專利名稱：單抗zub1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種人骨髓間充質干細胞原代細胞的分離純化及體外培養的新方法，該方法應用一種新制備的抗人骨髓間充質干細胞單克隆抗體ZUB1，通過免疫分選的方法有效地從人骨髓單個核細胞中分離純化間充質干細胞，并在體外培養擴增、誘導多向分化。
背景技術：
人骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞，是組織工程和再生醫學理想的種子細胞。在國內外有大量骨髓MSCs基礎及臨床研究的報道，其在干細胞治療的臨床應用中有廣闊的前景。
正常人骨髓中MSCs的含量很低，約104～105個單個核細胞中含有一個MSCs，為得到足夠數量MSCs應用于基礎及臨床研究，需要有效地分離、純化、體外培養擴增MSCs。目前常用的從骨髓中分離MSCs的方案主要有三種①根據骨髓MSCs的底物黏附特性來實現分離的貼壁篩選法；②根據MSCs與其他細胞的密度不同來分離的密度梯度離心法；③根據細胞表面的一些特殊標記，用各種單克隆抗體進行免疫分選，如正向免疫分選、負向免疫分選、以及聯合分選。通過傳統的貼壁培養的方法獲得的人骨髓MSCs原代細胞耗時長、細胞的異質性大，這使MSCs的基礎研究及臨床應用的推廣受到限制。以細胞特異性表面分子為標記通過免疫分選的方法，可有效地富集骨髓中含量極少的MSCs，提高原代培養所得MSCs純度。
以往人骨髓MSCs公認的表型特征不表達造血細胞的表面抗原，CD34、CD45、CD14、血型糖蛋白A(Glycophorin A)、T或B淋巴細胞的表面標志均為陰性；相對特異的表面抗原有SH2、SH3、SH4、STRO-1、CD166等。正向免疫分選的免疫標記多為SH2、STRO-1、低親和力神經生長因子受體(low-affinity nerve growth factor receptor，LNGFR)SH2是以人骨髓MSCs免疫小鼠獲得的單克隆抗體，研究證實SH2識別CD105分子，同時CD105也表達于骨髓單核細胞、有核紅細胞、部分淋巴細胞；STRO-1是以骨髓CD34+細胞免疫小鼠獲得的人骨髓基質細胞新的單克隆抗體，但是通過STRO-1分選的骨髓細胞中含有大量的有核紅細胞和一小部分B淋巴細胞；LNGFR表達于大部分骨髓基質細胞，但LNGFR并非骨髓MSCs特異性標記，其表達于人體多種器官的血管外膜，在骨髓單個核細胞中LNGFR+細胞約為2.3％。骨髓單個核細胞中MSCs含量極低，通過負向免疫分選可以有效地提高分選后細胞中MSCs的含量，有研究者以CD45和Glycophorin A為標記篩選獲得的CD45-Glycophorin A-細胞群成份復雜，仍需進一步純化。因此，上述免疫標記均難以成為直接分選人骨髓MSCs的理想標記。
迄今為止，國內外研究者一直通過多個表面分子聯合標記，并結合細胞的自我更新和多向分化潛能的特性來鑒定人骨髓MSCs，MSCs單一的特異性表面分子仍在探尋中，這給MSCs的分離、純化的實際應用帶來了一定的困難。深入研究人骨髓MSCs的表型特征，將有助于有效地分離純化人骨髓MSCs并進一步培養擴增，以促進其在干細胞治療領域的臨床應用。采用雜交瘤技術研究制備的新的抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1，通過免疫細胞化學及免疫熒光染色檢測證實ZUB1與人骨髓MSCs結合的陽性率均大于99％，傳代培養的MSCs穩定表達ZUB1抗原；ZUB1與人骨髓來源的細胞系無交叉反應；除骨髓組織外，ZUB1與人間充質組織和非間充質組織均無交叉反應。ZUB1是針對人骨髓MSCs的新的特異性單克隆抗體，與人骨髓MSCs反應具有高度的特異性和敏感性。
發明內容
本發明的目的是提供一種人骨髓MSCs原代細胞的分離純化及體外培養的新方法，ZUB1抗原穩定表達于人骨髓MSCs原代細胞及體外傳代培養的早期、晚期MSCs，是人骨髓MSCs一種新的理想的標記。本發明通過以下技術方案實現人骨髓MSCs原代細胞的分離純化，即從骨髓懸液中分離得到單個核細胞，用專利申請號為200510061034.2所公開的單克隆抗體ZUB1為標記，通過間接免疫磁珠分選系統正向分選獲得ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs，ZUB1抗原陽性的細胞在體外培養體系中貼壁生長、呈梭形，培養5天左右細胞開始明顯擴增，擴增傳代后細胞表型檢測顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達均為陰性，是均一的人骨髓MSCs。
所述方法中，采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心分離獲得骨髓單個核細胞，用專利申請號為200510061034.2所公開的單克隆抗體ZUB1，抗體亞型為IgG1，與骨髓單個核細胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，離心洗滌后通過免疫磁珠分選系統從骨髓單個核細胞中分離獲得ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs，分別將ZUB1抗原陽性細胞和ZUB1抗原陰性細胞接種于培養皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養液，置于37℃、體積分數為5％CO2培養箱培養，之后每隔3天換液1次。
所述方法中，ZUB1抗原陽性細胞和陰性細胞，經培養3天后接種陽性細胞的培養皿中開始出現梭形貼壁細胞，僅見少量的懸浮細胞，5天后細胞擴增明顯，梭形貼壁細胞增殖呈集落樣分布，培養19～22天貼壁細胞80％～90％融合，細胞形態均一，與成纖維細胞形態相似，排列成漩渦狀、網狀、輻射狀；分選獲得的ZUB1抗原陰性細胞，培養3天后見大量的圓形懸浮細胞，其中有極少量細胞貼壁呈梭形細胞，培養21天后仍見圓形細胞，少量貼壁的細胞較寬大，形態不均一，排列無規則。
本發明方法獲得的人骨髓MSCs具有較好的生長活性及增殖潛能，且細胞傳代過程中ZUB1抗原穩定表達，并可在體外定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經元樣細胞。
本發明的有益效果在于(1)以單一的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB1為標記，通過正向免疫分選可以直接、快速地從人骨髓單個核細胞中分離純化原代MSCs，縮短了原代細胞培養的時間，提高了人骨髓MSCs的分離培養的效率，有效地改善了采用傳統的貼壁篩選法培養原代MSCs耗時長、細胞異質性大的缺陷，并保持原代MSCs的生物學特性，為研究和應用骨髓原代MSCs提供了一個有效的方法。
(2)MSCs在骨髓中的含量極低，以ZUB1為標記通過正向免疫分選可以獲得純度較高的原代MSCs，且具有較高的增殖和多向分化潛能，可在體外傳代擴增，并可定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經元樣細胞，有助于人骨髓MSCs在組織工程、再生醫學中的推廣應用。
(3)ZUB1是一種新研制開發的抗人骨髓MSCs單克隆抗體，以單一的ZUB1為標記通過正向免疫分選可以獲得表型均一的MSCs，單克隆抗體ZUB1相應的膜表面抗原在人骨髓MSCs體外培養傳代擴增過程中穩定表達，為研究該表面分子在MSCs增殖及分化過程中的生物學意義并進一步完善對MSCs特性的認識提供了平臺。
圖1是以抗人骨髓MSCs單克隆抗體ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞和陰性細胞的原代培養。
圖2是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞體外培養擴增第一代和第五代的生長曲線。
圖3是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR及ZUB1抗原表達的流式細胞術分析圖。
圖4是誘導成骨分化后Von Kossa法染色圖。
圖5是誘導脂肪分化后油紅O染色圖。
圖6是向神經元樣細胞定向誘導分化后免疫細胞化學染色圖。
具體實施例方式本發明結合實施例和附圖作進一步說明。
實施例1單克隆抗體ZUB1免疫磁珠法分選原代人骨髓MSCs采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心分離獲得骨髓單個核細胞，用專利申請號為200510061034.2所公開的單克隆抗體ZUB1(抗體亞型為IgG1)與骨髓單個核細胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗(Miltenyi Biotec Inc.)孵育，離心洗滌后通過免疫磁珠分選系統從骨髓單個核細胞中分離獲得ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs，分別將ZUB1抗原陽性細胞和ZUB1抗原陰性細胞接種于培養皿，用含10％(V/V)胎牛血清的低糖DMEM培養液，置于37℃、體積分數為5％CO2培養箱培養，之后每隔3天換液1次。
培養3天后接種陽性細胞的培養皿中開始出現梭形貼壁細胞，僅見少量的懸浮細胞，5天后細胞擴增明顯，梭形貼壁細胞增殖呈集落樣分布，培養21天左右貼壁細胞約80％～90％融合，細胞形態均一，與成纖維細胞形態相似，排列成漩渦狀、網狀、輻射狀；分選獲得的陰性細胞，培養3天后見大量的圓形懸浮細胞，其中有極少量細胞貼壁呈梭形細胞，培養21天后仍見圓形細胞，少量貼壁的細胞較寬大，形態不均一，排列無規則，參見圖1，其中A、B、C分別為陽性細胞培養5天、14天、21天的形態學特征(×100)，D、E、F分別為陰性細胞養5天、14天、21天的形態學特征(×100)。
通過單克隆抗體ZUB1標記的正向免疫分選可以直接地從人骨髓單個核細胞中分離純化原代MSCs，有效地改善了采用傳統的貼壁篩選法培養原代MSCs耗時長、細胞異質性大的缺陷，同時為研究和應用原代MSCs提供了一個有效的方法。
實施例2以ZUB1為標記通過正向免疫分選獲得的陽性細胞增殖能力分析取體外培養傳代的ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs第一代和第五代細胞，按2×104個細胞/孔的密度接種于24孔培養板內，分別培養1、2、3、4、5、6、7、8天，進行細胞動力學分析。培養具有以下共性特征細胞經傳代培養后，10小時左右細胞完全貼壁，細胞形態重新變成梭形細胞；傳代培養潛伏期約為24～36小時；傳代培養對數增殖期約為4～5天；對數增殖期結束后進入平臺期；第五代與第一代細胞的生長沒有顯著差異，參見圖2。以ZUB1為標記通過正向免疫分選獲得的陽性細胞具有很好的增殖活性，在體外培養傳至第十代仍保持梭形的細胞形態。
實施例3以ZUB1為標記通過正向免疫分選獲得的陽性細胞表型特征取體外培養傳代的ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs第一代和第五代細胞，以CD14-FITC、CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC單克隆抗體為探針，用流式細胞儀分析MSCs表面分子的表達。結果顯示CD29、CD44、CD166、CD105(SH2)陽性標記出現單峰，造血細胞分化抗原CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達均為陰性，參見圖3，圖3是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞體外培養擴增至第五代的免疫表型分析。用ZUB1正向免疫分選后陽性細胞表型特征為人骨髓MSCs的表型特征，經體外培養、傳代擴增后第一代和第五代MSCs表面標記表達無明顯差異，參見表1，表明用ZUB1正向免疫分選后陽性細胞為MSCs，是一均質的細胞群。
表1 單克隆抗體ZUB1免疫磁珠法分選獲得人骨髓間充質干細胞的免疫表型(％)
實施例4以ZUB1為標記通過正向免疫分選獲得的陽性細胞多向分化潛能體外培養傳代的ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs接近70％融合時，更換培養液，加入成骨誘導培養液(Stem Cell Technologies Inc.)、脂肪誘導培養液(Stem Cell Technologies Inc.)、神經分化預誘導液(LG-DMEM，20％胎牛血清、1mM硫代甘油)。
經成骨誘導培養6天左右，約50％細胞形態發生變化，由原來的紡錘型變為立方型或多角型，9天后出現鈣化斑點，隨著誘導時間的延長，立方型或多角型細胞以及鈣化斑明顯增加，約12～21天細胞形成廣泛均一的礦化結節樣結構。培養21天后，Von Kossa法染色，可以見到染成棕黑色的細胞外基質鈣鹽沉積，結果參見圖4，是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞體外培養，向成骨定向誘導分化，圖為誘導成骨分化后Von Kossa法染色(×100)。
經成脂肪誘導培養1周后，細胞形態開始變成圓形或多角性，細胞排列無序，可觀察到胞漿中出現高折光性的小脂滴，隨著誘導時間的延長逐漸聚集成大的脂滴。培養21天后，油紅O染色，脂滴為橙紅色，結果參見圖5，是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞體外培養，向脂肪定向誘導分化后油紅O染色(×100)。
經神經分化預誘導24小時后細胞形態未見明顯變化，更換含5mM硫代甘油的無血清LG-DMEM，在誘導后3～5小時中，大多數梭形細胞變為典型的神經元樣細胞，簡單的雙級細胞和復雜的多級細胞均有出現，多個神經元樣細胞突起可相互延伸并形成網狀。免疫組化染色分析，神經元樣細胞的胞體及部分突起神經干細胞標志物Nestin、神經元標志物NSE、神經元標志物NF-M表達陽性、星形膠質細胞標志物GFAP表達陰性，結果參見圖6，是以ZUB1為標記的正向免疫分選后獲得的陽性細胞體外培養，向神經元樣細胞定向誘導分化，其中A、B、C、D分別為誘導神經分化后用免疫細胞化學染色法檢測神經干細胞標志物Nestin、神經元標志物NSE、神經元標志物NF-M、星形膠質細胞標志物GFAP的表達(×100)。
綜上，以單一的抗人骨髓MSCs特異性單克隆抗體ZUB1為標記，通過正向免疫分選獲得的ZUB1抗原陽性的人骨髓MSCs可在體外定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經元樣細胞。
權利要求
1.單抗ZUB1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法，其特征是通過以下步驟實現(1)從骨髓懸液中分離得到單個核細胞，(2)用專利申請號為200510061034.2所公開的單克隆抗體ZUB1為標記，通過間接免疫磁珠分選系統正向分選獲得ZUB1抗原陽性的人骨髓間充質干細胞，(3)ZUB1抗原陽性的細胞在體外培養體系中貼壁生長、呈梭形，培養5天左右細胞開始明顯擴增，擴增傳代后細胞表型檢測顯示CD29、CD44、CD166、CD105陽性，CD14、CD34、CD45、HLA-DR表達為陰性，是均一的人骨髓間充質干細胞，并可在體外定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經元樣細胞。
2.根據權利要求1所述的單抗ZUB1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法，其特征是所述步驟(1)是通過采集健康供者骨髓，肝素抗凝，Ficoll-paque(比重1.077)密度梯度離心分離獲得骨髓單個核細胞；
3.根據權利要求1所述的單抗ZUB1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法，其特征是所述步驟(2)是用專利申請號為200510061034.2所公開的單克隆抗體ZUB1，抗體亞型為IgG1，與骨髓單個核細胞孵育，離心洗滌后加抗小鼠IgG磁珠二抗孵育，離心洗滌后通過免疫磁珠分選系統從骨髓單個核細胞中分離ZUB1抗原陽性的人骨髓間充質干細胞，分別將ZUB1抗原陽性細胞和ZUB1抗原陰性細胞接種于培養皿，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養液，置于37℃、體積分數為5％CO2培養箱培養，之后每隔3天換液1次。
4.根據權利要求1所述的單抗ZUB1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法，其特征是所述步驟(3)分選獲得的ZUB1抗原陽性細胞，經培養3天后開始出現梭形貼壁細胞，僅見少量的懸浮細胞，5天后細胞擴增明顯，梭形貼壁細胞增殖呈集落樣分布，培養19～22天貼壁細胞80％～90％融合，細胞形態均一，與成纖維細胞形態相似，排列成漩渦狀、網狀、輻射狀；分選獲得的ZUB1抗原陰性細胞，培養3天后見大量的圓形懸浮細胞，其中有極少量細胞貼壁呈梭形細胞，培養21天后仍見圓形細胞，少量貼壁的細胞較寬大，形態不均一，排列無規則。
全文摘要
本發明提供一種單抗ZUB1免疫磁珠分選原代人骨髓間充質干細胞的方法，是從骨髓懸液中分離得到單個核細胞，用單克隆抗體ZUB1為標記，通過間接免疫磁珠分選系統正向分選獲得ZUB1抗原陽性的人骨髓間充質干細胞。本發明方法獲得的人骨髓間充質干細胞具有較好的生長活性及增殖潛能，且細胞傳代過程中ZUB1抗原穩定表達，并可在體外定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、神經元樣細胞。本發明提供的是一種較理想的人骨髓間充質干細胞分選純化的方法，提高了原代間充質干細胞的純度及分離培養的效率，有助于間充質干細胞生物學特性的研究及在臨床檢測和應用中的推廣。
文檔編號C12N5/0775GK1865437SQ200610050760
公開日2006年11月22日 申請日期2006年5月12日 優先權日2006年5月12日
發明者黃河, 來曉瑜, 沈建根 申請人:浙江大學