專利名稱：用于可尋址的生物化學分析的具有微托板的微圖案化平板的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學分析，更具體地，涉及促進可尋址的生物化學分析的具有微托板(micro-pallet)的微圖案化(micropatterned)平板。
背景常規的系統允許將生物材料放置在表面上的陣列中。通過將材料機械地放置在特定位置(“點樣”)、通過制造用于收集材料的腔(微孔)、通過處理表面的特定區域，或者通過這些方法的組合，可以放置材料。這些技術的大多數對于活細胞的效果不好。一旦放置，對于進一步分析或者處理而言就幾乎永遠不再取出樣品。
通常通過將貼壁細胞鋪平板在表面上然后用顯微鏡尋找它們來對其進行分析。細胞的位置是隨機的，因此發現細胞是費時的過程。為了加速該過程，利用機器視覺的機器人系統有時被用于發現顯微鏡圖像視野內的細胞。在一些情況中，通過下面的方法分離細胞亞群將犧牲基底層放置在平板上。細胞在基底層上生長。用高功率激光通過犧牲層在目的細胞周圍切出圓周。細胞的分離可以通過從犧牲層剝離，或者通過用高功率激光脈沖從平板彈射切割的材料，其攜帶細胞。
用流式細胞儀可以快速分析非貼壁細胞，流式細胞儀將細胞流快速流過檢測器裝置。通過下游靜電系統可以分選目的細胞，所述靜電系統將滴移動到收集容器中。該方法還可以用于其他生物介質，如蛋白質和DNA(如果它們附著到小珠的話)。該方法對于更大的樣品(如多細胞生物)不適用并且難以多路化(multiplex)。
概述本發明提供了平板，其以這樣的方式生產，從而使得細胞、微生物、蛋白質、DNA、生物分子和其他生物介質(這里稱作樣品)可以定位在平板上的特定位置(這里稱作位點)，以便對樣品進行可尋址的分析。此外，根據本發明，從可取出的材料(這里稱作托板)建立一些或者所有位點，從而使得目的樣品的亞群可以容易地與平板分離以進行進一步的處理或分析。該平板可以含有結構或者化學處理，其增強或者促進樣品的附著和/或功能，并且促進或者協助它們的分析。平板還可以含有幫助平板和外部儀器偶聯的結構。平板還可以含有幫助附屬操作，如保持樣品的正確化學條件的結構。
本發明有利地提供了(1)平板，其具有在其上組成圖案的結構(位點)，所述結構意在將樣品附著在已知的位置，(2)結構和平板，它們被處理或者進一步組成圖案以提高對樣品進行分析的能力，(3)位點，其根據需要可以被取出，從而不需要激光切割，并且可以容易收集釋放的樣品，(4)額外的微圖案化部件，如幫助陣列平板的操作的結構元件、電極和光編碼器，(5)將這些位點放置在常規的盒或者盤中，和(6)將這些位點放置在專門的盒或者盤中。同樣，本發明使得能夠提供高速、可尋址的生物和化學樣品分析，以及從大群體的樣品分離樣品亞群的有效方法。
此外，根據下面的詳細描述，本發明的目的和優點將變得顯而易見。
附圖簡述
圖1A是具有一系列微托板的微托板平板。
圖1B是微圖案化平板的側視圖，該平板具有附著到托板特定的可尋址位點的樣品(細胞)。
圖2是微圖案化平板的另一實施方案的側視圖，并且圖解了通過從平板釋放含有樣品的托板對樣品的陽性選擇。
圖3是微圖案化平板的另一實施方案的側視圖，所述平板具有附著到特定可尋址位點的樣品(生物)。
圖4是微圖案化平板的另一實施方案的側視圖，所述平板具有附著到特定可尋址位點的樣品(細胞)。
圖5是是微圖案化平板的另一實施方案的側視圖，該平板放置在多孔板的單個孔的底部，從而允許該平板與常規工具一起使用。
圖6是平板的側視圖，顯示了使用暫時或者永久的分隔器以允許將不同類型或者歷史的樣品放置在平板上不同的位置或者不同的通道內。
圖7A和7B顯示了使用托板平板進行貼壁細胞篩選和培養的方法中的步驟。
圖8A和8B顯示了使用托板平板進行DNA篩選的方法中的步驟。
圖9是用于自動化測定的集成的托板平板盒的透視圖。
圖10A到M顯示了使用集成的托板平板盒進行樣品篩選和培養的方法中的步驟。
圖11是利用包含微托板陣列的微托板盒的高含量篩選和細胞選擇系統的示意圖。
優選實施方案的詳細描述下面公開的額外特征和教導的每個可以單獨或者與其他特征和教導組合用來提供具有微托板的改進的微圖案化的平板，其促進了可尋址的生物化學分析。現在將參考附圖更詳細描述本發明的代表性實例，所述實例利用單獨和組合的許多這些額外特征和教導。這些詳細描述僅僅意在教導本領域技術人員關于實踐本發明教導的優選方面的其他細節并且不意在限制本發明的范圍。因此，下面詳細描述中公開的特征和步驟的組合不一定是在最寬的意義上實踐本發明所必需的，而是僅僅教導用來具體描述本發明教導的代表性實例。
此外，代表性實例和從屬權利要求的各種特征可以以不特別和明確列舉的方式組合，以便提供本發明教導的額外有用的實施方案。此外，明確指出說明書和/或權利要求書中公開的所有特征都意在為了原始公開的目的和為了獨立于實施方案和/或權利要求中特征的組成限制所要求保護的主題的目的，分別和相互獨立地公開。還明確指出實體組的所有值范圍或者示數都為了原始公開的目的以及為了限制要求保護的主題的目的公開每個可能的中間值或者中間實體。
本發明有利地提供了(1)平板，其具有在其上組成圖案的結構(位點)，所述結構意在將樣品附著在已知的位置，(2)結構和平板，它們可以被處理或者進一步組成圖案以提高對樣品進行分析的能力，(3)位點，其根據需要可以被取出，從而不需要激光切割，并且可以容易收集釋放的樣品，(4)額外的微圖案化部件，如幫助陣列平板的操作的結構元件、電極和光編碼器，(5)將這些位點放置在常規的盒或者盤中，和(6)將這些位點放置在專門的盒或者盤中。同樣，本發明使得能夠提供高速、可尋址的生物和化學樣品分析，以及從大群體的樣品分離樣品亞群的有效方法。
本發明的系統有利地提供了可取出的區域，其中可以附著僅僅一個或幾個樣品。這些區域是可尋址的，因為它們的位置是提前已知的。光編碼器、電極等等使得本發明容易偶聯外部儀器，從而使得可以進行高速可尋址的細胞測定。機器可以移動平板以將任何可尋址的位點放置在顯微鏡下。高放大率物鏡可以用于成像，因為僅成像單個位點(與許多細胞的大視野相反)。對于細胞，這使得可以比當前可用的機器更快地分析。
如果將圖案化的系統放置在現有盤或者盒，例如標準多孔板內，那么高通量儀器將從高速細胞分析中受益。可以使用標準移液和處理設備。
系統可以使用附著到表面的分子、化合物、細胞、生物和生物和化學介質，以及不附著到表面的樣品。腔或者其他其他截留裝置可以用于定位非附著的樣品。
本發明的系統還解決了樣品的陽性選擇的問題。陣列上可取出的托板允許人們從平板快速和選擇性取出樣品用于進一步處理。可取出的托板的使用消除了在樣品周圍切割的需要，從而極大地增加了速度和通量，而減小了選擇樣品的復雜性。因為托板排列在平板上，所以可以以與流式細胞儀相當的速度以簡單得多的方式進行高速分析和樣品選擇。
如圖1A中描繪，本發明基本上提供了具有可取出的位點13(稱作托板12)的陣列的平板10。在優選實施方案中，平板10或托板12包括進一步增強平板和托板的操作的修飾。
在優選實施方案中，平板10以這樣的方式生產，從而使得細胞、微生物、蛋白質、DNA、生物分子和其他生物介質(這里稱作樣品)可以定位在平板10上的特定位置(這里稱作位點13)，以便對樣品14進行可尋址的分析。此外，一些或者所有位點13優選從可取出的材料(這里稱作托板12)建立，從而目的樣品14的亞群可以與平板10容易地分離，以進一步處理或者分析。平板可以含有增強或者促進樣品14的附著和/或功能、并且促進或者輔助它們的分析的結構或者化學處理。平板10還可以含有幫助平板10和外部儀器偶聯的結構。平板10還可以含有幫助附屬操作，如保持樣品的正確化學條件的額外結構。
參考圖1B，所描繪的微圖案化平板10包括附著到特定可尋址位點，即托板12的樣品(細胞)14。在該實施方案中，在樣品14快速移動到檢測器16下的位置中時，其他檢測器的顯微鏡16用于將樣品14成像。可以使用其他檢測方案。樣品附著到小的薄托板12，其附著到平板10的位點13。托板12的使用是任選的，但是對于分離單個目的樣品是有益的。托板12可以在以后的時間取出以允許實驗人員分離目的樣品。
如圖1A中描繪的，平板10具有在其表面上制備的位點13的陣列，所述陣列具有優選與平板10的主體材料不同的性質。位點13是區域，預期其足夠小以使得可以在每個位點13截留幾個或者單個細胞、微生物、生物分子或者其他生物或者化學介質(本文稱作樣品14)。
位點13可以由第二種材料構造(本文稱作托板12)，所述材料可以從支持平板10取出，其攜帶樣品14。可以通過多種機制取出托板12從而使得通過取出樣品14的支持托板12而從平板10分離和取出樣品14。通過局部修飾表面化學或者通過物理改變表面來制備位點13。平板10允許單個樣品14，或者少數樣品14在每個位點13收集。然后可以將每個位點13成像，或者用光能或者其他能量(例如，磁、電、機械、熱能)探測以確定在位點13截留的樣品14的性質，或者修飾位點13處的樣品14。此外，含有目的樣品14的位點13可以從平板10取出以與平板10分離用于進一步分析或者處理。托板12還可以含有從平板10取出后幫助托板12移動或者放置的結構。
托板12可以通過任何合適的方式取出。實例方法包括從平板10機械推動或者舉起托板12，使用局部化的熱或者光來改變托板12的粘附性質、使用聲或者機械沖擊將托板12從平板10移去、使用高能量激光脈沖將托板12從平板10移去、改變托板12的電或者磁性質，等等。
轉到圖2，顯示了使用來自激光器18的激光脈沖17取出托板的實例。如所圖解的，通過從平板10釋放含有樣品14的托板12完成樣品14的陽性選擇。如上面指出的，可以使用其他托板釋放方法，包括應用機械、電、熱、光、磁能。釋放的托板12可以向下游流動以用于收集，或者可以通過其他方式(如傾析或者移液)收集。
優選相互靠近地形成位點13，從而平板10可以在分析儀器下移動以快速進行許多位點13的分析。例如，如果位點13相距0.1mm放置，那么可以以50mm/sec移動平板10以每秒分析500個樣品。以各種方法的任一種可以將樣品14附著到位點13。例如，可以允許活細胞在培養基中漂浮直到它們附著到位點。可以洗除剩余的細胞，從而留下可以被快速成像的可尋址的細胞陣列。常規方法，如點樣、絲網印刷、型版噴刷、石印、光操作或者機械附著也可以用于將樣品附著到位點。
位點13可以形成矩形或者其他規則圖案(例如，六角形、圓形、線形等等)，或者可以隨機定向。圖案化的位點可以位于更大的結構內，如在多孔板的底部。圖案化的平板可以允許其他結構放置在其內以促進其他功能，如使用暫時分隔器，其允許不同的樣品引入平板的不同的區域，或者流體結構(例如，通道)，其促進緩沖液流過該位點(如圖3中所圖解的)。
參考圖3，顯示了微圖案化的平板20，其具有附著到特定可尋址的位點23的樣品24(生物)。在該實施方案中，平板20上的3-D結構化的圖案25幫助在特定位點收集樣品24，在那里它們可以直接附著到平板20或者附著到小托板22的每個位點23。
可以修飾表面的物理形狀以增強在位點的捕獲(并且不在非位點)，或者改善分析。例如，可以在柱子的頂部形成位點(見33，圖4)。這提供了非位點在顯微術成像系統的焦點外(見35，圖4)的優點，從而減小了圖像中的背景。其他實例可以包括腔，其將樣品截留在它們內，或者平板上的不傳導區域。
可以將其他部件加到平板以促進其偶聯到外部儀器。例如，在平板上可以包括光編碼器、電極或者磁裝置以促進放置；傳感器可以用于測試生長條件，可以包括基準標記用于光學對準，等等。
在圖4中顯示了一些提到的增強作用。如圖4中描繪的，微圖案化的平板30包括附著到在特定可尋址的位點33的托板32或者柱的樣品(細胞)34。在該實施方案中，當“在焦點中”的樣品34快速移動到物鏡36下的位置中時，用顯微鏡物鏡36將所述樣品成像。其他包括的部件包括圖案化的電極37、圖案化的不傳導區域38和可以用于裂解特定目的細胞的外部施加的電場39。
還可以修飾位點的化學性質以增強位點(并且不在非位點)處的截留，或者改善分析。例如，可以修飾表面化學以便使得一些區域疏水并且其他區域親水，以增強疏水位點上的細胞粘附。表面化學還可以用于使得平板的非位點不傳導并且位點區域可穿透，以提供用于增強的光學成像的局部的孔。
可以在現有工業標準盤和盒內產生位點陣列。例如，可以在多孔板的底部內制造位點，從而為工業標準設備提供高速可尋址的測定(見，例如圖5)。還可以在支架(cartridge)的定制系統內產生位點陣列。定制的支架的實例在圖6中顯示。
如圖5中描繪，微圖案化平板40置于多孔板41的單個孔47的底部，從而允許常規工具與平板40一起使用。微圖案化平板40包括許多托板42，從而形成具有樣品44的許多位點43。緩沖液填充單個孔。
如圖6中描繪，顯示微圖案化平板50包括暫時或者永久分隔器51，其附著到流體蓋子55以允許不同類型或歷史的樣品54放置在平板50上的不同位置。這允許對單個平板進行多路分析。分隔結構51也可以促進緩沖液在樣品區上流動以用于提取釋放的托板52。
轉到圖7A和7B，顯示了使用托板平板進行貼壁細胞篩選和培養的方法中的步驟。該實例圖解了怎樣使用公開的系統以從一大組細胞篩選稀有細胞。例如，可以從患者活組織檢查得到貼壁細胞并用公開的系統搜索和選擇顯示出不尋常的或者惡性行為的細胞。或者可以用希望轉染細胞的DNA載體處理貼壁細胞，并且該系統用于發現和分離正確轉染的細胞。
根據實例方法，根據合適的方案在步驟1預處理細胞60，然后在步驟2將細胞60分散在平板70上，并允許附著到平板70或者托板72的多個位點73上。這可以在如所示的多孔板62或者在單孔板中進行。在步驟3，作為樣品74的細胞附著到平板70或者托板72。因為平板被處理或者圖案化，所以細胞優選附著到特定位置。在步驟4，優選洗滌平板并優選進行其他測定工作以標記目的細胞。在步驟5，通過檢測器76篩選平板以得到關于細胞群體的統計學信息并鑒定目的細胞。在步驟6，將含有目的細胞(樣品74)的托板72a從平板移去(釋放)，優選例如，通過來自激光器78的高能量激光脈沖77來移去。然后在步驟7，從緩沖液收集自由漂浮的托板72a。在步驟8，從釋放的細胞74生長新的細胞培養物。
現在轉到圖8A和8B，顯示了使用用于DNA篩選的托板平板的方法中的步驟。該實例圖解了怎樣使用公開的系統從一大組DNA篩選稀有DNA鏈。例如，可以對DNA平板篩選導致未知疾病的試劑以選擇目的鏈。可以分離目的鏈并進行PCR以擴增它們以用于進一步分析。該方法的步驟如下在步驟1，將平板80用寡核苷酸在特定位點83點樣，所述寡核苷酸作為DNA鏈的靶。還制備寡核苷酸(oligo)作為對照。
在步驟2，根據合適的方案從樣品取得DNA 85，變性并預處理。在步驟3，將DNA 85在平板80上分散并允許與它們在特定位點83的匹配靶雜交。在步驟4，充分洗滌平板以取出未結合的DNA。進行進一步的測定工作來標記目的DNA。然后在步驟5通過檢測器86篩選平板，以用于樣品的統計學分析和鑒定目的DNA。在步驟6，通過來自激光器88的高能量激光脈沖87從平板80移去(釋放)含有目的DNA84的托板82a。在步驟7，從緩沖液收集自由漂浮的托板。在步驟8，從托板變性DNA 84，并用于PCR反應來擴增樣品。
參考圖9，圖解了用于自動測定的集成的托板平板盒90。該實例圖解了怎樣將公開的系統集成到其他系統中以產生自動化的支架系統。如圖9中所示，集成的托板平板盒90包括微托板平板99，其具有在平板99上以三個陣列形成的許多托板92，和流體蓋子91，其在其下側具有小通道95。蓋子91與微托板平板99配合以使緩沖液在托板92上流動。
轉到圖10A到M，顯示了使用微機器化集成的托板平板盒100的方法。盒100包括托板平板109，其優選包括預置的用于細胞培養的可釋放的托板102的陣列，其可釋放地位于由玻璃等等形成的平板109的頂部。優選處理托板102以促進托板102中心的細胞生長。將托板102優選編索引，例如編條形碼，從而使得在使用盒100前知道托板的位置。
在圖10B和10C中，蓋子101蓋在平板109上，露出進入孔107。在圖10D中，細胞在平板109上分散，并且允許附著到平板的特定位點10。然后如圖10E中所示，通過檢測器106篩選平板109，以用于樣品的統計學分析和鑒定目的細胞。如圖10F中所示，通過來自激光器108的高能量激光脈沖從平板109移去(釋放)含有目的細胞的托板102a。如圖10G所示，從緩沖液向平板109的末端收集自由漂浮的托板102a。在圖10H中，通過來自激光器108的高能量激光脈沖從平板109移去(釋放)含有額外的目的細胞的第二個托板102b。如果10I所示，從緩沖液向平板109的末端收集自由漂浮的托板102b。如圖10J和10K中所示，用提取器110通過進入孔107提取托板102a和102b。從釋放的細胞生長新的細胞培養物，如圖10L和10M所示。
如圖12所示，盒170包含由玻璃等等形成的基底或者平板179，和蓋子171。平板169可以包括在平板179上定位的微托板172的陣列-例如，提供500,000(50×50微米)個托板位點。盒170可以與顯微鏡附件150一起使用以用于成像、熒光分析、分選等等。在計算機160上提供的分析軟件可以用于高含量篩選和細胞選擇。托板提取器可以用于從盒170提取所選的托板。
盡管本發明可以進行各種修改，并且其備選形式、特定實例已經在附圖中顯示和在本文中詳細描述。但是，應該理解，本發明不限于所公開的具體形式或方法，相反，本發明覆蓋所附權利要求的精神和范圍內的所有修改方案、等同方案和備選方案。
權利要求
1.用于可尋址的生物化學分析的裝置，其包含平板和位于平板上的可取出的位點的陣列。
2.權利要求1的裝置，其中所述可取出的位點的陣列中的位點是微托板。
3.權利要求1的裝置，其中所述平板經圖案化以形成位點位置的陣列。
4.權利要求1的裝置，其還包含偶聯平板的蓋子。
5.權利要求4的裝置，其中所述蓋子包括流體通道。
6.權利要求1的裝置，其中所述平板在可取出的位點位置上是可穿透的。
7.用于可尋址的生物化學分析的裝置，其包含平板和在平板的表面上制備并且具有與平板的材料不同的性質的位點陣列。
8.權利要求7的裝置，其中所述位點陣列的位點適于截留待分析的樣品。
9.權利要求7的裝置，其中所述位點陣列的位點適于使待分析的樣品能夠附著。
10.權利要求7的裝置，其中所述平板由第一種材料形成并且所述位點由第二種材料形成。
11.權利要求10的裝置，其中所述位點是可取出的微托板。
12.權利要求11的裝置，其中所述平板經微圖案化以在平板表面上形成位點位置的陣列。
13.方法，其包括如下步驟將生物材料的樣品附著到平板上的特定位點，篩選平板以鑒定目的樣品，并從平板上的特定位點移去含有目的樣品的托板。
14.權利要求13的方法，其中所述移去步驟包括將高能量激光脈沖對準特定位點。
15.權利要求14的方法，其還包括收集自由漂浮的托板的步驟。
16.權利要求15的方法，其中所述樣品包括細胞。
17.權利要求16的方法，其還包括從釋放的細胞生長新細胞培養物的步驟。
18.方法，其包括如下步驟將DNA分散在平板80上，將所述DNA雜交并將所述DNA與特定位點上的寡核苷酸靶匹配，篩選平板以鑒定目的DNA，和移去含有目的DNA的托板。
19.權利要求18的方法，其中所述移去步驟包括將高能量激光脈沖對準托板。
20.權利要求18的方法，其還包括用寡核苷酸在特定位點點樣平板以作為DNA鏈的靶的步驟。
全文摘要
一種生產的平板，其使得細胞、微生物、蛋白質、DNA、生物分子和其他生物介質的樣品能夠定位在平板上的特定位置或者位點，以用于對樣品進行可尋址的分析。優選地，一些或者所有位點從可取出的材料建立或者作為托板，從而使得目的樣品的亞群可以容易地與平板分離以用于進一步處理或分析。平板還含有結構或者化學處理，其增強或者促進了樣品的附著和/或功能，并且促進或者輔助了它們的分析。
文檔編號C12M1/14GK101035910SQ200580033695
公開日2007年9月12日 申請日期2005年10月4日 優先權日2004年10月4日
發明者M·巴赫曼, G·-P·李, N·阿爾布里頓, C·辛斯 申請人:加州大學評議會