可以首先轉化為(甲基)丙烯酰輔酶A。例子有糖類(例如來自廢棄的生物量材料、淀粉、纖維素或其他多糖)、多元醇(例如來自脂肪)、有機酸(例如來自代謝或來自脂肪酸酯水解)、氨基酸等。如本文所述(甲基)丙烯酰輔酶A隨后可以被轉化為(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A。由于生物量是可再生的，所以這個方法對于可持續發展和環境保護基本上是非常有利的。原則上和有利地是，從有生物量原材料的生化途徑同樣可能獲得其他原材料、膽堿和/或二甲氨基乙醇。然而，由于實際原因，這些原材料可以被如此添加。
根據本發明其中可以供應前體以合成丙烯酰膽堿的某些可能的代謝反應途徑和可能的連接點以及酶活性的實例示于上述的方案I以及下述的方案IV圖IV 此處，大寫字母A-N優選表示下列酶活性A烯醇丙酮酸磷酸羧激酶；B天冬氨酸轉氨酶；C天冬氨酸脫羧酶；D輔酶A轉移酶；Eβ-丙氨酰輔酶A脫氨酶；F乙酰輔酶A羧化酶；
G丙二酸單酰輔酶A還原酶；H3-羥基丙酰輔酶A脫水酶(＝丙烯酰輔酶A脫水酶)I(乙酰)輔酶A合成酶或(乙酰)輔酶A轉移酶(它可以是酶復合物例如WO 02/042418中的OS17的一部分)；K丙酰輔酶A還原酶(它可以是酶復合物例如WO 02/042418中的OS17的一部分)；L輔酶A合成酶或輔酶A轉移酶；M乳酰輔酶A脫水酶；N具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑。
為了合成甲基丙烯酰膽堿，例如，可能利用異丁酸或其代謝前體代替方案IV中的丙酸作為連接點或作為原材料。
其他離析物是可能的，例如利用由于使用旋卷分枝桿菌(Mycobacterium convolutum)或遺傳材料作為生物催化劑和由此得到的生物催化劑而可能的將丙烯氧化為丙烯酸鹽的途徑，分別通過例如赤紅球菌(Rhodococeus ruber)或紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)利用細菌腈水解酶或腈水合酶與酰胺酶活性組合將烯丙醇氧化為丙烯酸鹽(例如利用熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)或珊瑚諾卡氏菌(Nocardia coralline)或遺傳材料作為生物催化劑和由此得到的生物催化劑)或丙烯腈或甲基丙烯腈。
相應的途徑和酶活性可以是構成生物的天然核酸和遺傳裝備的部分的核酸基因表達(包括轉錄和翻譯和可能的翻譯后修飾)的結果，這些生物尤其是植物(或植物組織)或更優選微生物(尤其是單細胞生物)，最尤其是原核生物，例如細菌，或(至少在它們生活周期的部分內)單細胞真核生物，例如真菌，如酵母，或它們可以是此類細胞轉化的產物(對于引入的外源性核酸它們隨即變成“宿主細胞”，即基因修飾生物(GMO))，所述細胞包含來自其他生物(例如動物，如嚙齒動物，或人類)的“外源性”核酸或其類似物，其帶有所需的編碼和能夠表達相應生物催化劑活性的片段，優選帶有重組核酸，例如帶有載體(如質粒、粘粒、病毒性或病毒來源的載體等)，其中，除了一個或多個(甲基)丙烯酰膽堿和/或DMAE(M)A或其前體合成所需的生物催化劑活性的編碼片段之外，所述核酸或其類似物可以包含一個或多個阻遏物、激活物、啟動子和/或轉運蛋白序列或其他序列，這些其他序列對于在細胞內或跨過細胞膜整合、維持、轉運、翻譯后修飾和尤其是編碼的多肽的表達及其活性以及允許進行選擇的任選的遺傳標記(例如半乳糖苷酶或抗生素抗性編碼序列)是必需或有用的，尤其是攜帶一個或多個相應的酶活性生物合成所需的遺傳信息成分的重組核酸構建體。
WO 02/042418中給出了或者從中可以推導出可能的多肽和基礎的遺傳信息/核酸的實例，這些多肽和遺傳信息/核酸可以用于獲得直接在它們的親本生物中或在不同的宿主細胞的轉化中有用的酶活性，且所附的參考文獻還收錄了尤其是相應的核酸和氨基酸序列以及其中獲得它們或其類似物的方法。在基因技術，尤其是分離、重組、表達、轉化等中有用的方法是本領域的技術人員已知的，并且能夠，例如，作為基礎或利用公開于下述文獻中的知識、方法和試劑Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Press，1989或Gassen等，“GentechnischeMethoden-Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für dasmolekularbiologische Labor”，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg 1999，F.M.Asubel(Hg.)“Short Protocols in MolecularBiology”，3rd ed.，New York，Wiley 1997；或Asubel等“CurrentProtocols in Molecular Biology”，Vol.1-3，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience，New York，1987。
作為實例，一個迄今未知的被分離的具有在本發明中有用的生物催化活性的酶(例如膽堿乙酰轉移酶或S-乙酰輔酶A合成酶)可以被部分測序，例如，利用選擇性內切蛋白酶來選擇性消化，例如內切蛋白酶Lys-C、內切蛋白酶Glu-C、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶或優選胰島素(從堿性氨基酸精氨酸或賴氨酸的C-末端切割)，并且，分離后，例如在凝膠上進行電泳或通過層析(如HPLC)，測定所得到的肽的末端序列，例如，通過外肽酶，例如羧肽酶，如羧肽酶A、B或P)。優選胰蛋白酶消化，隨后進行MS/MS分析(TOF)。由此所得的序列可以被用于例如發現相應的編碼核酸(如RNA或尤其是DNA)序列或它們的非編碼反鏈(counter strand)，反鏈隨后可用于設計引物以(例如通過與基因組或部分(例如限制性內切核酸酶)消化的DNA雜交)尋找編碼相應酶的較長的DNA片段(或來自雙鏈DNA中的配對鏈的相應非編碼序列)，隨后可以把這些片段拼湊起來(例如通過基因步移)以形成一個完整的編碼核酸；或來自cDNA庫。通過上一段所提到的參考文獻中描述的方法的組合，可能分離編碼具有所需活性之一的多肽的DNA。
可選擇地，已經公開的編碼相應生物催化活性的序列的合成的或分離的DNA(例如cDNA)可以被利用并且整合進入載體，所述生物催化活性例如酶，例如膽堿乙酰轉移酶或S-乙酰輔酶A合成酶活性，或轉運蛋白，例如膽堿和/或DMAE轉運蛋白。
術語“核酸”是指多核苷酸，尤其是DNA。提到重組核酸時，這是意指特定的適當載體形式的核酸，以及在轉化后的宿主細胞中由此得到的產物(例如由于整合到也包括質粒等的基因組中以及伴隨的改變、重組或類似事件)。在宿主生物轉化中有用的重組核酸有，例如，載體(例如質粒、粘粒、病毒性或病毒來源的載體等)，包含相應的生物催化劑活性表達所需的編碼序列。
一般而言，“重組體”，在關于核酸或尤其DNA的上下文中任何地方使用時，優選具有它的通常含義，例如包括(1)在其所引入或尤其表達的生物內非天然存在的序列，或(2)通過人工組合兩個另外單獨的較短序列制成的序列(例如通過將編碼序列插入到質粒或其他載體中)。人工組合可以通過化學合成和/或優選通過分離的核酸片段的人為處理來完成，例如通過基因工程技術，如部分消化，例如用內切核酸酶、連接、剪接等。“重組體”也用于描述被人為處理但包含相同的調節序列和編碼區的核酸分子，這些調節序列和編碼區是在從中分離核酸的生物內發現的。
本發明還尤其涉及利用基因修飾生物(GMO)生物合成丙烯酰膽堿、甲基丙烯酰膽堿、DMAEA和DMAEMA中的任何一個或多個的途徑以及相應的GMO，優選基因修飾的(優選(至少在其部分生命周期內)單細胞微生物(尤其是原核生物，最優選細菌，或真菌，最優選酵母，但也可以采用昆蟲細胞，例如利用桿狀病毒表達系統)，其(已經是天然形式或用一個或多個適當的核酸轉化后)包括a)核酸(尤其是DNA)，其來自原核生物，優選細菌；或次優選真核生物，例如酵母、其他昆蟲、真菌或植物細胞、真菌或植物組織或植物；其中的每一個都能夠使GMO生物催化地將生物量原材料(優選如上所定義的，例如多元醇或糖類例如葡萄糖)優選轉化為乳酸并進一步轉化為(甲基)丙烯酰輔酶A；b)組合一個或多個(優選重組的)核酸(尤其是DNA)，其來自高等生物(優選動物，更優選例如在神經肌肉接頭具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物)，例如昆蟲或尤其是脊椎動物，尤其是哺乳動物、組織或細胞，其核酸編碼并表達所需生物催化活性(尤其是酶)并且使GMO能夠實現(甲基)丙烯酰輔酶A和膽堿鹽，例如膽堿鹽酸鹽，和/或DMAE或其鹽之間的生物催化反應。在生長培養基中可以為GMO提供膽堿鹽或DMAE，或其鹽。可選擇地，它同樣可以由適當的來自生物量的原材料生物合成產生。
有利地，GMO，如果不是已經表現出此類活性，同樣可以被另外修飾以使DMAE和/或膽堿能夠進入細胞和/或在需要時允許產物DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿離開細胞。來自微生物，尤其是原核生物或單細胞真核生物或植物的活性或重組遺傳材料與高等生物，尤其是在上一段中所述的動物，優選哺乳動物，例如嚙齒動物或人類的活性或重組遺傳材料的結合的這個概念的實施方案，例如從動物細胞，例如所得的GMO獲取編碼膽堿乙酰轉移酶并優選另外編碼DMAE或對于優選合成膽堿酯編碼更優選的膽堿轉運蛋白的遺傳材料及其在(甲基)丙烯酰膽堿制造中的用途和/或利用這些GMO制造(甲基)丙烯酰膽堿的過程或方法，是本發明特別優選的變形，尤其是包含編碼除已經存在或同樣重組整合至所述GMO的其他所需活性之外的所需活性的重組核酸的此類GMO在DMAE(M)A和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿制造方法中的用途。本發明還涉及制造相應的GMO，尤其是單細胞生物，尤其是原核生物，例如細菌，例如大腸桿菌(E.coli)，或真菌或單細胞真核生物，例如酵母，其包含一個或多個編碼在這一段a)和b)下所述活性的核酸的組合。優選的是轉化的原核生物，尤其是細菌，或轉化的真菌，優選酵母，其包含一個或多個(天然或重組的)核酸，所述核酸編碼并特別是允許來自原核生物或較低等的真核生物例如真菌，如酵母的膽堿S-乙酰轉移酶活性的表達，以及一個(優選重組的)核酸，所述核酸編碼并允許動物，尤其是嚙齒動物，例如大鼠，或人類(例如來自人類胎盤)的膽堿乙酰轉移酶活性的表達。
產物DMAE(M)A和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿在細胞(例如上一段中提及的GMO)中生產時可以直接從上清液(同樣在透化細胞的情況下)分離，或(如果不易離開細胞)在細胞透化處理后(其同樣可以允許原材料的進入，尤其是膽堿鹽或游離的和/或鹽形式的DMAE)分離，例如用適當的表面活性劑或孔蛋白(例如來自哺乳動物補體系統)，或在(例如化學的或機械的)細胞膜破壞后分離，例如，利用一種或多種采用勻漿器、攪拌器、超聲波破壞等的方法。在破壞的情況下剩余細胞可以用于進一步生產，例如如果只有部分培養物被用于破壞的話，持續反應是可能的，但優選分批式生產，而在其他情況下此過程可以或者以持續的或者以分批式的方式進行，其中產物從懸浮液中被分離出來。
在任何情況下產物(DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿)的分離，同樣包括在體外合成的情況下，可以通過標準方法進行，例如利用層析(尤其是包括陽離子交換層析的步驟)、電透析、溶劑洗滌、萃取、分配(partitioning)等，或此類方法的結合。可選擇地，可能可以原位聚合DMAE(M)A和/或(甲基)丙烯酰膽堿，或者作為均聚物或者外加其他可聚合的單體，例如丙烯酰胺、苯乙烯等，而無需預先純化。
同樣可能減少或(在相應的生物催化活性不是利用此類活性的活細胞存活所必需時)去除某些生物催化劑的活性，例如通過使用一種或多種方法，例如基因破壞、反義核酸、突變、敲除法或適當的可逆的或不可逆的抑制劑的施用等，以允許所需產物或中間體，例如丙烯酰輔酶A或甲基丙烯酰輔酶A的積累，這通過阻斷導致遠離這些產物的代謝途徑而不是用于其合成且優選進一步反應為DMAE(M)A和/或特別是(甲基)丙烯酰膽堿的途徑(例如由方案IV中顯示的酶活性E、H、K或M催化的或引導的一個或多個反應)來實現。這可用于達到一個較高的DMAE(M)A和/或(甲基)丙烯酰膽堿合成所需的前體，例如(甲基)丙烯酰輔酶A的可用性(濃度)。
盡管在特定的情況下體外和體內反應的區別的邊界可能顯得模糊，但這些表達優選定義如下“體外”，在這個公開內容中使用時，優選指相應的過程在不再存活(即，不再顯示所有生命跡象，即運動性、繁殖、代謝、有或無可突變性的遺傳以及興奮性)的細胞或細胞組分(直到純化的酶)中或在無細胞系統，例如酶溶液中進行。
“體內”是指過程發生在活的基本上完整的生物或細胞(其顯示上一段所定義的生命特征)存在時或優選主要發生在所述生物或細胞內。術語“基本上完整的”同樣意指包括具有透化膜的生物或細胞，例如通過表面活性劑或孔蛋白等，只要上一段中定義的生命特征仍然存在。
在利用(至少基本上)完整的，例如(尤其是轉化的，從而得到GMO)細胞或生物時，這是尤其有用的，如果該細胞或生物含有DMAE或尤其是膽堿轉運蛋白(尤其是整合到它們各自的細胞膜，如作為膜蛋白的轉運蛋白)的話，所述轉運蛋白允許DMAE或(在優選的膽堿酯合成中)膽堿容易通過細胞膜。某些適當的膽堿轉運蛋白形式的膽堿轉運蛋白實例有氨基酸/膽堿轉運蛋白、膽堿通透酶、膽堿鈉同向轉運活性，例如來自銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1的銅綠假單胞菌膽堿轉運蛋白BetT，或哺乳動物膽堿轉運蛋白，例如人蛋白Q9GZV3高親和力膽堿轉運蛋白，其基因結構參見例如EMBL Genbank中由Wieland等在http//harvester.embl.de/harvester/Q9GZV3.htm或Apparsundaram等，Biochem.Biophys.Res.Commun.276，862-7(2000)或Okuda等，FEBS Lett.484，92-7(2000)提供的序列，或鼠膽堿轉運蛋白，例如鼠密膽堿-3-敏感的膽堿轉運蛋白，其依照Apparsundaram等，Biochem.Soc.Trans.29，711-6，2001克隆，或鼠Slc5a7、rattus Cht1；昆蟲膽堿轉運蛋白，例如果蠅CG7708；蠕蟲，例如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)cho-1；或微生物膽堿轉運蛋白，例如高親和力膽堿轉運蛋白、其來源于大腸桿菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、Oceanobacillus iheyensis、銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、地毯草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)或百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)，來源于谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，參見序列http//66.93.129.133/transporter/wb/downloads/tree/faa/BCCT.faa，或來源于淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，參見http//www.stdgen.lanl.gov/cgi-bin/gene_id_search.cgi？dbname＝ngon&gene_id＝NG0529。在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，膽堿通過一個單獨的高親和力轉運蛋白Hnm1p進入細胞。缺失HNM1基因的hnm1Δ細胞仍可存活(參見例如Zufferey等，Reexamining the Role of Transporter-Like(Ctlp)Proteins in Choline Transport，Neurochemical Research29(2)，461-467(2004))。啤酒糖酵母中的膽堿轉運蛋白的進一步描述由Hosaka等，J.Bacteriol.143(1)，176-181(1980)提供。流感嗜血菌轉運蛋白的描述由Fan等在“Multiple Mechanisms for CholineTransport and Utilization in Haemophilus influenzae”，Mol.Biol.50(2)，537-548(2003)中提供。Canovas等在“Osmoprotectants inHalomonas elongateHigh Affinity Betaine Transport System andCholine-Betaine Pathway”，J.Bacteriol.178(24)，7221-7226(1996)中闡述了膽堿轉運進入伸長鹽單胞菌(Halomonas elongate)細胞以有利于該生物的滲透保護(osmoprotection)。大腸桿菌中的膽堿H+同向轉運蛋白，命名為BetK aka B0314，是已知的，而EP 1 236 739描述了被鑒定為59914和59921的膽堿轉運蛋白及其用途。這些活性是，如果不是已經存在，優選通過含適當核酸的各自微生物的轉化整合的，所述核酸包含一個或多個編碼并表達負責所述轉運蛋白活性的多肽和蛋白的片段。
在需要時，同樣存在產物(DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿)的轉運蛋白分子，其或者已經是所采用的生物的自然裝備的部分或者是基因重組和轉化的結果。
可選擇地，可以利用具有透化的細胞膜(例如通過如上所述的表面活性劑或孔蛋白)的細胞，或可以組合透化和轉運蛋白的存在。
如果基本上完整的生物或細胞作為生物催化劑使用，例如在發酵過程中，則需要添加較低(通常指僅僅最小量的或沒有)的輔因子，從而這是本發明特別優選的實施方案(盡管有時需要提供營養物，包括在所述輔因子的生物合成中有用的前體或維生素)。原因之一是細胞能夠再循環并且有時甚至能夠自身合成所需輔因子(例如ATP、NAD(P)+、NAD(P)H、FAD、FADH、輔酶A)。
然而，生物/細胞通常對高濃度的有機底物反應非常敏感(底物或產物抑制、溶劑鈍化)。因此，在必須使用特殊溶劑時或者底物或產物可能導致反應速度或產量降低時，部分純化系統的使用也是有利的，這形成本發明的不同的實施方案。對于部分純化，將細胞破壞，且在需要時去除細胞碎片并獲得無細胞提取物。
選擇這樣的優選的發酵時間以達到關于所需生物催化劑(例如膽堿乙酰轉移酶)活性的最佳條件。例如，當細胞密度達到足夠的值時，停止培養。用已知方式分離培養肉湯，例如通過離心，并用常規方式分解沉淀的細胞，例如通過與精制的特殊材料如玻璃珠一起振蕩，通過超聲波處理，利用勻漿器、攪拌器或弗氏壓碎器等。不能溶解的細胞成分以及，如果使用了，特殊材料例如玻璃珠等，被任選去除，例如，通過離心或過濾，而無顆粒和細胞碎片的殘余物被當作生物催化劑活性的來源(粗提取物)使用。根據本發明，作為包含生物催化劑活性的粗提取物的殘余物可以直接應用于方法中。然而，有利地，為了去除核酸(粘性溶液)以及其他雜質或干擾成分(例如抑制劑或干擾酶活性等)，對粗提取物實施進一步純化以獲得在本發明中有用的更純化(更濃縮的)形式的生物催化活性。優選地，對細胞粗提取物實施一個或多個同樣地本領域已知的純化步驟，以便從提取物中去除干擾成分。
術語“純化的”是指優選“以至少部分純化的形式”(＝“以濃縮的形式”)或者，更優選地，在更嚴格意義上純化，即，以實際上分離的形式(例如在分離的蛋白的情況下，例如膽堿乙酰轉移酶或S-乙酰輔酶A合成酶)，尤其是與其他存在的寡肽或多肽相比按重量計純度超過50，最尤其是超過95％)。
進一步，本發明涉及所述的生物在生產一個或多個所需的生物催化劑，尤其是具有膽堿乙酰轉移酶或可選擇地或另外具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑中的用途，其(此處與本公開內容中所有其他提及生物的地方一樣)可以優選為上文提及的GMO，例如(優選轉化的)植物或植物部分或植物組織或昆蟲細胞或尤其是微生物，尤其是細胞，更尤其是適用于各自重組遺傳材料的宿主細胞(例如細菌，如大腸桿菌、乳克魯維氏酵母(K.lactis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)、丙酸梭菌、運動發酵單孢菌(Zymomonas mobilis)、芽孢桿菌屬物種(Bacillus spp.)或凝結芽胞桿菌(Bacilluscoagulans)，適用于極端(例如溫度和/或pH)條件的例子有古細菌(archebacteriae)，酵母或其他真菌，例如啤酒糖酵母、克魯維氏酵母屬物種(Kluyveromyces spp.)、畢赤氏酵母屬物種(Pichia spp.)、漢遜氏酵母屬物種(Hansenulo spp.)、假絲酵母屬物種(Candidaspp.)、絲孢酵母屬物種(Trichosporon spp.)或Yamadazyma spp.)，其用適當的核酸轉化，所述生物催化劑隨后可在根據本發明合成DMAEA、DMAEMA和/或尤其是丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿的制造方法(體外、體內或組合的)中使用。
除非已經在上文或進一步在下文中另外指出，本發明說明書中使用的進一步的一般術語、符號和名稱優選具有下列含義(其中更具體的定義在每個單獨的情形中或組合地可以用于替代較普遍的術語以定義本發明更優選的實施方案，關于已經在上文中給出的一般術語、符號和名稱及其解釋或優選含義同樣如此)術語“生物催化劑”，例如在“有(＝具有)膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑”或“有(＝具有)S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑”中，用于本文時，涉及具有各自的(例如膽堿乙酰轉移酶或S-乙酰輔酶A合成酶)活性的生物催化劑，尤其是酶，最優選多肽，其具有所述活性，例如最尤其是來源于大鼠的膽堿乙酰轉移酶，如下文所述，或S-乙酰輔酶A合成酶(乙酰輔酶A合成酶)，如下文所述。如果沒有另外說明，所有這些術語都不僅包括本發明多肽的自然發生的、“真實的”序列，這是本發明優選的實施方案，而且還包括所有的突變、變異及其抑制各自的(例如膽堿乙酰轉移酶)活性的片段，優選具有其所來源的天然的(親本)酶至少10％的相對活性。
“具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑”尤其指相應的生物催化劑，優選酶，在用于測定膽堿乙酰轉移酶活性的標準測定系統中是有活性的，所述膽堿乙酰轉移酶催化乙酰輔酶A與膽堿反應成乙酰膽堿和游離的輔酶A。一個適當的測試系統是Berry和Whittaker，Biochem.J.73，447-458(1959)采用的。在本發明此處或在至少一個后續測定中有用的生物催化劑有利地顯示了超過每mg蛋白0.01納摩爾/分鐘的活性，更優選每mg蛋白0.1納摩爾/分鐘，再更優選每mg蛋白0.4納摩爾/分鐘。其他測定酶活性的方法(這些方法同樣適用于膜結合或相關的酶的情況下，例如，測量勻漿物)是已知的，例如利用14C標記的乙酰輔酶A，參見例如Fonnum，F.，Biochem.J.115，465-79(1969)或Fonnum，F.，J.Neurochem.24，407(1975)，或Rylett等J.Neurochem.45，611-20(1993)，例如測定在40μl反應混合物中37℃的初始反應速度，所述反應混合物含有5-1200μM[1-14C]乙酰輔酶A(Amersham)、0.1-3.5mM膽堿、0.2-10ng具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑、50mM磷酸鈉(pH 7.4)、250mM NaCl、1mM EDTA和0.5mg/ml BSA(參見Ohno等，Proc.Natl.Acad.SciUSA98(4)，2017-22(2001))。在一個優選的示例性方法中，為了測試用于合成目的的生物催化劑的有效性，例如首先利用其天然底物乙酸鹽來測定待測的生物催化劑的膽堿乙酰轉移酶活性。隨后在pH 7.46的緩沖液(1.1mM Na2HPO4/0.7mM NaH2PO4)中制備7mM膽堿鹽酸鹽溶液。膽堿溶液(3ml)在37℃溫育15分鐘。添加乙酰輔酶A(2mg，2.5微摩爾)和0.1ml pH 7.4膽堿乙酰轉移酶或待測的生物催化劑(例如對于乙酸鹽具有例如大約5.5-20納摩爾/分鐘的活性)并隨時間推移測量吸光度。反應完成時，將反應混合物冷凍保存直至利用離子層析(IC)進行分析。在Dionex DX-300儀器上進行IC分析，所述儀器具有IonPac CS12A柱、90％的20mM甲磺酸/10％的90％(v/v)乙腈水溶液的流動相和電導率檢測(CSRS autosuppressionexternal water mode陽離子再生系統)。435分鐘后，可以發現0.10mM的乙酰膽堿以及具有假定的初始活性為20納摩爾/分鐘的酶。在這些條件下具有足夠活性的生物催化劑應該，在這個測試系統中，有利地提供超過0.02mM的乙酰膽堿。更優選地，在任何采用的具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑的乙酰輔酶A活性測試系統中，該生物催化劑在本發明的過程或方法中特別有用，關于甲基丙稀酰輔酶A或優選丙稀酰輔酶A的活性應該超過10％，再更優選超過50％。具有膽堿乙酰轉移酶活性的酶的實例為來源于智人，或其他脊椎動物，例如小鼠或尤其是大鼠，或更普遍的是來源于其他后生生物的酶。此處同樣包括重組的膽堿乙酰轉移酶，例如有利地重組的大鼠膽堿乙酰轉移酶AG220，其來源于Chemicon International Inc.，Temecula，California，等。
“具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑”尤其指相應的生物催化劑，優選酶，在用于測定乙酰輔酶A合成酶活性的標準測定系統中是有活性的。例如，下列監控AMP形成的偶聯酶測試可以用于測定乙酰輔酶A合成酶的活性測定由ATP(2.5mg，5×10-3mmol)、輔酶A(0.46mg，6×10-4mmol)、MgCl2(4mg，2×10-2mmol)、磷酸烯醇丙酮酸(0.19mg，9.4×10-4mmol)、KCl(1.2×10-4mmol)、NADP(0.25mg，3.6×10-4mmol)、乙酸(10-1to 10-4mmol)、乙酰輔酶A合成酶或待測的生物催化劑(優選以大約0.5單位的活性)、丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶(1單位)、肌激酶(1單位)組成，并用Tris緩沖液(0.25M，pH 7.2)將總體積補充至1ml。通過觀察由于NADH氧化為NAD+在340nm吸光度的降低來監控反應。通過Linewaever-Burk和Eadie-Hofstee作圖計算出Vmax和結合常數。其他測定方法是可能的，例如利用經蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合成酶與NAD+的還原偶聯的乙酰輔酶A的形成，例如，如Cai等，J.Bacteriol.182，2113-8(2000)或Charles等，Genetics 146，9877-82(1997)所述。特別優選的是由Sigma采用的檢測膽堿乙酰轉移酶活性的方法，它是對Berg，P.，J.Biol.Chem.222，991-1013(1956)所描述方法的改良此處，用羥胺將形成的乙酰輔酶A轉化成乙酰-NHOH。乙酰NHOH隨后與FeCl3溶液混合以產生褐色的產物，隨后在546nm、1cm光程測量所述產物吸光度。簡言之，反應混合物(每小瓶1.10ml)的最終測定濃度是136mM磷酸鉀、4mM氯化鎂、9.1mM ATP、45mM氟化鉀、9.1mM乙酸鉀、9.1mM還原型谷胱苷肽、0.35mM輔酶A、182mM羥胺以及0.02-0.04單位S-乙酰輔酶A合成酶，后者在37℃剩余溶液平衡后以0.1ml的體積添加。pH為7.5。添加酶后，將混合物立即混合并溫育20分鐘。之后，添加2ml的370mM FeCl3/3.3％三氯乙酸溶液，隨后混合并轉化和轉移至測量杯中。在空白樣品中，沒有乙酰輔酶A。優選地，在本發明前述的測定系統中有用的具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑具有的活性為每mg蛋白超過0.0005單位，更優選為每mg蛋白0.001至，例如，15單位，1單位被定義為37℃和pH 7.5時每分鐘由乙酸鹽、ATP和輔酶A形成1.0微摩爾S-乙酰輔酶A的生物催化劑的量。為了測試制備規模的輔酶A合成酶的活性，反應(例如在7ml規模)可在10.8mM磷酸鈉/1.4mM氫氧化鈉緩沖液中起始和進行如下制備7.4mM的乙酸鈉和0.75mM輔酶A溶液并在37℃溫育15分鐘。添加S-乙酰輔酶A合成酶，其或者來自Sigma，產品目錄編號A 1765，來源于面包酵母，或者是待測的生物催化劑(例如0.2mg)以及28.4mg ATP。混合物(pH大約為7.36)隨后在石英杯中37℃溫育并隨時間推移測量混合物在232nm的吸光度。例如，在本測定中發現初始活性大約為每分鐘形成1-600納摩爾乙酰輔酶A或更多。如實施例中所述可以有利地顯示用于(甲基)丙稀酰輔酶A制備類型的優選活性(作用如同(甲基)丙烯酰輔酶A合成酶活性)。優選地，在至少一個用于測定具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑形成乙酰輔酶A活性的測試系統中，該生物催化劑在根據本發明的過程或方法中特別有效，在丙烯酸鹽或甲基丙烯酸鹽存在的情況下形成甲基丙烯酰輔酶A或優選丙烯酰輔酶A的S-乙酰輔酶A合成酶的活性應該超過10％，再更優選超過50％。具有乙酰輔酶A合成酶活性的酶的實例為來源于酵母，例如面包酵母(例如從Sigma或Roche可得到)，來源于細菌，例如腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)，來源于高等動物，例如牛的心臟或鴿子的肝臟，或植物的乙酰輔酶A合成酶。
提到酸時，這是意指包括游離酸及其鹽兩者，或其混合物，例如金屬鹽或銨鹽等。在本公開內容中酸通常是指以相應陰離子的形式，例如為丙烯酸鹽或乙酸鹽。
“(甲基)丙烯酰”指丙烯酰和/或甲基丙烯酰。本發明優選涉及制造甲基丙烯酰膽堿或尤其是丙烯酰膽堿(后者也可稱為丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯的N-甲基化季鹽)以及相應的前體，例如甲基丙烯酰輔酶A或尤其是丙烯酰輔酶A。
DMAE(M)A指丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯。
本公開內容中提到膽堿、丙烯酰膽堿或甲基丙烯酰膽堿時，這是意指包括游離的“”離子(帶有正電荷的氮)或帶有相反離子的完全的鹽形式，或適當時兩者。
DMAE以及DMAE(M)A可以以游離形式和/或(酸加成)鹽形式存在，提及DMAE、2-(N，N-二甲氨基)乙醇、DMAE(M)A或丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯時包括其任何一種或兩種形式。
例如，鹽可以是方案II中提及的帶有陰離子的鹽，那些相應酸的酸加成鹽。
本發明進一步優選的實施方案在本發明進一步優選的實施方案中，本發明涉及DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿(非常優選)和/或甲基丙烯酰膽堿(優選)的制造過程或方法，其包括在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下DMEA和/或膽堿(優選)與丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A在體外發生反應。可選擇地，相應的過程或方法優選發生在體內。同樣，相應的過程或方法優選部分發生在體外，部分發生在體內(例如其中首先在體內形成(甲基)丙烯酰輔酶A，隨后(例如細胞破壞后)在體外在膽堿乙酰轉移酶活性存在的情況下(甲基)丙烯酰輔酶A被用于合成DMEA(M)A和/或(甲基)丙烯酰膽堿，從而形成了本發明優選的實施方案。
本發明另一個優選的實施方案涉及所述過程或方法，其中具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑在生物內，尤其是(更優選至少在其部分生命周期內為單細胞)微生物，優選如上定義的GMO。在再一個進一步的實施方案中，所述生物是完整的(尤其是如上定義至少存活的)，在另一個實施方案中生物是破壞的或透化的。
再一優選的實施方案涉及上述任何過程或方法，其中具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑以至少部分純化的形式存在。
在本發明的再一優選的實施方案中，上述過程或方法其中在能量提供物質，尤其是ATP，以及具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑存在的情況下通過使輔酶A與丙烯酸鹽和/或甲基丙烯酸鹽反應獲得丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A。優選地，兩個反應發生在單罐內，優選在至少部分重疊的時間段內，最優選同時。可選擇地，優選發生單罐反應，從而由具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑催化的反應首先發生并且利用具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑使可得到的產物((甲基)丙烯酰輔酶A)隨后通過與游離的和/或鹽形式的DMAE和/或(優選)膽堿鹽反應而轉化為DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿(非常優選)和/或甲基丙烯酰膽堿(優選)。
更優選的是上述和下述的所有過程和方法，其中生物催化劑是酶，尤其是多肽，其具有各自的活性。
再更優選的是上述和下述的任何過程或方法，其中(甲基)丙烯酰輔酶A由代謝產生，尤其是來自一個或多個來自生物量的原材料(尤其是如上所述)。
非常優選的是上述或下述的任何過程或方法，其中甲基丙烯酰輔酶A和/或(優選)丙烯酰輔酶A的產生代謝地發生(例如來自游離的甲基丙烯酸鹽和/或丙烯酸鹽或經其他代謝前體，例如乳酰輔酶A)，并且在膽堿和/或DMAE和/或鹽形式的DMAE存在的情況下，或在每種情況下用于其生物合成的原材料來自生物量，利用具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑，通過優選在基因修飾生物(GMO)中進行向產物的轉化，所述生物只要必要或需要，被修飾至含有所需生物催化活性，尤其是膽堿乙酰轉移酶活性以及，需要時，轉運蛋白。優選地，這個過程發生在體內。
關于用一個或多個核酸轉化的GMO，所述核酸包含一個或多個編碼并允許具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑表達的片段，本發明優選涉及此類GMO，其為昆蟲，昆蟲組織或優選昆蟲組織；植物或植物組織；或優選(至少在其部分生命周期內為單細胞)微生物，尤其是原核的或真菌微生物，最優選細菌或酵母，其中包含一個或多個編碼具有膽堿乙酰轉移酶活性的片段的核酸是重組核酸。
更優選的是GMO，其進一步包含(優選重組的)核酸，所述核酸包含一個或多個編碼一個或多個轉運蛋白的片段，所述轉運蛋白適于轉運一種或多種用于生物催化DMAE(M)A(包括游離形式和/或其鹽)和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿合成的原材料進入所述微生物和/或轉運DMAE(M)A和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿離開所述微生物，所述轉運蛋白尤其是DMAE和/或尤其是膽堿轉運蛋白，更尤其是如上更詳細定義的一種轉運蛋白。
再更優選的是在上面任何一段所描述的GMO，其中進一步存在一個或多個核酸，所述核酸包含一個或多個編碼具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑的片段，一個或多個(在一個優選的實施方案中也為重組的，在另一個實施方案中為內源的)核酸，所述核酸包含一個或多個編碼并允許S-乙酰輔酶A合成酶表達的片段。
本發明尤其涉及為了合成丙烯酰-或甲基丙烯酰輔酶A以及DMAEA、DMAEMA、丙烯酰-或甲基丙烯酰膽堿的目的在實施例和/或其中所述的過程和反應條件中提及的酶的用途。
實施例下列實施例用于闡明本發明而不限制于其范圍內。H-輔酶A指游離形式的輔酶A(具有SH基團)，輔酶A相應的基團通過-S-結合而沒有氫。
實施例1在膽堿乙酰轉移酶和S-乙酰輔酶A合成酶存在的情況下在體外合成丙烯酰膽堿a)補料分批制備丙烯酰輔酶A由丙烯酸鹽和H-輔酶A在3.5ml體積中制備丙烯酰輔酶A的起始反應混合物在3.3g/100ml TRIZMA氫氯化物(三(羥甲基)氨基甲烷氫氯化物，Sigma)和0.49g/100ml TRIZMA堿中進行反應(37℃ pH 7.12)。反應混合物的其他成分如下
添加S-乙酰輔酶A合成酶(乙酸硫激酶來源于面包酵母，Sigma，Saint Louis，Missouri，美國；產品目錄編號1765)(1.9mg/ml)。利用補料分批的方式即逐步地添加(給料)H-輔酶A，在5、10、15和20分鐘后添加15μl等分試樣的H-輔酶A，從而使H-輔酶A濃度每次升高1mM，并在25分鐘后進一步添加5mM ATP。通過HPLC(使用儀器Agilent Technologies HP1090L帶有HP1100可變波長UV檢測器以及Chemstation(rev.A.06.01)數據系統；柱Luna C18來自Phenomenex，25cm×4.6mm內徑，珠直徑5μm(No.92)；流動相A25mM甲酸銨(pH 7.0)，B甲醇；梯度5％B 0分鐘，隨后到30％B 20分鐘；流速1ml/分鐘(大約130巴)，烘箱溫度40℃，檢測器UV于210nm；注射體積5μl，運行時間28分鐘；在下列保留時間發現峰ATP在大約3.710分鐘，輔酶A在大約10.554分鐘，乙酰輔酶A在大約14.457分鐘，丙烯酰輔酶A在大約17.500分鐘，雙加合物在大約15.993分鐘)分析樣品的H-輔酶A。當檢測不到H-輔酶A時，80、95、110和120分鐘后進一步添加15μl等分試樣的H-輔酶A，從而將H-輔酶A濃度又每次升高1mM。145和155分鐘后進一步添加15μl等分試樣的H-輔酶A，并在150分鐘后添加足夠的ATP以將濃度升高5mM。
150分鐘后添加了足夠的H-輔酶A，這在沒有反應發生時，將使反應混合物的濃度升高至10mM。到此時反應混合物中積累了濃度為1.52mM的丙烯酰輔酶A和0.47mM的雙加合物并且利用上述HPLC法檢測不到輔酶A。組合的丙烯酰輔酶A和雙加合物混合物中丙烯酰輔酶A的相對量為76.5％。通過LC/MS使用內徑為2.0mm的柱，流速為0.2ml/分鐘，利用Finnigan LCQ質譜儀以電霧化電離方式確認丙烯酰輔酶A和雙加合物的存在。
b)補料分批制備丙烯酰膽堿將1.6ml上述反應混合物的樣品添加到22.4mg膽堿鹽酸鹽(100mM)中。反應混合物在37℃短暫溫育并且通過添加4μl的2M NaOH將反應混合物的pH從pH 6.44調整為pH 7.25。取出0.3ml反應混合物的樣品并添加40μl膽堿乙酰轉移酶(重組的大鼠膽堿乙酰轉移酶AG220批號2103 1042，Chemicon International Inc.，Temecula，California)。1.75小時和3小時后取樣(0.5ml)。在帶有數據系統軟件AI-450 v3.3的Dionex DX-300離子層析儀上利用離子層析直接分析樣品，其中使用帶有IonPac CG12A Guard柱(4×50mm)的DionexIonPac CS12A陽離子交換柱(4×250mm)，流動相(v/v)90％的20mM甲基磺酸水溶液/10％的90％(v/v)乙腈水溶液，檢測系統(抑制的電導率檢測，陽離子自身再生抑制器(CSRS-Ultra)處于autosuppression external water wode，Dionex Corporation，Sunnyvale，California/美國)。
當反應混合物與膽堿乙酰轉移酶一起溫育1.75小時時，出現了一個峰(保留時間大約11-11.5分鐘)，利用所述離子層析鑒別所述峰為丙烯酰膽堿。來自這個峰的丙烯酰膽堿估計濃度為0.14mM。因此估計的摩爾得率(基于起始的丙烯酰輔酶A)為35％。
權利要求
1.丙烯酰膽堿、甲基丙烯酰膽堿、丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(DMAEA)和/或甲基丙烯酸2-(N，N-二甲氨基)乙酯(DMAEMA)的制造方法，所述方法包括在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下使膽堿和/或2-(N，N-二甲氨基)乙醇與丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A反應。
2.根據權利要求1的方法，其在體外進行。
3.根據權利要求1的方法，其在體內進行。
4.根據權利要求1的方法，其部分在體內且部分在體外進行。
5.根據權利要求1的方法，其中所述生物催化劑在生物內，尤其是(更優選至少在其部分生命周期內為單細胞)微生物。
6.根據權利要求5的方法，其中所述生物是完整的。
7.根據權利要求5的方法，其中所述生物是破壞的。
8.特別根據權利要求1、2、4或7的方法，其中具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑以至少部分純化的形式存在。
9.根據權利要求1-8中任何一項的方法，其中在能量提供物質，尤其是ATP，以及具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑存在的情況下，通過使輔酶A與丙烯酸鹽和/或甲基丙烯酸鹽反應獲得丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A。
10.根據權利要求9的方法，其中由具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑催化的反應和由具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑催化的反應發生在單罐內，優選在至少部分重疊的時間段內，最優選在相同的時間段內。
11.根據權利要求10的單罐方法，其中由具有S-乙酰輔酶A合成酶活性的生物催化劑催化的反應首先發生，而可得的產物利用具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑隨后轉化為丙烯酰-和/或甲基丙烯酰膽堿。
12.根據權利要求1-11中任何一項的方法，其中所述生物催化劑是酶，尤其是具有各自活性的多肽。
13.根據權利要求1-12中任何一項的方法，其中(甲基)丙烯酰輔酶A前體由代謝產生，尤其是來自一個或多個來自生物量的前體。
14.根據權利要求1-13中任何一項的方法，其中甲基丙烯酰輔酶A和/或(優選)丙烯酰輔酶A由代謝產生，并且在膽堿和/或DMAE和/或鹽形式的DMAE存在的情況下，或在每種情況下用于其生物合成的原材料來自生物量，利用具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑，通過優選在基因修飾生物(GMO)中進行向產物的轉化，所述生物只要必需或需要，被修飾至包含所需的生物催化活性以及，如果需要，轉運蛋白。
15.基因修飾生物(GMO)，其用一個或多個核酸轉化，所述核酸包含一個或多個編碼并允許具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑表達的片段。
16.根據權利要求15的GMO，其是昆蟲、昆蟲組織或昆蟲細胞；植物或植物組織；或優選(至少在其部分生命周期內為單細胞)微生物，尤其是原核的或真菌微生物，最優選細菌或酵母，其中包含一個或多個編碼具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑的片段的核酸是重組核酸。
17.根據權利要求15或16中任何一項的GMO，其進一步包含(優選重組的)核酸，所述核酸包含一個或多個編碼一個或多個轉運蛋白的片段，所述轉運蛋白適于轉運一種或多種用于生物催化DMAE(M)A(包括游離形式和/或其鹽)和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿合成的原材料進入所述微生物和/或轉運DMAE(M)A和/或優選(甲基)丙烯酰膽堿離開所述微生物。
18.根據權利要求17的GMO，其中轉運作為(甲基)丙烯酰膽堿原材料的膽堿的轉運蛋白是膽堿轉運蛋白。
19.根據權利要求15-18中任何一項的GMO，其中進一步存在一個或多個核酸，所述核酸包含一個或多個編碼具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑的片段，一個或多個核酸，所述核酸包含一個或多個編碼并允許S-乙酰輔酶A合成酶表達的片段。
20.根據權利要求15-19中任何一項的GMO在制造DMAEA、DMAEMA、丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿中的用途，其包括向所述微生物的培養物施用一個或多個適當的來自生物量的原材料以及分離所得到的產物。
21.具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑在實現甲基丙烯酰和/或丙烯酰部分從甲基丙烯酰和/或丙烯酰輔酶A到2-(N，N-二甲氨基)乙醇，或其鹽，和/或膽堿的轉移中的體外和或體內用途。
全文摘要
合成丙烯酸和/或甲基丙烯酸的2－(N，N－二甲氨基)乙醇酯和/或膽堿酯的生物催化方法，即丙烯酰膽堿和/或甲基丙烯酰膽堿的制造方法或過程，其包括在具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑存在的情況下，使2－(N，N－二甲氨基)乙醇和/或膽堿與丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A反應，其中優選在能量提供物質以及具有S－乙酰輔酶A合成酶活性(乙酰輔酶A合成酶活性)的生物催化劑存在的情況下，通過使丙烯酸鹽和/或甲基丙烯酸鹽與輔酶A反應形成丙烯酰輔酶A和/或甲基丙烯酰輔酶A；涉及(特別是轉化的，即基因修飾的)具有膽堿乙酰轉移酶的活性并優選另外具有乙酰輔酶A合成酶活性的生物及其在所述過程或方法中的用途；涉及為了制造(甲基)丙烯酸2－(N，N－二甲氨基)乙酯和/或(甲基)丙烯酰膽堿，具有膽堿乙酰轉移酶活性的生物催化劑在實現(甲基)丙烯酰部分從(甲基)丙烯酰輔酶A到2－(N，N－二甲氨基)乙醇和/或膽堿的轉移中的用途；以及涉及如說明書中所述進一步的用途、生物、過程和方法。
文檔編號C12P13/00GK1934262SQ200580008738
公開日2007年3月21日 申請日期2005年3月9日 優先權日2004年3月19日
發明者J·休斯, K·C·賽姆斯 申請人:西巴特殊化學水處理有限公司