專利名稱：：一種生產生物工程化形式的組織型纖溶酶原激活因子的方法—種^生物工程化形式的組織型纖^ai原g因子&^發8胸域本發明涉及用于^可溶形式的人組織型纖原激活因子變體的重組方法。在該鄉中，內源組織邀纖溶酶原鵬因子的03位蘇氛酸被天門冬繊替換，以出現新的糖Sifc位點。內源組織型纖目原激活因子in位的天門冬鵬被谷氨繊鄉'從而除去N連接糖靴位點。在296-299位，賴氨酸、組氨酸、皿酸和^M酸被四個丙氨酸皿。本發明還涉及編碼組織型纖溶酶原激活因子的核酸序列的從頭合成，將構建的核酸序列轉,感受態細菌并將其亞克隆進哺乳動^ii^體以表達期望的蛋白質。包括與目的基因結合的控制元件的DNA構jt體已被公開。本發明的重^Aia織型纖溶酶原激活因子、及其鹽和功能性衍生物可以構成治療心發作和中風患者的藥物組合物的活性成分。這些組，是本發明的另一個方面。發明背景纖自原激活因子是活tt^T溶酶原以產生絲氨酸蛋白酶活性的纖溶BIC纖維蛋白)的酶。在被研究的纖溶酶原激活因子之中，有,酶、尿'^0人組織型纖溶酶原^因子(t-PA)。這些纖,原^S因子各自的作用機制是不同的。^^酶與纖,原形成復合體而產生纖溶酶活性，尿激H直接剪切纖^il原，而t-PA是與纖維蛋白和纖溶酶原形^H^復雜，在血^fe置處活化纖溶酶原。組織邀纖繊原鵬因子(t-PA)，一種多繊域、糖基化的絲氨酸蛋白私是纖維蛋白特異的纖溶酶原激活因子和非常有效的溶栓劑。t-PA是一種重組蛋白，主要應用于心臟病發作和中風患者。最早于1979年，就將娜述為一種重要和有效的治療各種血管疾病的生物藥物，因為它的高纖維蛋白##性和體內有效的溶解血塊能力。天然t-PA的半衰期大約為6，iEH短。因為它被1^Mi環系統清除，t-PA必^^以蹈iJ離效果。以提高濃度的t-PA織給藥(fiontloadeddosing)顯示出比標準輸注方^快更完全的溶解，而早期的有效性與改善的存活率相關。推射可以進一步提髙溶解速率，因為這樣能使較高濃度的酶快速與目標血^S觸，但是因為清MS過快，天然^tJ生戰wt)t-PA的單一ffi^給藥并不能被普ii^ffl。很多研究者^出了更長半衰期的t-PA品種，鵬t-PA可以推注給藥，但^^i見絕大多數3^體的纖維蛋白t解活性新!顯著下降。這樣，本發明的目的是提供重組方法，用于^在保留全部溶纖活性的同時具有減小的清除速率的^，在t-PA的不同結構域做了系統^研究。i物還對新近形成的血栓有高特異性以及更強的親和力，并且產生較少的循環性纖溶酶。因此，ICH和其它非腦部出血事件的發生率也會更低。織對PAI-I具有抗性并S^低。本發明涉及用于生產可溶形式的人組織型纖，原激活因子變體的重組方法，在該變體中，內源的組織型纖溶酶原^^因子103位的蘇氨酸駄門冬酰胺魏以產生新的糖基化位點。內源的纟Hi尸邀纖娜原麟因子117位的天門冬鵬被谷氨鵬鄉，以去除N驗糖靴位點。在296-299位，賴氨酸、組氨酸、)ItM^和麟酸被四個丙氨酸鄉。本發明一，定方面涉及,組織逸纖溶酶原激活因子的核酸序列的M合成、將構建的核酸序列轉化進感受態細菌并將其亞克fta晡乳動物^載體以^ii期望的蛋白。本發明的再一個方面提供了并入了本發明DNA序列的新的具生物功能的環形質粒DNA載體，以及以所述載ffil定轉化^染的宿主。本發明相^J&提供了生產有用多肽的新方法，包縱有利于夕卜源的、質粒攜帶的DNA膀i汰規模表達的劍牛下培養這類轉化宿主細胞，特別是哺乳動物細胞，^&M培養基、溶胞,鄉鵬組分中分離期望的多肽。附圖和序列詳細說明圖1.編碼組織型纖溶酶原激活因子的未經優化和經密碼子優化形式的DNA核苷,列的Bfl^序子J對比圖2.M合成的TENECTcDNA(^"成的TNK-tPA)與TNK-tPA基因的確，列的序列對比圖3.從頭合成的TENECT-OptcDNA(合成的TNK-tPAOpt)與TNK-tPA-Opt基因的確i^列的序列M圖4:5!i^純化的TENECT、TENECT"Opt和pcDNA3.1D/V5-His的限制性酶切片段o圖5:限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECTD/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECTOpt/V5-His/TNK"tPA"Opt的假定克隆。圖6:使用內部剪切TENECT和TENECTOptcDNA的酶，對PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT"Opt/V5-His/TNK4PA-Opt克隆的限制性酶切分析。圖7.結構圖PcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA圖8.結構圖PcDNA3.1-TENECT"Opt/V5-His/TNK-tPAOptSEQID.Na1.^重組組織型纖^SI原激活因子的1^酸序列SEQID.No.2.綱重組組織型纖鵬原鵬因子的經^f^化形式的蹄鵬列發明詳細說明對于在高等真核系統中表達重組蛋白的幾種方法已有闡述。CHOK1、HEK-293(及其變體)細自達系^L已確立為哺孚,蛋白^ii的t^系統。^^建的^:化、可選標記的選^n基因打ia&高通，選策略的進步使得建立具有高特異性產量的重組細胞系變得比較普通，也節約了培養細M所需的時間。在使用傳統的基于病毒啟動子的^i載體的表達ifc^上的最新ia^^a括使用內部核糖體iaA位點(IRES)序列或可變剪接的柳頃反子^i策略的發展和優化。實施例1綱組織型纖溶酶原激活因亍的DNA序列由從頭合成方法得到。該方法可更有利于就特定細胞系iSt;^的^^W:化。并且，使合成的DNA成為真銜原綠達的對象，提供可分離量的多肽，該多肽表現出天然產生的t-PA的生物爭頓以及t-PA在體內和體外的生鵬性。編碼重組組織型纖溶酶原激活因子的核苷酸序列(TTENECn)如SEQID.No.l中所示。組胃纖,原激活因子的編碼DNA序列中的密碼子已經作為密碼^^^a程的一部分被改變，以鵬在撤BCHOKl和HEK293的哺乳動物細胞系中優化的重組蛋白表達，這些經改變的密碼子用大寫宇母高亮顯示。SEQID.No.2彰$編碼組鄉纖溶酶原鵬因子的經密碼:？^;化的核苷酸序列CTENECT2)編碼組織型纖溶酶原激活因子的未經優化和經密m^c化的核苷,列的TO序列對比如圖1所示。實施例2:確i^^^R型纖溶酶原激活因子的從頭合成的cDNA的真實性商4kM務提供商所提供的從頭合成的cDNA的真實性MilDNA自動測序進行確認的，,結果描述在圖2和3中。實施例3:將TENECT和TENECT-OptcDNAs亞克隆進pcDNA3.1D/V5-His哺乳動物細胞特異表達載體在如預示鵬DNA自動領!l序以^iJE從頭合成的cDNA分子(TENECT和TENECT-Opt)的真實'ft^后，TENECT和TENECT-Opt被分別亞克,哺乳動物細胞特異表達載體pcDNA3.1D/V5-His,生^ffl于轉染的構建體。采用的方法詳述如下A.試劑和酶1.QIAGENOT^鵬劑盒和PCR純化試齊愴2.pcDNA3.1D/V5曙His載體DNA(Invilrogen)酶供應商U/pll.BamHIBangal加GCTei10緩沖液E2.XholBangaloreGenei10緩艦E3.HindmBangaloreGoiei20緩械E4.XholBangaloreGend10緩ME5.T4DNA連接酶Bangal鵬Genei40連接麟沖液所有的反應都按制造商建腿行。在針鵬中，提供的10X^z^沖液都被稀釋成為最終^IX。B.載體和插A^列的限制鵬切步驟^ffi以下的DNA樣^叩艮審勝酶；DNA樣本限制鵬Rxn#l載浙用于TNK-tPA克隆)BamHI/XhoIRxn#2載辦用于TNK-tPA-Opt克隆)Hin孤/Xho1Rxn#3pBSK/TNK-tPA(#5)BamHI/XholRxn#4pBSK/TNK-tPAOpt(#18)HMH/Xhol參限帝,切反應組分終濃度RnMRn3Bnff4將MiS物混合、離心并在37t:孵育2小時。限制鵬切7^由瓊月11鵬電泳分析。觀察到期望的酶切圖譜，其以被切下的約1700bp(對于Rxn弁3和4〉基因片段為特征，并BJd察到約5.5kb的載體骨架片段(Rxn#1和2)。>fTENECT和TENECR)ptcDNAs的約1700bpDNA片Sffla^fflQIAGEN^^提試劑盒的抽提法分別純化。pcDNA3.1D/V5-His哺？L動物表達載體酶切后的約5.5kb載體骨架也用同樣的試劑盒純化。^需cDNA和載體DNA片段的限制騰切和凝^tl取后，各取一份0-2微升)純化DNA樣品用瓊月識電泳檢査純度和完整性，如以下圖4所示C.pcDNA3.1D/V5-His骨架與TENECT和TENECTOptcDNA的^:4體經酶切并魂化的載^f入片段的DNA濃度(參考上面圖4)，連接按以下方式設定_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將S/S鄉和地混合、離心并溫魏育2-3小時。以連接^Z混糊內容物轉化DH10感^^態細胞。D.限制性酶切分析pcDNA3.1-TENECT/V5-HisAMC-tPA和dcDNA3.11>TENECT^Qpt/V5-Hi&nrNK-tPA-Qpt的f^克隆。分別從在錄節青霉素的LB瓊脂糖平板上獲得的克隆中純,粒DNA,并fflil限制自切分析分離的質粒DNA,以確認期望的cDNA插入片段的存在，如圖5所示。按照限制性酶切幾個帶有pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA和pcDNA3.1-TENECTOpt/V5-His/TNK-tPA"Opt的假定克隆后所得到的結果，選出一些表現出期望限制性模式的克隆用于進一步的限第化:tBSM析，該限制性酶切分析使用內部切割TENECT和TENECTOptcDNA的P艮制性酶以產生不同大小的片段，如圖6所示。基于已知的限制性內部位點，大多數選出用于限制性酶切譜分析的PcDNA3.1-TENECT/VS-His/TNK-tPA和PcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK曙tPA^Opt克隆鵬到了預期的片駄小，因此鵬克隆將用DNA測序分析進一步確認。^ffl從頭合成的TENECT和TENECT-OptcDNA構建的重組^ii載體圖如圖7和圖8所示。實施例4:人t-PA構Jt體的保^增殖^f馬人t-PA的cDNA構建體的保存與增殖是在標準細菌iS^中進行。所有克隆時H"油菌(glycerolstock)均維持和保存在-70r。實施例5:CHCMC1細胞中重組蛋白的瞬B寸和穩^ii。使用中國倉鼠卵巢細胞(CHO),—種FDA認可的用于^^治療用蛋白的哺乳動物細胞系，ia行人t-PA的瞬時和穩定表達n瞬時^Ji可用于^i構建體表達和快速^f小量的重組蛋白。頓像體外生測或EUSA等施篩選表達t-PA的穩定轉她選擇驗的生產細胞。同質穩定細胞系可用克降稀釋^擇，然后進fi^擴增和凍存-。^m像Western印跡、ELISA和功能翻瞎方￡12—步分析蛋白^Ei情況。實施例6:重組纟fl^M纖溶酶原^因子的純化按照管理機構指南粒過量表艦需重組蛋白的無污染細胞系之后，純化策略將以步驟經濟、加速上市、可擴展性(scalaMity)、可重現性和最大產品純度為目標，而功能穩定和結構完整為主要目標。為了到達這一效果，可開發帶有過敏常規和切向流過濾)和層析這二者的的組合方案。工藝合^求和驗收標準,究WE3,品中實施。，步驟要求和驗收標準的研究^3品中實施。tam本發明考慮了鵬娜呈中禾鵬身為改辦^^J以下步膝a."(OT常^^切向流步^t粗培養基進行初步純化和^Sb.超漱透wa救基于切向流過銜c.色譜步驟-I:利用肝素、賴氨酸、金屬(銜螯合物Sepharose和固定至Sepharose的多克隆抗體進蹄合層析。更雌的是，在下游單元操作鄉麟酸Sepharose。e.色譜步驟-n:OTDEAE纖維素進行陰離子^M析f.除病毒和無菌過濾g.除去內毒素注意另外，基于流出物的陰離子交船ij，如硫酸cellufine可鵬于工藝污,、內原tt/外來病毒和柱可提取物的選擇性結合。實施例7:鵬生物化學、M和物理化^4確認目標蛋白身份艦二娜甲酸方缺CA)/Bradford染料結合方法測定^"^總蛋白質的回收率-在純化針階段目標蛋白濃度將被例ffl!!l定，測定鵬高特異性和高可靠性的基于酶的^測定技術，比如^OT抗tPA的多克隆7單克隆抗體的捕獲ELISA法，這些抗體以天然的序列t-PA作為標準。在^t步驟后，g進行定性的和目標蛋白特異性western分析。^M反相色譜法、等電點聚焦和雙向繊電泳^i平價純^品。頓遠紫外圓二色譜進行二級結構分析。鵬^fR排阻色譜和MALDI-TOF檢測分子量和低聚狀態。該研究也注意蛋白質與pH和溫度有關的穩定性。權利要求1.一種制備在體內具有生物活性的組織型纖溶酶原激活因子的方法，包括以下步驟(a)在合適的營養條件下培養用分離的DNA序列轉化或轉染的宿主細胞，所述DNA序列選自(i)SEQIDNo.1和SEQIDNo.2中列出的DNA序列，或(ii)與(i)和(ii)中定義的DNA序列或它們的互補鏈在嚴緊條件下雜交的DNA序列；(b)從中分離所述重組組織型纖溶酶原激活因子產物。2.—種制備在體內具有生物學活性的組織型纖溶酶原激活因子產物的方法，包括以SEQID.No.1或2中麻的編碼W^纖溶酶原鵬因子的合成DNA序列轉化宿主細WP從所述宿主細JKm其生長培養基中分離所^物的步驟。3.如權利要求1或2中的方法，其中所述宿主細胞是哺乳,細胞。4.如權利要求1或2的施，其中所述的宿主細胞雌CHOKl細胞。5.—種生產在體內具有治療心臟病發作和中風的生物學性能的可溶形式的組織逸纖,原撒活因子的^，包括以下步驟a)在^i的營^f牛下i^i孚,細胞，^i孚L^^胞包含不同于組織邀纖,原、^S因子的啟^DNA的啟動子DNA,DNA可,b)純,述細]達的所述糖基化的促紅細胞素多肽。6.如權利要求5的方法，其中^M啟動子DNA^毒啟動子DNA。7.—種制備在體內具有生物學活性的組織型纖溶酶原激活因子產物的方法，包括用圖7或8所示的載糊建條化宿主細胞并M^述宿主細鵬其生^^基中分離^組全KM纖^ai原^^因子^的步驟。8.如權利要求7的方法，其中所述載體是哺乳動物細胞特異表達載體，并fiSit^如圖7和8所示的載體。9.—種藥物組，，包含治療有效量的人組織型纖溶酶原激活因子和藥用稀釋劑、佐劑纖體，其中所述織型纖娜原激活因子是從在^^l中生長的哺乳動物細化的。全文摘要本發明涉及用于生產可溶形式的人組織型纖溶酶原激活因子變體的重組方法。在該變體中，內源的組織型纖溶酶原激活因子的103位蘇氨酸被天門冬酰胺替換，以出現新的糖基化位點。內源的組織型纖溶酶原激活因子117位的天門冬酰胺被谷氨酰胺替換，從而除去了N連接糖基化位點。在296-299位，賴氨酸、組氨酸、精氨酸和精氨酸被四個丙氨酸替換。本發明還涉及編碼組織型纖溶酶原激活因子的核酸序列的從頭合成，將構建的核酸序列轉化進感受態細菌并將其亞克隆進哺乳動物表達載體以表達期望的蛋白質。包括與目的基因結合的控制元件的DNA構建體已被公開。在本發明中的重組人組織型纖溶酶原激活因子、及其鹽和功能性衍生物可以構成治療心臟病發作和中風患者的藥物組合物的活性成分。這些組合物是本發明的另一個方面。文檔編號C12N9/72GK101218344SQ200680019092公開日2008年7月9日申請日期2006年5月31日優先權日2005年6月2日發明者V·莫拉瓦拉帕特爾申請人:阿維斯塔金格蘭技術有限公司