處理組織的組合物和方法

專利名稱：處理組織的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及細菌學領域。特別的，發明涉及新的組合物(例如，抗微生物劑)和使用它們處理組織(例如皮膚和其它軟組織損傷)的方法。在一些實施方案中，本發明包含殺死或改變(例如，抑制)微生物種群的生長和毒力。
發明技術 抗生素抗性病原體例如甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和大環內酯抗性釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)和多藥抗性綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的蔓延已經造成對皮膚和軟組織感染的治療越來越困難(Fung et al.，Drugs 631459-80(2003))。
例如，灼傷創面護理中的一個長期問題是發展為微生物感染。人類不是生活在一個無菌的環境中，而是生活在和細菌和其它微生物的共生關系中。完整的皮膚和粘膜表面的作用是維持我們組織和細菌種群之間的一種微妙的平衡。皮膚或粘膜屏障中的任何裂口改變這種平衡，并因此有可能因讓細菌進入到下層的組織并達到臨界數量而引發感染。灼傷外科的主要治療目標之一個是防止感染，并且，如果污染發生了，目標是減少微生物污染使之低于引發并擴散感染所需的臨界數量以下。隨著抗生素的發現，灼傷感染看似得到控制。但是，已經發現細菌能夠并確實已經通過發展抗性戰勝了抗生素。細菌的抗性菌株的出現已經成為許多基于醫院的感染的主要來源，并且給灼傷外科醫生帶來重大的臨床難題。
抗生素抗性問題影響所有類型的細菌感染，包括但不限于皮膚和軟組織感染。有許多致病性微生物抗生素抗性迅猛上升的例子。在德克薩斯州科珀斯克里斯蒂城(Corpus Christi，Texas)的一個醫院中，社區獲得性甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)(多見于皮膚和軟組織感染)，從1990年的3％緩慢增長到1999年的10％，隨后在4年多時間里快速增長到2003年的62％(Goodman，J Clin Invest 114，1181(2004))。在邁阿密醫院，小腿潰瘍中對喹諾酮類藥物抗性的綠膿假單胞菌，從1992年的19％增長到2001年的56％(Valencia et al.，JAm Acad Dermatol 50，845-9(2004))。在這個領域中不言自明，需要新的療法來控制這些感染。
抗菌劑例如硝酸銀、磺胺嘧啶銀(Silverdene、Thermazine、Flamazine)和醋酸甲磺滅膿(Sulfamylon)的預防性使用已經成為標準護理，其減少傷口例如灼傷的細菌定居。但是，這些試劑具有局限性。例如，Silverdene已經顯示延緩傷口愈合并不能用于對磺胺藥物過敏的病人。Sulfamylon的代謝產物是碳酸酐酶的潛在抑制劑，并因此能引起代謝性酸中毒。在吸入性損傷患者和發展出膿毒癥的患者中尤其禁用這種化合物。
其它用于預防或減少細菌定居的抗微生物劑是硫酸慶大霉素、桿菌肽、呋喃妥因。不幸的是，這些抗微生物劑的不斷使用導致被刺激的細菌的抗性菌株的出現。
盡管在灼傷患者治療中這些抗微生物治療策略作為標準護理方法已經被接受，藥物抗性細菌感染(例如，甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌和鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii))的發展給在延長住院期的病人(例如，嚴重損傷的灼傷或者或帶有慢性潰瘍的糖尿病患者)帶來重大的臨床問題。
因此，存在著開發抗微生物治療替代治療策略的巨大需求。特別的，需要能解決并有效殺死或減弱藥物抗性微生物的療法。


發明內容
本發明涉及細菌學領域。特別的，發明涉及新的組合物(例如，抗微生物劑)和使用它們處理組織(例如皮膚和其它軟組織損傷)的方法，包括殺死或改變(例如，抑制)微生物種群的生長和毒力，在一些實施方案中，新的組合物的作用包括用所述組合物定居(colonizing)組織，例如，定居創傷、腸道或泌尿道的一種或多種組成部分。
在一些實施方案中，本發明的方法包括，通過將組織暴露于供體細胞中來處理組織，其中所述供體細胞含有重組的可轉移質粒和輔助質粒，所述重組的可轉移質粒含有編碼殺菌蛋白的基因，所述輔助質粒含有編碼免疫蛋白的基因，其中所述免疫蛋白被設置為用于抑制所述殺菌蛋白。在這個實施方案中，供體細胞被設置為用于接合性地將重組的可轉移質粒轉移到受體細胞中，這樣重組的可轉移質粒在受體細胞中表達編碼殺菌蛋白的基因。在優選的實施方案中，編碼殺菌蛋白的基因的表達對于受體細胞來說是致死性的。在一些實施方案中，殺菌蛋白是大腸桿菌素。在一些優選的實施方案中，大腸桿菌素是colE3，而在其它優選的實施方案中，殺菌蛋白包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9或溶菌酶。
本發明的方法設想了被設置為用于抑制殺菌蛋白效果的免疫蛋白的用途。在優選的實施方案中，免疫蛋白結合到殺菌蛋白上。例如，免疫蛋白immE3結合到并且抑制(例如，使失活)殺菌蛋白colE3。本領域已知有許多對殺菌蛋白和相對應的免疫蛋白。在本發明中，列于上面的殺菌蛋白分別被相對應的大腸桿菌素A，大腸桿菌素B、大腸桿菌素D、大腸桿菌素Ia、大腸桿菌素Ib、大腸桿菌素K、大腸桿菌素N、大腸桿菌素E1，大腸桿菌素E2、大腸桿菌素E4、大腸桿菌素E5、大腸桿菌素E6、大腸桿菌素E7、大腸桿菌素E8和大腸桿菌素E9免疫蛋白抑制。
本發明提供了用于處理組織的組合物和方法，所述組織包括但不限于皮膚、粘膜組織、肺組織、膀胱組織等。在一些實施方案中，處理的是未受傷的組織。同時在一些實施方案中，組織包括創傷。在一些優選的實施方案中，創傷包括灼傷創面。在一些實施方案中，治療包括定居所述組織，例如，和本發明的組合物一起。
在一些實施方案中，用本發明的方法和組合物的治療可以應用于感染的組織或受污染的表面。在這種實施方案中，被處理的組織或表面在感染的組織或受污染的表面暴露于本發明的組合物(例如供體細胞，處理的表面)之前和受體細胞(例如，一種病原體細胞)接觸。
在一些實施方案中，使用本發明的方法和組合物的治療可以是預防性的(prophylactic/preventative)。在這種實施方案中，被處理的組織或表面在感染的組織或受污染的表面暴露于本發明的組合物(例如供體細胞，處理的表面)之前不和受體細胞(例如，一種病原體細胞)接觸。
設想本發明的方法和組合物可以利用許多不同的重組的可轉移質粒。在一些實施方案中，重組的可轉移質粒是可自體轉移的，而在其它實施方案中，重組的可轉移質粒是非自轉移的。在一些優選的實施方案中，重組的可轉移質粒選自包括pCON15-56A、pCON19-79。輔助質粒包括但不限于pCON1-93和pCON1-94。
本發明的方法和組合物靶向的受體細胞包括但不限于細菌細胞。在優選的實施方案中，受體細胞是病原性細菌細胞。在特定的優選的實施方案中，受體細菌細胞所屬菌屬選自于沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、大腸桿菌屬(Escherichia)、腸道細菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、耶爾森菌屬(Yersinia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、愛文菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、摩根氏菌屬(Morganella)、動性球菌屬(Planococcus)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、支原菌屬(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、立克次體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、羅卡利馬氏體菌屬(Rochalimaea)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、兼性雙球菌屬(Gemella)、乳球菌屬(Lactococcus)、白聯珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pedicoccus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、加德納菌屬(Gardnerella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弓形菌屬(Arcobacter)、沃廉菌屬(Wolinella)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、華麗單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃肯菌屬(Eikenella)、黃色單胞菌屬(Flavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、寡源桿菌屬(Oligella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、威克氏菌屬(Weeksella)、黃(單包)桿菌屬(Xanthomonas)、博德特氏菌屬(Bordetella)、弗朗西絲氏菌屬(Franciesella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團桿菌屬(Legionella)、阿菲波菌屬(Afipia)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、螺旋菌屬(Spirillum)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、八迭球菌屬(Sarcinia)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃廉菌屬(Wolinella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、韋榮氏球菌屬(Veilonella)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬諾卡氏菌屬(Norcardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小多孢菌屬(Micropolysporas)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、密螺旋體(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)或衣原體(Chiamydiae)。
本發明提供了包含供體細胞的組合物，其中所述供體細胞含有重組的可轉移質粒和輔助質粒，所述重組的可轉移質粒含有編碼殺菌蛋白的基因，所述輔助質粒含有編碼免疫蛋白的基因，其中所述免疫蛋白被設置為用于抑制所述殺菌蛋白，在這個實施方案中，供體細胞被設置為用于將重組的可轉移質粒轉移到受體細胞中，因此重組的可轉移質粒在受體細胞中表達編碼殺菌蛋白的基因。在優選的實施方案中，編碼殺菌蛋白的基因的表達對于受體細胞來說是致死性的。在一些實施方案中，殺菌蛋白是大腸桿菌素。在一些優選的實施方案中，大腸桿菌素是colE3，而在其它優選的實施方案中，殺菌蛋白包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9，或溶菌酶。在本發明的一些實施方案中，可轉移質粒含有RSF 1010的oriT和oriV，并且其中所述的編碼ColE3的基因在lac啟動子/操縱子控制之下。在一些優選的實施方案中，可轉移質粒是pCON15-56A或pCON19-79。
在一些實施方案中，供體細胞屬于低毒力細菌菌株。在一些實施方案中所述低毒力菌株是E.coli菌株。在一些優選的實施方案中，低毒力菌株是大腸桿菌83972。
本發明的組合物考慮到了被設置為用于抑制殺菌蛋白效果的免疫蛋白的用途，在優選的實施方案中，免疫蛋白結合到殺菌蛋白上。例如，免疫蛋白immE3結合并且抑制(例如，使失活)殺菌蛋白colE3。本領域已知有許多對殺菌蛋白和相對應的免疫蛋白。在本發明中，列于上面的殺菌蛋白分別被相對應的大腸桿菌素A，大腸桿菌素B、大腸桿菌素D、大腸桿菌素Ia、大腸桿菌素Ib、大腸桿菌素K、大腸桿菌素N、大腸桿菌素E1，大腸桿菌素E2、大腸桿菌素E4、大腸桿菌素E5、大腸桿菌素E6、大腸桿菌素E7、大腸桿菌素E8和大腸桿菌素E9免疫蛋白抑制。在一些實施方案中，編碼免疫蛋白的基因在啟動子的控制之下，其中所述啟動子是組成型活性的。在一些實施方案中，啟動子是Pneo。在其它實施方案中，編碼免疫蛋白的基因在可誘導的啟動子的控制之下。在一些實施方案中，輔助質粒是pCON1-93或pCON1-94。
設想了本發明的組合物可以被用于處理表面。能被本發明的方法和組合物處理的表面包括但不限于醫學裝置、創傷護理裝置、體腔裝置、人體、動物體、個人保護裝置、生育控制裝置和藥物運輸裝置的表面。在一些優選的實施方案中，裝置包括導尿管。表面包括但不限于硅、塑料、玻璃、聚合物、陶瓷、光致抗蝕劑、皮膚、組織、硝酸纖維素、水凝膠、紙、聚丙烯、衣服、棉花、羊毛、木、磚、皮革、乙烯樹脂、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、光導纖維、天然纖維、尼龍、金屬、橡膠和它們的混合物。在一些實施方案中，所述處理是抑制受體細胞在表面的生長，而在其它實施方案中，處理是殺死或減弱進入接觸表面的受體細胞。在一些實施方案中，處理是定居所述表面。



圖1是監測接合效率的方法的描述。圖1A顯示了示例性的接合檢測的示意圖。圖1B提供了用于計算接合效率的稀釋檢測的例子。
圖2顯示了將細菌點在培養基上用于監測殺傷質粒的接合和殺傷效果的圖像。
圖3圖片顯示使用含有本發明的質粒的供體細胞的體內效果檢測的結果。
圖4A提供了通過根據本發明的供體細胞檢測細菌抑制的示例性方法的示意圖。圖4B顯示了所示靶細胞的菌苔圖像(在a欄)和來自接合依賴性的生長抑制的病原細胞菌苔中的清除區域(在b欄)。
圖5顯示了質粒RSF1010 pCON15-56A的示意圖。
圖6顯示了質粒pCON1-94的示意圖。
圖7顯示了pCON19-79的示意圖。
圖8顯示了pCON1-93的示意圖。
圖9顯示了使用含有pCON19-79質粒的供體細胞的體內效果檢測的結果。
定義 為了便于理解本發明，一些術語和慣用語被定義如下 如此處所述，術語“受試者”指的是被本發明的方法或組合物處理的個體(例如人、動物或其它生體)。受試者包括但不限于哺乳動物(例如，鼠、猴、馬、牛、豬、犬、貓等)，并且最優選的包括人。在本發明的上下文中，術語“受試者”通常指的是在某種條件下將要接受或已經接受處理(例如，給予供體細胞，和可選擇的一種或多種其它試劑)的個體，所述條件的特征是存在病原體細菌或預計有可能會暴露于病原體細菌中。
如此處所述，術語“診斷的”指的是通過其體征和癥狀(例如，對常規療法的抗性)，或通過遺傳分析、病理分析、組織學分析等，對疾病(例如，因存在病原體細菌所引起的)的識別。
如此處所述，術語“在體外”指的是一種人為環境，和在人為環境中發生的過程或反應。體外環境包括，但不限于試管和細胞培養物。術語“在體內”指的是天然環境(例如，動物或細胞)以及在天然環境中的過程或反應。
如此處所述，術語“細胞培養物”指的是任意的細胞體內培養物。包括于此術語中的有連續的細胞系(例如，帶有永生表型)、原代細胞培養物、有限細胞系(例如，非轉化的細胞)和在體外維持的任何其它細胞群體，包括卵母細胞和胚胎。
如此處所述，術語“接合(conjugation)”指的是DNA從一個細胞轉移到另一個細胞的過程。雖然結合主要見于細菌細胞之間，但是從細菌細胞到更高級或更低級的真核細胞也發生此過程(Waters，NatGenet.29375-376(2001)；Nishikawa等人，Jpn J Genet.65323-334(1990))。接合由復雜的細胞結構介導，并且關鍵的蛋白組件通常被編碼為質粒中的一系列基因(例如，質粒RK2的tra基因)。這些基因產物中的一些組裝到一起來促進直接的細胞-細胞相互作用(例如，交配對的形成)，并且它們中的一些用于轉移DNA和伴隨的蛋白分子，并用于復制DNA分子(例如，DNA轉移/復制)。oriT是一種DNA序列，在接合過程中DNA分子的轉移從它開始。
如此處所述，術語“接合供體”和“供體細胞”是可交換使用的，指的是一種細胞，例如，一種細菌細胞，攜帶有一種質粒，其中所述質粒能通過接合轉移到另一個細胞中。供體細胞的例子包括，但不限于，含有可自我轉移型或非自我轉移型質粒的大腸桿菌菌株。通過接合轉移從供體細胞中接受質粒或其它細胞物質的細胞被稱為“受體細胞”。如此處所述，術語“可轉移質粒”指的是能通過接合從供體細胞轉移到受體細胞中的質粒。
如此處所述，術語“可自我轉移型質粒”指的是一種編碼所有介導接合所需基因的質粒。可自我轉移型質粒的受體成為將可自我轉移型質粒進一步轉移到另一個受體細胞中的專業供體(proficientdonot)。
如此處所述，術語“非自我轉移型質粒”或“可移動質粒”指的是缺乏某些介導接合所需基因的質粒。攜帶體自我轉移型質粒的細胞不能通過接合轉移DNA，除非在相同細胞中反式補充缺失的基因。因此，缺乏缺失基因的受體細胞在接受非自我轉移型質粒后不會成為專業的接合供體。
如此處所述，術語“轉移原點”或“oriT”指的是DNA轉移需要的順式作用位點，并且將oriT序列整合進入非轉移質粒中能將其轉變為可移動質粒(Lanka and Wilkins，Annu Rev Biochem，64141-169(1995))。
在一些實施方案中，供體細胞是細菌細胞(例如，革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌)。供體細胞的例子包括，但不限于，屬于選自于如下菌屬的細菌細胞沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、大腸桿菌屬(Escherichia)、腸道細菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、耶爾森菌屬(Yersinia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、愛文菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、摩根氏菌屬(Morganella)、動性球菌屬(Planococcus)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、支原菌屬(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、立克次體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、羅卡利馬氏體菌屬(Rochalimaea)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、兼性雙球菌屬(Gemella)、乳球菌屬(Lactococcus)、白聯珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pedicoccus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、加德納菌屬(Gardnerella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弓形菌屬(Arcobacter)、沃廉菌屬(Wolinella)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、華麗單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃肯菌屬(Eikenella)、黃色單胞菌屬(Flavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、寡源桿菌屬(Oligella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、威克氏菌屬(Weeksella)、黃(單包)桿菌屬(Xanthomonas)、博德特氏菌屬(Bordetella)、弗朗西絲氏菌屬(Franciesella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團桿菌屬(Legionella)、阿菲波菌屬(Afipia)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、螺旋菌屬(Spirillum)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、八迭球菌屬(Sarcinia)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃廉菌屬(Wolinella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、韋榮氏球菌屬(Veilonella)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬諾卡氏菌屬(Norcardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小多孢菌屬(Micropolysporas)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、密螺旋體(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)和衣原體(Chlamydiae)。
在一些實施方案中，供體細胞是非生育(non-viable)的細胞，包括單不限于細菌微細胞、大細胞或不分裂細胞。
如此處所述，術語“大細胞”指的是已經被處理進行最大程度的染色體降解的細胞，例如，通過紫外線照射和擴大培養。大細胞包括大部分的質粒DNA，并且大細胞內蛋白質的合成主要來自于細胞中的質粒DNA。
如此處所述，術語“不分裂細胞”或“ND細胞”指的是一種被處理的細胞，所選擇的處理方式用于優先破壞細胞的染色體DNA(例如，通過紫外線或其他輻射)，其中所述細胞被進一步處理，例如，DNA損傷處理后快速冷凍，來使染色體降解最小化。還可以通過例如在供體細菌中暫時表達細菌蛋白(例如，ColE3)的方法獲得“ND細胞”。因此，在一些實施方案中，誘導蛋白(例如，ColE3)破壞細胞中的蛋白質合成，導致細胞死亡，同時留下接合裝置，并且染色體DNA在ColE3完整合成之前合成。ND細胞含有染色體和質粒DNA，但是細胞的功能被完全改變了，例如，通過紫外線照射，所述ND細胞幾乎沒有或完全沒有分裂能力。
在此處術語“靶細胞”、“靶”、“受體細胞”和“受體”可互換使用。在優選的實施方案中，用于本發明的組合物和方法的靶細胞包括但不限于能通過接合轉移從供體細胞中接受物質的微生物，例如病原微生物(例如，病原菌)。病原菌包括但不限于沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、大腸桿菌屬(Escherichia)、腸道細菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、耶爾森菌屬(Yersinia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、愛文菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、摩根氏菌屬(Morganella)、動性球菌屬(Planococcus)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、支原菌屬(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、立克次體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、羅卡利馬氏體菌屬(Rochalimaea)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、兼性雙球菌屬(Gemella)、乳球菌屬(Lactococcus)、白聯珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pedicoccus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、加德納菌屬(Gardnerella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弓形菌屬(Arcobacter)、沃廉菌屬(Wolinella)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、華麗單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃肯菌屬(Eikenella)、黃色單胞菌屬(Plavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、寡源桿菌屬(Oligella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、威克氏菌屬(Weeksella)、黃(單包)桿菌屬(Xanthomonas)、博德特氏菌屬(Bordetella)、弗朗西絲氏菌屬(Franciesella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團桿菌屬(Legionella)、阿菲波菌屬(Afipia)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、螺旋菌屬(Spirillum)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、八迭球菌屬(Sarcinia)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃廉菌屬(Wolinella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、韋榮氏球菌屬(Veilonella)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬諾卡氏菌屬(Norcardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小多孢菌屬(Micropolysporas)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、密螺旋體(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)和衣原體(Chlamydiae)。在一些實施方案中，靶細胞是連續培養的細胞。在一些實施方案中，靶細胞是在其天然環境(例如，在創傷或感染部位)中存在的或從病人組織(例如，通過活組織解剖)中獲得的培養細胞，在優選的實施方案中，靶細胞顯示病理學生長或增殖。
如此處所述，術語“毒力”指的是微生物的病原性程度，例如，用產生疾病的嚴重程度或其侵入受試者組織的能力來表明。通常通過半數致死量(LD50)或半數感染劑量(ID50)對其進行實驗測定。該術語還可被用于表述產生病理效果的任意感染性試劑的能力。
術語“殺傷基因”指的是一種通過在易感細胞中表達，產生殺死細胞的產物的基因。
術語“殺傷質粒”指的是包含殺傷基因的質粒。如此處所述，術語“減弱”和“弱化作用”指的是一種特性，例如，屬于受體或靶細胞的，指的是該特性的降低或減弱，或該特性的效果的降低。例如，當涉及到靶細胞的病原體或病原性時，弱化作用通常指的是病原體毒力的降低。病原體的弱化作用不限于任何特定的弱化毒力機制，在一些實施方案中，可能實現了弱化毒力，例如，通過破壞分泌通路，在其它實施方案中，可以通過改變細胞代謝來增加對藥物(例如，減弱病原體毒力的藥物或殺死該病原體的藥物)的反應性或易感性來實現弱化毒力。在一些實施方案中，弱化作用指的是一種特性，例如，細胞群體的毒力。例如，在本發明的一些實施方案中，病原細胞群體被處理，例如，通過發明的方法和組合物，因此細胞群體中毒力方面下降。參見，例如，2005年5月26日提交的系列號為11/137,948的共同待審的申請和2006年5月26日提交的郵件快遞標簽號(ExpressMail Label No)為EV 850782307 US的PCT申請，其全部被整體引入此處作為參考。
如此處所述，術語“毒力”指的是微生物的病原性程度，例如，以產生疾病的嚴重程度或其侵入受試者組織的能力來表示。通常通過半數致死量(LD50)或半數感染量(ID50)對其進行實驗測定。該術語還可被用于表述產生病理效果的任意感染性試劑的能力。
如此處所述，術語“有效量”指的是足夠產生有益效果或所需結果的組合物(例如，供體細胞)的數量。可以通過一次或多次給藥、應用或用藥給予有效量，并且不特意限定于特定的劑型或給藥途徑。
如此處所述，術語“給藥”指的是向生理系統(例如，受試者或體內、體外或離體的細胞、組織和器官)給予藥物、藥物前體或其它試劑、或治療處理(例如，本發明的組合物)的行為。示例性的人體給藥途徑可以通過眼睛(眼的)、嘴(口腔的)、皮膚(經皮膚的)、鼻子(鼻的)、肺(吸入的)、口腔粘膜(口腔的)、耳朵，通過注射(例如，靜脈的、皮下的、瘤內的、腹膜內的等)、通過引入到膀胱等。
如此處所述，術語“處理表面”指的是將表面暴露于一種或多種本發明的組合物的行為。處理表面的方法包括，但不限于噴射、噴霧、浸沒和包被。
如此處所述，術語“共給藥(co-administration)”指的是向受試者至少給予兩種試劑(例如，兩種單獨的供體細菌，每種包含不同的質粒)或療法。在一些實施方案中，共給藥兩種或兩種以上試劑或療法是同時發生的，在其它實施方案中，第一種試劑/療法在第二種試劑/療法之前給予。所使用的不同試劑或療法的劑型和/或給藥途徑是可以改變的，這是本領域熟練人員所已知的。本領域的熟練人員能夠容易的測定共給藥的合適劑量。在一些實施方案中，當共給藥試劑或療法時，采用比其單獨給藥的合適劑量更低的劑量給予各自的試劑或療法。在某些實施方案中，試劑或療法的共給藥降低了有可能有害的(例如，有毒的)試劑的需要量，因此，在該實施方案中共給藥是尤其需要的。
如此處所述，術語“有毒的”指的是和對相同細胞或組織給予有毒物質之前相比，對受試者、細胞或組織的任何有害效果。
如此處所述，術語“藥物組合物”指的是活性試劑(例如，供體細菌細胞)和載體(惰性的或活性的)的組合，使該組合物尤其適用于體外的、體內的或離體的診斷或治療用途。
如此處所述，術語“藥學可接受的”或“藥理學可接受的”指的是當向受試者給藥時基本上不產生副作用的組合物，所述副作用例如，有毒的、過敏的或免疫反應。
如此處所述，術語“局部的”指的是，本發明的組合物在皮膚和粘膜細胞和組織(例如，肺泡的、口腔的、舌的、咀嚼的或鼻粘膜和其它排列于中孔洞器官或體腔例如膀胱中的組織和細胞)的表面的應用。
如此處所述，術語“藥物可接受載體”指的是任意的標準藥物載體，包括但不限于，磷酸鹽緩沖的生理鹽水、水、乳劑(例如，油/水或水/油乳劑)，和不同類型的濕潤劑，和所有的溶劑、濕潤劑、包被劑、硫酸月桂酯鈉、等滲和吸收延遲劑、分解劑(例如，土豆淀粉或淀粉羥乙酸鈉)等。組合物還能包括穩定劑和防腐劑。例如載體、穩定劑和輔劑的。(參見，例如，Martin，Remington′s PharmaceuticalSciences，15th Ed.，Mack Pub1.Co.，Easton，Pa.(1975)，引入此處用作為參考)。此外，在某些實施方案中，本發明的組合物可以配制用于園藝或農業用途。這種劑型包括蘸劑、噴射劑、種子敷料、莖注射劑、噴射劑和噴霧劑。
如此處所述，術語“藥物可接受的鹽”指的是在目標受試者(例如，哺乳動物受試者和/或體內或離體的細胞、組織或器官)中生理耐受的，本發明的化合物的任意鹽(例如，通過和酸或堿反應得到的)。本發明的化合物的“鹽”可以來自于無機或有機酸和堿。酸的例子包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、羥基乙酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸(methanesulfonic)、甲磺酸(ethanesulfonic)、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其它酸，例如草酸，雖然其自身不是藥學可接受的，但是可以用于制備鹽，用作獲得本發明的化合物的中間物，以及它們藥學可接受的酸加成鹽。
堿的例子包括但不限于堿金屬(例如，鈉)氫氧化物、堿土金屬(例如，鎂)氫氧化物、銨和化學式NW4+的化合物，其中W是C1-4烷基等。
鹽的例子包括但不限于醋酸鹽、已二酸鹽、藻(朊)酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、重硫酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊丙酸雌二醇鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、氟庚酸鹽(flucoheptanoate)、磷酸甘油、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、羥乙基磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、草酸鹽、噻嘧啶(palmoate)、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯珍酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽等。鹽的其它例子包括本發明的化合物的陰離子和合適的陽離子例如Na+、NH4+、和NW4+(其中W是C1-4烷基)等。對于治療用途，本發明的化合物的鹽被考慮到為藥學可接受的。但是，非藥學可接受的酸和堿的鹽也可以找到用途，例如，在制備或純化藥物可接受化合物中。
對于治療用途，本發明的化合物的鹽被考慮到為藥學可接受的。但是，非藥學可接受的酸和堿的鹽也可以找到用途，例如，在制備或純化藥物可接受化合物中。
如此處所述，術語“醫學裝置”包括在受試者或病人身體內、上或通過受試者或病人身體使用的任意材料或用具，例如，在醫學處理過程中(例如，對于疾病或損傷)。醫學裝置包括但不限于，例如醫學埋植物、創傷護理裝置、藥物運輸裝置和體腔和個人保護裝置這些物品。醫學埋植物包括但不限于導尿管、血管內導管、透析分流器、傷口引流管、皮膚縫線、人造血管、可定居網、眼內裝置、心臟瓣膜等。創傷護理裝置包括但不限于，一般性創傷敷料、生物定居物質、閉合帶和敷料和外科切割布單。藥物運輸裝置包括但不限于針、藥物運輸皮膚貼片、藥物運輸粘膜貼片和醫用海綿。體腔和個人保護裝置包括但不限于棉塞、海綿、外科和檢查手套和牙刷。控制生育裝置包括但不限于子宮內裝置(IUD)、膈膜和避孕套。
如此處所述，術語“治療試劑”指的是，在和病原性微生物接觸的受試者中降低傳染性、發病率或死亡發作的組合物，或在和病原性微生物接觸的宿主中防止傳染性、發病率或死亡發作的組合物。如此處所述，治療試劑包含用于預防用途的試劑，例如，在沒有病原體存在時，考慮到將來暴露于病原體的可能性。這種試劑還可以包含藥學可接受的化合物(例如，佐劑、輔料、穩定劑、稀釋劑等)。在一些實施方案中，本發明的治療試劑以局部使用組合物、注射組合物、可吸收組合物等形式給藥。當給藥途徑是局部給藥時，形式可以是例如，溶液、乳劑、軟膏、油膏劑或噴霧劑。
如此處所述，術語“病原體”指的是在宿主中引起疾病狀態(例如，感染，癌癥等)的生物試劑。“病原體”包括但不限于病毒、細菌、古菌(archaea)、真菌、原生動物、支原體、蛋白酶傳染性因子(prion)和寄生生物。
術語“細菌(bacteria/bacterium)”指的是所有原核生物，包括原核生物界中所有的門中的那些。其意指該術語包括所有被認為是細菌的微生物，包括支原體、衣原體、放線菌、鏈霉菌和立克次體。所有形式的細菌都被包括進這個定義中，包括球菌、桿菌、螺旋菌、球形體、原生質體等。該術語還包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性的原核生物。“蘭氏陰性”或“革蘭氏陽性”指的是革蘭氏染色過程中的染色模式，這是本領域所熟知的。(參見例如，Finegold and Martin，Diagnostic Microbiology，6th Ed.，CV Mosby St.Louis，pp.13-15(1982))。“革蘭氏陽性細菌”是保留革蘭氏染色中使用的原始染料的細菌，導致染色的細胞在顯微鏡下通常顯示黑藍色到紫色。“蘭氏陰性細菌”不保留革蘭氏染色中使用的原始染料，但是被負染染色。因此，蘭氏陰性細菌通常顯示紅色。
如此處所述，術語“微生物”指的是任意的微生物物種或類型，包括單不限于，病毒、細菌、古菌、真菌、原生動物、支原體、蛋白酶傳染性因子和寄生生物。本發明設想，其中包括的一些微生物對受試者來說還將是病原性的。
如此處所述，術語“真菌”被用于表述例如霉菌和酵母的真核生物，包括雙相型真菌。
如此處所述，術語“非人類動物”指的是所有非人類動物，包括，但不限于脊椎動物，例如嚙齒類、非人類靈長類、羊、牛、反芻動物、兔類動物、豬、羊、馬、犬、貓、鳥類等。
如此處所述，術語“核酸分子”指的是任意含有核酸的分子，包括但不限于，DNA或RNA。該術語包括包含DNA和RNA的任意已知堿基類似物的序列，所述類似物包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、乙烯亞氨基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧羥基氨甲基-2-硫脲嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、次黃嘌呤核苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤苷、2、2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基甲基-2-硫脲嘧啶、p-D-甘露糖Q核苷、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁基核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-巰基胞嘧啶和2、6-二氨基嘌呤。
術語“基因”指的是包含產生多肽、前體或RNA(例如，rRNA、tRNA)所必需的編碼序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以被全長編碼序列或被編碼序列的任意部分編碼，只要該全長或片段的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配體結合、信號傳導、免疫原性等)被保留下來。該術語還包括結構基因的編碼區，以及位于鄰接編碼區5′和3′末端處距離每個末端大約1kb或以上的序列，因此該基因對應于全長mRNA的長度。位于編碼區5′端并存在于mRNA中的序列被稱為5′非翻譯序列，或者5′側翼順序。位于編碼區3′端或下游并存在于mRNA中的序列被稱為3′非翻譯序列，或者3′側翼順序。術語“基因”包括基因的cDNA和基因組形式。基因的基因組形式或克隆含有被命名為“內含子”或“間隔區”或“間隔序列”的非編碼序列所間隔的編碼區。內含子是基因的一部分，被轉錄到mRNA前體；內含子可能含有調控元件，例如增強子。通常內含子從原始轉錄子(mRNA前體)中去除或“切割掉”；因此內含子通常不存在于信使RNA(mRNA)轉錄子中。mRNA在翻譯時發揮功能，來指定新生多肽的氨基酸序列或順序。
如此處所述，術語“異源基因”和“異源核酸”指的是未處于其天然環境中的基因或核酸。例如，異源基因或核酸包括從一個物種引入到另一個物種中的基因或核酸。異源基因或核酸還包括已經發生了某種改變的生物體(例如，突變的，加入多重拷貝，和非天然調控序列連接等)的天然基因或核酸。異源基因或核酸和內源基因或核酸的區別在于，異源基因或核酸序列通常和在染色體中未發現和該基因或核酸序列有天然聯系的DNA序列連接，或者和天然情況下未發現的染色體部分相聯系(例如，基因組正常情況下基因不會表達的座位發生表達)。
如此處所述，術語“基因表達”指的是通過基因“轉錄”(即，通過RNA聚合酶的酶促作用)，基因編碼的遺傳信息轉換為RNA的過程(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，而對于編碼蛋白基因，則是通過mRNA “翻譯”轉變為蛋白質。可以在該過程中的多個階段調控基因表達。“上調”或“激活”指的是增加基因表達產物(即，RNA或蛋白質)的調節，而“下調”或“抑制”指的是減少產物的調節。參與上調或下調的分子(例如，轉錄因子)通常被分別稱為“激活子”和“抑制子”。
術語“野生型”指的是以分離自天然產生源的形式存在的基因或基因產物。野生型基因是群體中被觀察到的頻率最多的基因，因此被人為定義為基因的“正常”或“野生型”形式。相反，術語“修飾的”或“突變體”指的是和野生型基因或基因產物相比，在序列或功能特性(即，變更的特性)中表現出變更的基因或基因產物。需要注意的是，能分離到天然產生的突變體；通過和野生型基因或基因產物相比它們具有變更的特性(包括變更的核酸序列)這個事實來鑒別。
如此處所述，術語“核酸分子編碼”“DNA序列編碼”和“DNA編碼”指的是沿著一條脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。這些脫氧核糖核苷酸的順序決定了沿著多肽(蛋白質)鏈的氨基酸順序。因此DNA中的核苷酸序列編碼了相對應的多肽的氨基酸序列。
如此處所述，術語“具有編碼一個基因的核酸序列的寡核苷酸”和“具有編碼一個基因的核酸序列的多(聚)核苷酸”的意思是包含基因編碼區的核酸序列，或者換句話說是編碼基因產物的核酸序列。編碼區可以以cDNA、基因組DNA或RNA的形式存在。當以DNA的形式存在時，寡核苷酸或多核苷酸可以是單鏈的(即，正義鏈)或雙鏈的。如果需要，在臨近基因編碼區的位置可以存在合適的調控元件例如增強子/啟動子、剪切點、多腺苷酸化信號等，來允許進行合適的轉錄起始和/或正確的原始RNA轉錄子加工過程。
可選擇的，在本發明的表達載體中使用的編碼區可能含有內源增強子/啟動子、剪切位點、間隔序列、多腺苷酸化信號等，或者內源和外源調控元件的結合。
如此處所述，術語“寡核苷酸”指的是長度短的單鏈多聚核苷酸鏈。寡核苷酸通常小于200個殘基的長度(例如，15到100之間)，但是，如此處所述，該術語還意圖包括更長的多聚核苷酸鏈。通常通過其長度表述寡核苷酸。例如，一個24殘基的寡核苷酸被稱為“24聚體(24-mer)”。寡核苷酸能通過自雜交或通過和其它寡核苷酸雜交形成二級和三級結構。這種結構能包括，但不限于，雙聯體、發夾、交叉形、轉角和三聯體。
如此處所述，術語“互補的”或“互補性”用于表述通過堿基配對原則相關的多聚核苷酸(即，核酸例如寡核苷酸或目標核苷酸的序列)。例如，序列“5′-A-G-T-3′”對于序列“3′-T-C-A-5′”是互補的。互補性可以是“部分”的，其中只有一些核苷酸的堿基根據堿基配對原則是匹配的。或者，核酸之間可以具有“完全”或“全”互補性。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間的雜交的效率和強度具有明顯影響。這種在擴增反應中尤其重要，對于依賴核酸直接結合的檢測方法同樣如此。兩個術語都可以用于表述單獨的核苷酸，尤其是在多聚核苷酸背景下。例如，對于寡核苷酸內的特定核苷酸可以強調其對另一個核酸鏈中的核苷酸的互補性(或缺乏互補性)，和寡核苷酸其余部分與核酸鏈之間的互補性進行對比或比較。
術語“同源性”指的是分子(例如核酸分子)之間的相似程度。有可能是部分同源或完全同源(即，同一性)。部分互補序列是至少部分抑制完全互補核酸分子雜交到“大體上同源”的目標核酸上的核酸分子。可以使用雜交檢測(Southern或Northern印記，溶液雜交等)在低嚴緊度條件下檢測對完全互補序列和目標序列的雜交的抑制作用。在低嚴緊度條件下，大體同源的序列或探針將競爭并抑制完全同源核酸分子對目標的結合(即，雜交)。這不是說低嚴緊度條件造成允許非特異性結合；低嚴緊度條件需要兩個序列的互相結合是特異性的(即，選擇性的)相互作用。可以通過使用大體上非互補的(例如，一致性小于大約30％)第二靶標檢測沒有非特異性結合；在沒有非特異性結合下，探針將不會雜交到第二非互補靶標上。
當用于表述雙鏈核酸序列例如cDNA或基因組克隆時，術語“大體同源”指的是，在上述低嚴緊度條件下能雜交到該雙鏈核酸序列的任意一條或兩條鏈上的任意核酸。當用于表述單鏈核酸序列時，術語“大體同源”指的是在上述低嚴緊度條件下能雜交(即，它是互補體)到該單鏈核酸序列的互補體上的任意核酸。
通過原始RNA轉錄子的不同剪切，基因可以產生多種RNA。是相同基因的剪切變體的cDNA將包含相同或完全同源的(表現為在兩個cDNA中存在相同的外顯子或相同外顯子的部分)序列區域和完全不同區域(例如，表現為在cDNA1中存在外顯子“A”，而cDNA2含有外顯子“B”)。因為兩種cDNA含有相同序列，它們都將和源自完整基因或基因部分的含有兩種cDNA中都存在的序列的探針雜交；因此這兩種剪切變體對這種探針并互相是大體同源的。
如此處所述，術語“雜交”被用于表述互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即，核酸之間關聯的強度)受到下述因素的影響核酸之間互補程度、有關條件的嚴緊性、形成雜交體的Tm以及核酸中的G∶C比例。在其結構中含有互補核酸對的單個分子被稱為“自雜交”。
如此處所述，術語“部分”在表述核苷酸序列(如在“給定核苷酸序列的一部分”中)時指的是該序列的片段。該片段的大小范圍可以是從4核苷酸到整個核苷酸序列減去一個核苷酸(10核苷酸，20，30，40，50，100，200等)。
此處使用的術語“可操作地組合”“可操作的順序”和“可操作的連接”指的是核酸序列以某種方式的連接，在這種方式下產生了能指導給定基因的轉錄和/或所需蛋白質分子的合成的核酸分子。該術語還表述了氨基酸序列以某種方式的連接，結果產生了功能性蛋白質。
當和核酸有關使用術語“分離的”時，如在“分離的寡核苷酸”或“分離的多聚核苷酸“中，該術語指的是被鑒別的并從其天然來源中通常伴隨的組分或污染物中分離出來的核酸序列。因此分離的核酸以區別于其天然狀態下的形式或設定存在，相反，未分離核酸是天然狀態下存在的核酸例如DNA和RNA。例如，在宿主細胞染色體上發現臨近毗鄰基因的給定的DNA序列(例如，基因)；RNA序列，例如編碼特定蛋白質的特定mRNA序列，被發現在細胞中和編碼許多種蛋白質的其它多種mRNA混合在一起。但是，編碼給定蛋白質的分離的核酸包括，例如，這種核酸在細胞中通常表達給定蛋白質，其中該核酸位于不同于天然細胞的染色體位置，或者其側翼是和天然情況下不同的核酸序列。分離的核酸、寡核苷酸或多聚核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。當分離的核酸、寡核苷酸或多聚核苷酸被用于表達蛋白質時，寡核苷酸或多聚核苷酸將至少含有正義或編碼鏈(即，寡核苷酸或多聚核苷酸可以是單鏈的)，但是可以同時含有正義和反義鏈(即，寡核苷酸或多聚核苷酸可以是雙鏈的)。
如此處所述，術語“純化的”或“純化”指的是從樣品中去除成分(例如，污染物)。例如，通過去除污染的非免疫球蛋白純化抗體；還通過去除不結合靶分子的免疫球蛋白來對抗體進行純化。去除非免疫球蛋白和/或去除不結合靶分子的免疫球蛋白導致樣品中具有目標反應活性的免疫球蛋白的百分比的增加。在另一個實施例中，重組多肽在細菌宿主細胞中表達，并通過去除宿主細胞蛋白質來純化該多肽；因此樣品中重組多肽的百分比增加。而在另一個實施例中，通過從樣品中去除或減少一種或多種成分來純化樣品中的核酸。在純化中減少或去除的成分包括其它核酸、破壞了的核酸、蛋白質鹽等。
“氨基酸序列”和術語例如“多肽”或“蛋白質”的意思并不局限于和所述蛋白質分子相關聯的完整的、天然的氨基酸序列。
此處所述的術語“天然蛋白質”表明蛋白質不含有載體序列編碼的氨基酸殘基；即，僅含有在天然存在的蛋白質中發現的那些氨基酸的天然蛋白質。可以通過重組的方法或從天然來源中分離來產生天然蛋白質。
此處所述的術語“部分”，當表述蛋白質(如在“給定蛋白質的一部分“)時，指的是那種蛋白質的片段。該片段的大小范圍可以從4氨基酸殘基到整個氨基酸序列減去一個氨基酸。
如此處所述，術語“細胞培養”指的是細胞的任意體外培養。包括在這個術語內的有連續細胞系(例如，具有永生表型)、原代細胞培養、變異細胞系、有限細胞系(例如，非變異細胞)和可在體外維持的其它任意細胞群體。
如所述，術語“真核生物”指的是區別于“原核生物”的生物體。其意指該術語包括所有具有顯示出常見的真核生物特征的細胞的有機物，所述特征例如存在由核膜包裹的真正的核，染色體位于其中，存在膜旁細胞器，和其它通常在真核生物中觀察到的特征。因此，該術語包括但不限于例如真菌、原生動物和動物(例如人類)這些生物體。
如此處所述，術語“轉顯性負突變基因”指的是編碼防止相同基因或基因產物的其它拷貝的蛋白質產物的基因，所述相同基因或基因產物沒有發生功能特性的突變。轉顯性負突變基因的產物在此處被稱為“顯性負相”或“ DN”(例如，顯性負相蛋白質，或DN蛋白質)。
如此處所述，術語“試劑盒”指的是用于運輸材料的任意運輸系統。對于反應材料，例如供體細胞，這種運輸系統包括從一個場所到另一個場所允許反應試劑(例如，細胞、緩沖劑、選擇試劑等，在合適的容器中)和/或支持材料(例如，介質、使用材料的書寫的技術說明書等)儲存、運輸(transport/delivery)的系統。例如，試劑盒包括一種或多種，含有有關反應試劑盒/或支持性材料的圍繞物(例如，盒子)。如此處所述，術語“分段式試劑盒”指的是包括兩個或兩個以上包裝的運輸系統，每個包裝含有試劑盒全部組件的一個子部分。該包裝可以一起或單獨運輸給接受者。例如，第一個包裝可以含有用于特定用途的細胞，而第二個包裝含有選擇性培養基。術語“分段式試劑盒”包括含有符合聯邦食品、藥物和化妝品法案520(e)部分規定的分析物專屬試劑(ASR)的試劑盒，但是不限于此。事實上，任意的包括兩個或兩個以上分離的包裝、每個包裝含有試劑盒全部組件的一個子部分的運輸系統都被包括在術語“分段型試劑盒”中。相反，“組合型劑盒”指的是，在單一包裝中含有特定用途所需反應材料的所有組件的運輸系統(例如，在單獨一個盒子中存放每個所需組件)。術語“試劑盒”包括分段型和組合型試劑盒。
如此處所述，術語“細胞代謝功能”指的是除了基因組復制以外，任意或所有的細胞進行的過程(例如，與細胞功能關聯的酶促或化學過程)。
發明詳述 許多類型的治療皮膚損傷的病人需要延長住院、多次接受手術治療、醫藥介入和輸血(例如，灼傷患者或帶有慢性潰瘍的糖尿病患者)。一些研究表明，創傷和手術的嚴重程度和這些患者發展為膿血病的素因之間有因果關系(參見，例如，Angele和Faist，Crit Care 6，298(2002)；Roumen等人，Ann Surg 218，769(1993))。
未分辨的膿血病導致多器官衰竭并最終導致死亡。器官衰竭是創傷和手術患者死亡的最主要的原因。過度的炎癥應答和細胞介導免疫的抑制使這些病人容易遭受感染性并發癥(參見，例如Angele andFaist，Crit Care 6，298(2002)；Faist，Curr Top MicrobiolImmunol 216，259(1996)；和Schinkel等人，J Trauma 44，743(1998))。
每年，在緊急醫護醫院和持久性保健服務機構中有500萬名以上病人使用導尿管(Maki，D.G.和P.A.Tambyah，Emerg Infect Dis7(2)342-7(2001))。對于尿路梗阻患者、需要精確的輸出監查的情況、手術期間選擇的泌尿外科和婦科手術來說使用尿引流導管是必需的(Nicolle，L.E.Drugs Aging 22(8)627-39(2005))。有時，使用長期留置導管來輔助壓迫性潰瘍愈合；它們還有時被用于治療失禁或尿潴留。最常見的導尿管的并發癥是UTI，并且在醫院和療養所中導管相關UTI(CAUTI)是最常見的醫院感染占全部院所獲得性感染的40％以上。
最近幾年里，一些多抗生素抗性細菌菌株的出現已經使嚴重受傷患者的醫院感染治療非常困難。甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌和鮑氏不動桿菌(A.baumannii)是嚴重受傷患者中最難以控制和消除的的幾種感染中的兩種。通常，鮑氏不動桿菌或者是全藥抗性或者是僅對毒性非常大的抗生素可立其丁(Colistin)敏感。鮑氏不動桿菌的爆發正在變得更加常見和普遍。需要新策略來提供有效的治療武器對抗這些全藥抗性感染。
因此，在一些實施方案中，本發明提供了治療療法，包括含有一種或多種質粒(例如，自我轉移型或非自我轉移型質粒)的供體細胞(例如，致病的或非致病細菌，不分裂細胞)，其中該質粒可以從供體細胞轉移(例如，通過接合)到靶/受體細胞(例如，致病微生物)中，導致質粒在靶中表達其遺傳物質。
在一些實施方案中，本發明提供了包含可轉移質粒的供體細胞，其中質粒可以從供體細胞轉移(例如，通過接合)到受體細胞(例如，病原性微生物)中，導致質粒在受體細胞中表達其遺傳物質，來改變細胞功能，例如，受體細胞的致病因子。在優選的實施方案中，可轉移質粒是重組的可轉移質粒。用于多種目的的從供體細胞轉移遺傳物質到目標受體細胞的接合已經被描述。參見，例如，PCT公開WO02/18605，美國專利申請系列號20040137002和美國專利申請系列號10/884,257，每一個均引入此處以其整體作為參考。本發明利用接合轉移來改變受體細胞的細胞功能，例如，殺死或損傷靶細胞。
考慮到了，根據本發明的受體細胞的改變還包括改變這種細胞來改變這種受體細胞對藥物例如，抗生素的反應。考慮到了，對受體細胞進行的改變該受體細胞的代謝因此所述受體細胞變得對藥物敏感或增強對藥物的敏感或反應的任何改變都被包括在本發明的方法、組合物和系統中，在一些實施方案中，本發明的可轉移質粒編碼能抑制病原體破壞或滅活藥物例如抗生素的能力的因子。例如，轉移質粒的表達產物可以破壞能夠破壞或滅活抗生素的病原體酶的能力，在其它實施方案中，轉移質粒的表達產物可以在病原體細胞上或細胞中提供抗生素受體，或者在病原體細胞上或細胞中恢復有缺陷的抗生素受體，而在其它實施方案中，轉移質粒的表達產物可以促進抗生素進入病原體細胞，或者抑制病原體細胞的將抗生素運出病原體細胞之外的能力。
在一些實施方案中，轉移質粒的表達產物可以用于將失活的藥物例如前體藥物代謝為活性形式，例如，受體細胞敏感的形式。使用代謝為活性藥物形式的前體藥物對于繞過藥物抗性機制和提供選擇性治療尤其有益，例如，具有合適的可轉移質粒的靶細胞。
可轉移質粒 RK2接合系統是非常優秀的DNA從革蘭氏陰性細菌宿主(例如，大腸桿菌)中轉移的方法，并且RK2質粒甚至能跨界接合(參見，例如，Bates等人，J Bacteriol 180，6538-6543(1998)；Waters，NatGenet 29，375-376(Dec，2001))。RK2在動物或酵母細胞中不能穩定復制，但是發生DNA轉移。因此，功能性RK2接合裝置能從大量革蘭氏陰性細菌宿主中遷移質粒DNA。已經表明，只要引入合適的營養復制起點，質粒能從這些供體(大腸桿菌和其它革蘭氏陰性供體)遷移到其它革蘭氏陰性目標菌株中，并且甚至是革蘭氏陽性菌株(參見，例如，Giebelhaus等人，J Bacteriol 178，6378-6381(1996))，產生接合后體。本發明的接合系統不限于RK2，因為接合質粒的主體部分有很高的相似性，并且其它任何系統都能被用作運輸系統。
例如，考慮了多種其它的接合系統適用于本發明中，包括單不限于RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600。在一些實施方案中，同時使用了兩種或兩種以上的接合系統，除了那些已描述的，能在本發明中使用的示例性質粒包括，但不限于，美國專利申請20040137002，20040224340和10/884,257(此處被整體引用僅作為參考)中的那些。
殺傷質粒 在實行本發明時不必理解機制，并且本發明不限于任何特定的作用機制，已經考慮到，在一些實施方案中，供體細胞包含能接合轉移到目標中的可轉移質粒，在靶細胞中該質粒編碼的一種或多種產物被表達(例如，制備mRNA或蛋白質)，導致殺死靶細胞或抑制靶細胞的生長(參見，例如，實施例6和7)。在一些實施方案中，供體細胞進一步包含了輔助質粒。在一些實施方案中，可轉移質粒是自我可轉移質粒。
在一些實施方案中，供體細胞包含含有編碼殺菌多聚氨基酸(例如，多肽或蛋白質)的核酸的非自轉移質粒(例如，pCON15-56A)，在優選的實施方案中，供體細胞進一步包含了編碼能中和供體細胞中非自體轉移質粒的多聚氨基酸的殺菌特性的多聚氨基酸的核酸(例如，一種免疫蛋白質；參見，例如，實施例2和4)。在優選的實施方案中，編碼中和多聚氨基酸的基因位于輔助質粒上，包括但不限于pCON1-93或pCON1-94。在一些實施方案中，能中和殺菌多聚氨基酸的多聚氨基酸被組成型啟動子控制。在一些實施方案中，能中和殺菌多聚氨基酸的多聚氨基酸被可誘導的啟動子控制。在實行本發明時不必理解機制，并且本發明不限于任何特定的作用機制，已經考慮到，在一些實施方案中，在供體細菌中能中和殺菌多聚氨基酸的多聚氨基酸和殺菌多聚氨基酸形成一種非毒性復合物，該復合物被分泌到供體細菌外面，該復合物或構成部分結合到靶細胞的受體上，被易位進入靶細胞并且隨后靶細胞死亡。
在一些實施方案中，殺菌多聚氨基酸被colE3基因編碼。本發明不限制使用的殺菌基因的類型。事實上多種殺菌基因被考慮到，包括但不限于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9和編碼溶菌酶的基因。在一些實施方案中，自體轉移型或非自轉移型質粒包含驅動殺菌蛋白表達的啟動子(例如，lac啟動子/操縱子)。在一些實施方案中，輔助質粒編碼能抑制殺菌基因表達的阻遏蛋白(例如lacI)。在一些實施方案中，阻遏蛋白被組成型啟動子控制，在一些實施方案中，阻遏蛋白被可誘導啟動子控制。
如上所述，在優選的實施方案中，本發明的供體細胞包含抑制或中和可轉移質粒表達的殺菌蛋白的免疫蛋白。本領域已知多對殺菌蛋白和相對應的免疫蛋白。在本發明中，列于上面的殺菌蛋白分別被相對應的大腸桿菌素A、大腸桿菌素B、大腸桿菌素D、大腸桿菌素Ia、大腸桿菌素Ib、大腸桿菌素K、大腸桿菌素N、大腸桿菌素E1、大腸桿菌素E2、大腸桿菌素E4、大腸桿菌素E5、大腸桿菌素E6、大腸桿菌素E7、大腸桿菌素E8、和大腸桿菌素E9免疫蛋白所抑制。本領域還已知其它的殺菌蛋白(例如，桿菌素(bacteriocins))和中和性免疫蛋白(參見，例如，在環球網網址us.expasy.org/cgi-bin/get-entries？KW＝Bacterioin％20immunity中的殺菌蛋白的示例性表格，瑞士生物信息學研究所(SwissInstitute of Bioinformatics，SIB)的ExPASy(專業蛋白質分析系統，Expert Protein Analysis System)蛋白組學服務器)。在一些實施方案中編碼免疫蛋白的基因被啟動子控制，其中所述啟動子是組成活性的。在一些實施方案中，啟動子是Pneo。在其它的實施方案中，編碼免疫蛋白的基因被可誘導的啟動子控制，在一些實施方案中，輔助質粒是pCON1-93或pCON1-94。
多種自體轉移和非自體轉移質粒被考慮在本發明中，例如，在一些實施方案中，本發明使用了質粒RSF 1010作為骨架來構建質粒。在一些實施方案中，質粒衍生于pACYC177。已經考慮到，包括本發明的質粒的組合物被用于研究和治療應用。
供體細胞 供體細菌 已經考慮到，在本發明中任意類型的細菌(例如，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌)能被用作供體細胞(參見，例如，實施例1)。可以采用一些方法來防止供體細菌的擴散(例如，生長)。除了使用不分裂細胞作為供體(參見，例如，美國專利申請10/884,257，2004年7月2日提交，其整體引入此處作為參考)以外，其它一些方法包括，但不限于，使用帶有溫度敏感突變(例如，氨酰tRNA合成酶和RNase P突變)、營養突變(例如，dapA和aroA)、絲氨酸突變和/或其它突變或氨基酸合成缺陷的供體。這些例子不意味著限制發明的范圍。本領域熟練人員將會立刻認識到有減弱供體細菌的替代方法。在本領域內這些突變體已經被分析并被充分了解，并且本領域熟練人員完全具有將這些突變引入到新獲得的細菌供體的能力。
在一些實施方案中，本發明的供體細菌細胞包含溫度敏感突變體。溫度敏感突變體與其同源野生型細菌相比在特定溫度范圍內異常生長，在突變體中，RNA或蛋白質的突變產生對穩定敏感的效果(例如，構象改變)，因此突變體可以在其允許溫度下在實驗室中生長；但是，它們在非允許(例如，較高)溫度(例如，在體溫下)下具有嚴重的生長缺陷。
這些突變的例子包括氨酰tRNA合成酶(參見，例如，Sakamoto等人，J Bacteriol 186，5899-5905(2004)；Martin等人，J Bacteriol179，3691-3696(1997))，和RNase P(Li，Rna 9，518-532(2003)；Li和Altman，Proc Natl Acad Sci U S A 100，13213-13218(2003))。氨酰tRNA合成酶催化，特定氨基酸和相對應的tRNA的3′末端腺苷的酯化作用，并且在所有生物體中RNase P在產生成熟的tRNA 5′末端中都是關鍵的(Gopalan等人，J Biol Chem 277，6759-6762(2002))。這些酶功能的缺陷防止了蛋白質在細胞中的合成。
在一些實施方案中(例如，當革蘭氏陽性細菌是目標時)，使用了革蘭氏陽性供體。革蘭氏陽性供體細菌包括，但不限于，芽胞桿菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、腸球菌(Enterococcus sp.)、鏈球菌(Streptococcus sp.)、乳(酸)桿菌(Lactobacillus sp.)和乳球菌(Lactococcus sp.)。在這些菌株中，乳(酸)桿菌和乳球菌尤其有用，因為這些菌種已經被用于食品工業中，并且在聯邦管理法規(Code of Federal Regulations，CFR)第21條(Title 21)中被分類為GRAS(公認為安全的)。對于這些革蘭氏陽性宿主來說，在其它質粒中，有可能使用接合質粒pAD1和/或pCF10，它們是被研究的最透徹的兩種革蘭氏陽性接合質粒(參見，例如，Hirt等人，J Bacteriol 187，1044-1054(2005)；Francia的人，Plasmid 46，117-127(2001))。這些質粒的接合裝置和RK2具有相當水平的相似性。根據文獻，考慮了在用于本發明時這些質粒能被修飾(參見，例如，實施例2)。這些修飾包括(還有其它的)產生可遷移質粒、整合細菌基因、和加入和刪減限制性內切酶切割位點。
在本發明的優選的實施方案中，在發明的質粒和供體細胞中采用某種特征來最小化因使用DNA或遺傳修飾的有機體而伴隨的對環境的潛在危險。例如，在環境敏感情況下可以優選使用非自體轉移質粒。因此，在一些實施方案中，質粒是通過接合裝置遷移的，而不是自體轉移的。如此處所述，在一些實施方案中這可以通過將所有的tra基因整合進宿主染色體來實現，其中所整合基因的產物是接合裝置組裝所必須的。在這種實施方案中，質粒被設置為僅擁有一個轉移起始位點(oriT)。這種特征防止受體進一步轉移質粒(在其死亡之前甚至之后)。
另一種生物安全性特征包括使用帶有預定宿主范圍的接合系統。如上面所述，已知某些元件僅在少數相關細菌(窄宿主范圍)中有功能，而其它的已知在許多不相關細菌(廣宿主范圍或泛宿主性)中也有功能(del Solar等人，Mol.Microbiol.32661-666，(1996)；Zatyka和Thomas，FEMS Microbiol.Rev.21291319，(1998))。并且，那些接合系統中的許多只能在革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌中發揮功能，通常不能在兩者中都發揮功能(del Solar，1996，supra；Zatyka and Thomas，1998，同上)。
在一些實施方案中，本發明的供體細菌細胞包括營養缺陷型突變體。本領域已知非常多的營養缺陷型突變體。引起這種表型的基因的例子有dapA和aroA。dapA編碼一種二氫吡啶二羧酸合酶(dihydropicolinate synthase)，該酶是植物和細菌(參見，例如，Ledwidge和Blanchard，Biochemistry 38，3019-3024(1999))中賴氨酸生物合成的關鍵酶，而aroA編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶，該酶催化芳香族氨基酸的合成的關鍵步驟(參見，例如，Rogers等人，Appl Environ Microbiol 46，37-43(1983))。這些突變體能在補充這些細菌缺乏的氨基酸的實驗室條件下生長。但是，在應用中，這些突變體因為缺乏關鍵的營養因子不能良好的生長。除了兩個實施例之外，本領域熟練人員知道有許多相似的營養缺陷型突變體能被使用。
在本發明中，通過避免使用抗生素抗性標記來最小化抗生素抗性的悄然增加。在一個優選的替代方法中，能突變負責一種氨基酸(例如，絲氨酸)合成的基因，在供體中產生對這種氨基酸的需求。這種突變細菌在它們含有帶有ser基因的質粒的情況下能在缺乏的所述絲氨酸的培養基中生長，該基因的產物是生長所需要的。相似的，能突變負責任意數量的管家功能的基因，因此細胞將不能生長，除非它們含有能提供被突變管家基因的有功能版本的質粒。
因此，發明考慮了含有Ser基因或許多其它營養遺傳標記中的一個、或者一種或多種管家基因的質粒的有益用途。這些標記允許來質粒在供體細胞中的選擇和維持。
另一種方法包括使用限制-修飾系統來調整質粒的宿主范圍。預計在分類學相關物種之間接合和質粒定居的發生頻率更高，其中質粒能避開限制系統并復制。II型限制型核酸內切酶在雙鏈DNA中特定的識別序列中或在其附近讓雙鏈斷裂。同源修飾酶能甲基化這個相同的序列并保護它不被切割。限制-修飾系統(RM)在細菌和古細菌中是普遍存在的，但是在真核生物中是不存在的。一些RM系統是質粒編碼的，而其它的在細菌染色體上(Roberts和Macelis，Nucl.Acids Res.24223-235，(1998))。當外源DNA例如病毒或質粒DNA沒有被合適的修飾酶修飾時，限制性酶切割這種DNA。用這種方法，細胞被保護免于外源DNA的入侵。因此，通過使用產生一種或多種甲基化酶的供體菌株，能避免一種或多種限制性酶的切割。使用定向誘變產生沒有特異性限制性位點或含有新位點的質粒DNA，分別來保護質粒DNA不受核酸內切酶的傷害或使其易受核酸內切酶的傷害。在一些實施方案中，使用了廣譜宿主范圍的質粒，僅簡單的通過不具有許多存在于窄宿主范圍質粒中的典型的限制性切割位點來規避限制系統(Wilkins等人，J.Mol.Biol 258，447-456(1996))。
在一些實施方案中，本發明利用了環境安全的細菌作為供體。安全細菌是本領域已知的。例如，已經報道了通過減毒的胞內革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌運輸DNA疫苗(Dietrich等人，2001 Vaccine 19，2506-2512；Grillot-Courvalin等人，1999 Current Opinion inBiotech.10，477-481)。此外，供體菌株可以是克隆身體的有菌部分(例如，皮膚、胃腸、泌尿生殖、嘴、鼻道、咽喉和上氣道系統)的數千種有害細菌中的一種，在一些優選的實施方案中，使用了低毒力的菌株。例如，大腸桿菌83972是獲自于一個瑞典女孩泌尿道的野生型菌株，該女孩被菌寄居3年，其間她沒有任何癥狀并且腎功能沒有受損。在人體實驗中已經證實大腸桿菌83972能暫時無癥狀的移殖到膀胱中。
1991年公布了大腸桿菌83972人體中的第一個實驗(Darouiche，R.O.和R.A.Hull，J Spinal Cord Med 23(2)136-412000(2000))。8名具有復發的有癥候的對常規抗生素療法UTI耐藥的歷史的婦女接受了總共15次定居嘗試。大腸桿菌83972在尿道中平均維持88天(范圍1-226天)。僅有一名受試者顯示出較低UTI癥狀，并且用抗生素對她成功地進行了治療；大腸桿菌83972是從她尿液中培養出的唯一生物體。其他7名病人顯示短暫的(＜48小時)膿尿和排泄尿白(細胞)介素IL-6和IL-8，但是沒有包括發燒、血白細胞數、排尿困難、血清IL-6、血清IL 8或紅細胞沉降率增加在內的系統體征和癥狀(Andersson，P.，I.Engberg，等人，Infect Immun 59(9)2915-21(1991)；Agace，等人，J Clin Invest 92(2)780-5(1993))。因此，大腸桿菌83972顯示出在體內引起極小的炎癥反應，參見，例如，美國專利6,719,991，所述專利在此處被整體引用作為參考。
非生育供體細胞 在另一種策略中使用了非生育供體來代替活細胞。例如，微細胞和大細胞是研究透徹的具有代謝活性但是不能生育的細菌細胞的模型系統。微細胞缺乏染色體DNA，是通過特殊的突變細胞經過沒有DNA復制的細胞分裂產生的。如果細胞含有多個拷貝的質粒，那么微細胞中有許多將含有質粒。微細胞既不分裂也不生長。但是，具有接合質粒的微細胞能接合復制并將質粒DNA轉移到活的受體細胞中(參見，例如，美國專利4,968,619)。
大細胞是被處理來破壞其染色體DNA的細胞，但是保留了其所含質粒的功能。能從在其關鍵DNA修復通路(recA、uvrA、和phr)中攜帶突變的大腸桿菌菌株中獲得大細胞。因為大細胞缺乏非常多的DNA修復功能，它們在暴露于低劑量的紫外線后死亡。重要的是，沒有接受紫外線輻射的質粒分子(例如，pBR322)繼續復制。在這種條件下能有效的發生轉錄和翻譯(質粒指導的)(Sancar等人，J.Bacteriol.137692-693(1979))，并且在輻射前產生的蛋白質足夠維持接合。這被下面兩個觀察所支持i)鏈霉素殺死的細胞存留活性供體，和ii)能在阻止基因重新表達的抗生素存在的情況下發生接合質粒的轉移(參見，例如，Heineman和Ankenbauer，J.Bacteriol.175.583-588(1993)；Cooper和Heineman，Plasmid 43，171-175(2000))。相應的，紫外線處理的大細胞將能夠轉移質粒DNA到活的受體中。還要注意的是，細菌間recA和uvrA基因的保守性將會允許供體菌株的大細胞，而不是獲得大腸桿菌。
在一些實施方案中，本發明利用了不分裂細胞(例如，在2004年7月2日提交的美國專利系列10/884,257中所描述的，其整體引入此處作為參考)作為供體細胞。不分裂細胞通常被處理，因此分裂和生長能力被去除而接合效果被保留下來。在優選的實施方案中，不分裂細胞被處理，因此染色體DNA被損壞，但是沒有被破壞到和創建大細胞中相同的程度。
在一些實施方案中，使用了沒有功能改造的微生物，無功能的原因是其對細胞功能(例如，細胞壁、蛋白合成、RNA合成，例如，如美國專利4,968,619中所述)關鍵的編碼基因含有穩定敏感突變。
對于許多方法來說，能夠使用條件復制質粒。這種質粒，能在供體中復制而不能在受體細菌中復制，僅因為它們的同源復制起始蛋白(例如，Rep)在前一種細胞中產生而不在后一種細胞中產生。在一些實施方案中，變種質粒在rep基因中含有溫度敏感突變，因此它只能在低于37℃的穩定下復制。因此，其復制將在細菌應用于皮膚上時發生，而如果這種細菌侵入到身體核心復制則不會發生。
在一些實施方案中，本發明提供了能殺死任意細菌細胞的組合物和方法。本發明不被靶細胞的類型所局限。例如，靶細菌細胞包括，但不限于，選自于沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、大腸桿菌屬(Escherichia)、腸道細菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、耶爾森菌屬(Yersinia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、愛文菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、摩根氏菌屬(Morganella)、動性球菌屬(Planococcus)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德菌屬(pasteurella)、支原菌屬(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、立克次體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、羅卡利馬氏體菌屬(Rochalimaea)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、兼性雙球菌屬(Gemella)、乳球菌屬(Lactococcus)、白聯珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pedicoccus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、加德納菌屬(Gardnerella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弓形菌屬(Arcobacter)、沃廉菌屬(Wolinella)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、華麗單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃肯菌屬(Eikenella)、黃色單胞菌屬(Flavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、寡源桿菌屬(Oligella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、威克氏菌屬(Weeksella)、黃(單包)桿菌屬(Kanthomonas)、博德特氏菌屬(Bordetella)、弗朗西絲氏菌屬(Franciesella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團桿菌屬(Legionella)、阿菲波菌屬(Afipia)、巴爾通氏體屬(Bartohella)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、螺旋菌屬(Spirillum)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、八迭球菌屬(Sarcinia)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃廉菌屬(Wolinella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、韋榮氏球菌屬(Veilonella)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬諾卡氏菌屬(Norcardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小多孢菌屬(Micropolysporas)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、密螺旋體(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、或衣原體(Chlamydiae)的那些。
在一些實施方案中，編碼蛋白質(例如細菌蛋白)的核酸序列在可轉移的或不可轉移的質粒(例如，RK2、R6K、pCU1、p15A、pIP501、pAM1、pCRG1600或PCON4-78)上編碼，并被置于擁有接合轉移質粒到受體細胞(例如，細菌的致病或非致病的屬)來表達蛋白質的能力的供體細胞(例如，細菌的致病或非致病的屬)中，在優選的實施方案中，在可接合轉移質粒上編碼的核酸序列的表達導致殺死受體/靶細胞。除了此處描述的那些以外，能用于本發明的示例性的供體細胞包括，但不限于，美國專利申請20040137002、20040224340和10/884,257的那些，其整體引入此處作為參考。
治療(Therapeutics) 本發明的組合物和方法能應用于人體治療和多種的獸醫、農藝、園藝以及食品加工應用。
對于人體和獸醫用途，并且根據細胞群體或保護的目標組織(例如，通過殺死致病靶細胞)，考慮了下面的給予本發明的組合物(例如，含有可轉移質粒的供體細菌細胞)的方式局部、口腔、鼻腔、肺/支氣管(例如，通過吸入劑)、眼、直腸、泌尿生殖器、皮下、腹膜內和靜脈內。優選的細菌以藥物制劑提供，在適用于為治療患者選擇的給予方式的運輸載體中。
例如，給予供體細菌細胞到胃腸道或鼻道或通過吃(單獨或摻入到受試者的飼料或食物中)。在這點上，需要注意前生命細菌，例如嗜酸乳(酸)桿菌，以含有低壓凍干的細菌細胞和固體支撐物(例如甘露醇)的混合物的凝膠膠囊的形式銷售。當凝膠膠囊和液體一起攝入時，低壓凍干的細胞重新水合并變為活的、有克隆性的(colono genic)細菌。因此，以相似的方式，本發明的供體細菌細胞能以粉末的、低壓凍干的制劑形式在凝膠膠囊中或在用于撒入食物或飲料的容器中提供。重新水合的、活的細菌細胞隨后將定居和/或移殖到上和下胃腸系統中的所有部位，并且隨后和目標致病細菌接觸。
對于局部應用，細菌可以被配制為軟膏或乳劑來涂抹于受影響的皮膚表面。軟膏或乳劑制劑也適用于直腸或陰道運輸，還有其它標準制劑，例如栓劑。合適的用于局部、陰道或直腸給藥的制劑是藥劑師所熟知的。
本發明將尤其適用于局部或粘膜給藥來治療多種細菌感染或細菌相關的不良癥狀。這些用途的一些代表性例子包括，但不限于，治療(1)嗜血桿菌引起的結膜炎；(2)綠膿假單胞菌引起的外耳炎；(3)許多革蘭氏陽性球菌和革蘭氏陰性桿菌引起的慢性(鼻)竇炎，并用于bronchii的(and for general decontamination of bronchii)；(4)與綠膿假單胞菌有關的囊性纖維化；(5)幽門螺旋桿菌(潰瘍)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門(氏)菌、彎曲桿菌和志賀(氏)桿菌引起的腸炎；(6)和陰道加德菌和其它厭氧菌關聯的公開WO 02/18605PCT/USOI/27028；和(12)多種生物體引起的齦炎和/或齒衰變。
本發明的供體細胞能被應用于皮膚(例如，灼傷或感染皮膚)作為治療劑或作為預防劑應用來防止細菌感染。考慮了通過一些運輸裝置將供體細胞應用于皮膚表面。
例如，本發明的組合物(例如包含殺傷質粒的供體細胞)能通過多種方法應用(例如，到皮膚灼傷或創傷表面上)，包括但不限于懸浮于溶液中(例如，膠體溶液)并應用于表面；被懸浮于溶液中并使用噴霧涂布器噴到表面上；和纖維蛋白膠混合并應用到(例如噴霧)表面上(例如，皮膚灼傷或創傷)；被浸漬到創傷敷料或繃帶上并將繃帶應用到表面(例如，感染或創傷)；通過控釋裝置應用；浸漬到無細胞生物基質的一側或兩側并隨后置于表面上(例如，皮膚灼傷或創傷)因此保護傷口和定居物界面；以脂質體形式應用；被注入到體腔(例如通過導管注入到膀胱)或應用于體腔的開口處(例如，應用于尿道開口)；或應用在聚合物上。
在實行本發明時不必理解機制，并且本發明不限于任何特定的作用機制，已經考慮到，在一些實施方案中，一旦在皮膚或創傷表面，供體細菌就和目標致病細菌接觸并通過接合過程讓抗菌基因進入目標病原體，殺死病原體。
供體細菌可以是細菌的任意菌株包括任意革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌。例如，在一些實施方案中，本發明提供了大腸桿菌、假單胞菌、克雷白(氏)桿菌、腸道細菌、不動桿菌、乳(酸)桿菌、乳球菌、葡萄球菌、鏈球菌、腸道球菌或擬桿菌作為供體細菌。在一些優選的實施方案中，供體細菌是大腸桿菌83972。參見，例如，Hull等人Infect Immun.Jan；67(1)429-32(1999)。
在其它的實施方案中，本發明的組合物和方法能應用于表面治療來減弱或生長抑制不需要的細菌(例如，病原體)。例如，處理用于侵入式治療(例如手術、導管插入術等)的表面來防止因表面上細菌污染造成的受試者感染。已經考慮到了本發明的方法和組合物能用于治療多種表面、物體、材料等(例如，醫療或急救器材、保育室和廚房設備和表面)來控制其細菌污染。
在其它的實施方案中，組合物能浸漬到可吸收材料中，例如縫線、繃帶和紗布，或覆蓋到固相材料的表面上，例如手術U形釘、拉鏈和導管來將組合物運輸到防止微生物感染的位點。此類型的其它運輸系統是本領域熟練人員所熟知的。
包含供體細菌的藥物制品被制備為劑量單位形式來方便給藥和劑量統一。如此處所用的劑量單位形式指的是，藥物制品的物質分割單位，適于別人接受治療。每個劑量應含有定量的供體細菌細胞來產生所需抗菌(例如，減弱病原性)效果，所述供體細菌細胞和選擇的藥物載體締合在一起。確定合適的劑量單位過程是本領域熟練人員所熟知的。
根據病人體重劑量單位可以成比例的增加或減少。可以通過劑量濃度曲線計算來確定消除靶細菌群體或組織中的致病細菌的合適的濃度，這是本領域已知的。
也設想了發明的供體細胞的其它用途。包括多種農業、園藝、環境和食品加工應用。例如，在農業和園藝中，能將多種植物致病菌作為靶點來使植物疾病減到最少。一個適合作為靶點的植物病原體的例子是“梨火疫病病菌(Erwinia amylovora)”，它是導致火燒病的病因。
可以利用相似的策略來減少或防止切花的萎蔫。在獸醫或動物農業中，發明的組合物(例如，質粒系統)能被摻入到動物飼料(雞、牛)中來減少生物負載(bio-burden)或減弱某種病原生物(例如，沙門氏菌)。在其它實施方案中，發明能用于肉或其它食物中來減弱或中和病原菌(例如，肉中的大腸桿菌0157:H7) 環境應用包括，例如，工程改造蘇云金桿菌和它的一種接合質粒來運輸并條件表達殺昆蟲劑(例如，控制散播瘧疾或西尼羅病毒的蚊子)，在此應用以及在上述的農業和園藝應用中，已經設想了質粒和供體細菌的溶液、氣溶膠或凝膠膠囊劑型。
實施例 提供下面的實施例來示范并進一步說明某些優選的實施方案和本發明的優選方面，并且不被解釋為對其范圍的限制。
在下面公開的實驗中，應用來下面的縮寫℃(攝氏度)；cm(厘米)；g(克)；1或L(升)；μg(微克)；μl(微升)；μm(微米)；μM(微摩爾)；μmol(微摩爾)；mg(毫克)；ml(毫升)；mm(毫米)；mM(毫摩爾)；mmol(毫摩爾)；M(摩爾)；mol(摩爾)；ng(納克)；nm(納米)；nmol(納摩爾)；N(當量)；pmol(皮摩爾)；bp(堿基對)；cfu(集落形成單位)；Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)；lacOP(編碼大腸桿菌lac操縱子/啟動子的區域)；Kan(卡那霉素抗性決定子)；Cm(氯霉素抗性決定子)；Tral(編碼負責接合轉移的基因的區域)；Control(編碼調控區域的區域)；oriV(編碼營養復制起點的區域)；oriT(編碼接合轉移起點的區域)；tetR(編碼tetA的抑制子的基因)；tetA(編碼對四環素抗性的基因)；Rep(編碼負責復制的基因的區域)；Primase(編碼參與復制的基因的區域)；Tra2(編碼負責交配對形成的基因的區域)；colE3(編碼大腸桿菌素E3的基因)；repA、repB和repC(編碼RSF1010的營養復制中的關鍵蛋白)；mobA、mobB和mobC(編碼負責RSF1010的遷移的蛋白)；編碼重復子的區域，ssiA和ssiB(營養復制起始) 實施例1 用于體外和體內檢測的供體 通過接合，質粒能以自體轉移或非自體轉移方式遷移。為了產生接合轉移產物，需要tra基因和oriT(轉移起始)DNA序列。tra基因產物識別oriT序列并在序列內產生單鏈缺口，并將這個單鏈質粒DNA遷移到受體細胞中。當所有的必需tra基因和oriT序列都位于一個質粒上時，該質粒被稱為自體轉移型，因為該質粒的受體細菌會變為有效的接合供體。相反，非自轉移型質粒攜帶有oriT序列，而沒有整套的tra基因。只有在相同供體細胞中反式提供tra基因的產物時(來自于染色體或其它質粒中編碼的基因)，該質粒才能遷移進入受體細胞中。在本發明開發過程中使用了大腸桿菌的衍生物(例如，K12、S17，參見，例如，Simon等人，Bio/Technologyl，784-791(1985))。這些菌株具有整合的RK2質粒，提供遷移質粒復制和接合轉移所必需的所有tra基因產物，所述遷移質粒例如微RK2或IncQ質粒(例如，RSF1010)。因此，在一些實施方案中，本發明使用自體轉移型質粒。
除了整合的tra基因以外，S17-1還是recA缺陷的，防止細胞中的多數同源重組。和親本菌株相比，recA-大腸桿菌生長明顯變慢，并且其緩慢的生長是防止該供體擴散的一個重要因素。下面描述了這種菌株的進一步修飾，用于本發明的組合物和方法中的使用。
動物宿主中因感染觸發炎癥的主要成分是脂多糖(LPS)，而S17-1也帶有LPS。LPS是細菌生存所必需的成分；因此去除該分子是不合理的方法。但是，LPS的某些修飾能讓細胞生長但是顯著降低炎癥反應。例如，msbB基因編碼負責肉豆蔻酰基團連接LPS的酶。從LPS中去除該酰基基團導致炎癥反應下降10到100倍(參見，例如，Low等人，NatBiotechnol 17，37-41(1999))。因此，在一些實施方案中，本發明提供了刪除(例如，通過基因置換)msbB基因的S17-1。我們使用常規的分子遺傳技術(基因置換，參見，例如，Court等人，Annu RevGenet 36，361-388(2002)；和Gong等人，Genome Res 12，1992-1998(2002))在S17-1中刪除msbB。根據此方法設計的新產生的大腸桿菌供體菌株被命名為CON4-11c。
測定了這種msbB缺陷菌株的接合效率，和對照相比其接合效率沒有可檢測的差別。因此，對治療應用來說這是一種非常有用的菌株，因為它觸發較少的炎癥并不損害接合效率。在體外和體內試驗中都使用了該菌株，來證明本發明的組合物和方法的有效性和廣泛的應用范圍。
實施例2 構建非自轉移型殺傷質粒 RK2是一種廣宿主范圍質粒，并能夠在幾乎所有的革蘭氏陰性細菌中復制。但是，它的接合效率根據不同的受體菌株而發生變化，并且綠膿假單胞菌是這些相對較差的接合受體之一，相反，IncQ組的質粒(例如，RSF1010)是遷移質粒，并且利用了RK2提供的tra基因產物(參見，例如，Less1等人J Bacteriol 174，2493-2500(1992)；Tietze，Microbiol Mol Biol Rev 65，481-496(2001))。使用綠膿假單胞菌作為受體比較了RSF1010和RK2的接合效率。結果顯示，RSF 1010和該細菌的接合比RK2大約好100倍。因此，使用RSF1010作為骨架用于構建殺傷質粒。產生的這種質粒的一個例子是pCON15-56A(參見，例如，圖5)。
為了產生pCON15-56A，RSF1010的PstI-NotI片段被攜帶有colE3和來自于RK2的tetA的PstI-NotI片段所置換，來產生pCON15-56A。colE3被lac啟動子/操縱子lacPO所控制，在存在lac抑制子LacI以及在培養基中存在葡萄糖的情況下被嚴格抑制，在lacPO前面，克隆了轉錄終止子來防止因lacPO前發生的通讀轉錄造成的colE3的泄露表達。RSF1010還攜帶有鏈霉素和磺胺耐藥性決定子，但是在構建pCON15-56A過程中把它們刪除來。下面顯示來載體的簡圖。
在一些實施方案中，使用colE3作為殺菌基因。只要在培養基中加入葡萄糖，colE3在質粒上就被緊密抑制(參見，例如，Anthony，JMicrobiol Methods 58，243-250(2004))。這種高效毒素是一種核糖核酸酶，在16S核糖體RNA的3′末端特異性地切割保守的核酸序列(參見，例如，Bowman等人，Proc Natl Acad Sci U S A 68，964-8(1971))。但是，當攜帶有這種質粒的供體暴露于不含大量葡萄糖的環境(例如，在創傷部位)時觀察到了泄漏表達。當這種情況發生時(即，只要細菌開始表達colE3)，因為該毒素的表達供體細胞會被殺死。為了避免該情況，在相同宿主細菌中引入輔助質粒。這種輔助質粒pCON1-94攜帶有編碼一種針對毒素的免疫蛋白的immE3(參見，例如，Jakes和Zinder，Proc Natl Acad Sci U S A 71，3380-3384(1974))和lacPO的抑制子lacI。
pCON1-94質粒的骨架衍生自pACYC177。使用組成型啟動子Pneo(來自于Tn5的表達新霉素耐藥性決定子的啟動子)來表達immE3。LacI在其自身的來自于lacIQ的啟動子的控制下表達。這種質粒具有卡那霉素耐藥性決定子KmR。質粒pCON15-56A和pCON1-94是能共存的，并合適的選擇壓力下(卡那霉素和四環素)在大腸桿菌宿主中穩定維持。pCON1-94的結構在圖6中描繪。
實施例3 監測接合 使用常規的過濾接合法檢測接合效率。該方法在本領域中是成熟的方法(Merryweather等人，J Bacteriol 167，12-17(1986)。其過程見圖1所示。在對兩個平板上的菌落進行計數后，使用公式計算接合效率
簡而言之，供體和靶細胞在含有合適的抗生素的Luria Bertani(LB)培養基中生長過夜，使用相同數量的供體和受體/靶細胞用于過濾接合。接合后，細胞被連續稀釋，并點到LB-抗生素平板上檢測集落形成單位(cfu)。通過兩種選擇性標記(RifR TetR)選擇接合后體，選擇標記防止細胞混合懸液中的供體和靶細菌的生長。使用含有Rif的LB平板計算受體細胞的總數量(參見，例如，圖1A)。隨后，檢測了使用接合質粒pCON4-45的接合效率。pCON4-45是RK2的衍生體，刪除了6kb的包含有RK2上的IS21和Par/Mrs區域的NsiI-AsiSI片段。這個刪除的區域對于這種質粒的接合是非必需的。因此，pCON4-45是自體轉移型質粒。過濾接合后，細胞被系列稀釋用于在Rif和Rif/Tet平板上鋪板(參見，例如，圖1B)。在兩種平板上計算菌落數量，并計算接合效率。
實施例4 pCON15-56A的接合和殺死效果 如實施例2所述構建非自轉移型殺傷性質粒pCON15-56A(參見，圖5)。使用大腸桿菌作為受體/靶監測質粒的接合和殺死效果。使用常規的過濾接合法監測接合效率(參見，實施例3和圖1B)。為了監測接合效率，使用攜帶有immE3基因的大腸桿菌菌株來中和進入的毒素基因來防止受體被殺死。
攜帶有pCON15-56A和pCON1-94的供體細菌能向培養基中分泌活性ColE3毒素，并殺死附近的ColE3敏感細菌。ColE3復合物和它的免疫蛋白ImmE3形成復合體，并分泌到供體細菌外。這種復合體結合到大腸桿菌表面的受體上(James等人，Microbiology 1421569-1580(1996))，毒素易位進入細胞，隨后細胞死亡。在過濾接合過程中，供體和受體/靶細胞混合在一起，而大腸桿菌素敏感的受體/靶能被供體細胞周圍的分泌的毒素以不依賴接合的方式殺死。但是，當這種受體發生突變時，因為毒素不能易位進入細胞，所以攜帶有這種突變的大腸桿菌菌株不再被ColE3殺死。象這樣的突變體(例如，在ColE3受體中含有突變的大腸桿菌)被用作受體，用于將依賴接合型殺傷從不依賴結合型殺傷中區分出來。這種突變的大腸桿菌菌株被命名為RL315-E3R，并且也是K12的衍生體。
隨后檢測了殺傷質粒的接合和殺傷效率。使用過濾接合法(如實施例3所述)來介導接合。接合后，收獲供體和受體細胞的混合物，并系列稀釋。系列稀釋的細胞懸液被點到含有利福平(rifampicin)/四環素的一套LB平板上來選擇性生長接合后體。特異性的，供體細胞(con4-11c/pCON15-56A/pCON1-94)被接合到兩種不同的大腸桿菌菌株上一種對殺傷質粒(RL315-E3R)敏感，而另一種是抗性的(RL315-E3R/pCON1-94)。抗性菌株攜帶有具有immE3的輔助質粒，因此被保護免于受到殺傷質粒上的colE3的作用。在過濾接合后，供體和受體細胞的混合物被系列稀釋，并被點到Rif/Tet平板上，在這些平板上只有接合后體能夠生長。列‘a’顯示了ColE3敏感菌株作為受體的結果，而列‘b’顯示了ColE3抗性菌株作為受體的結果。
抗性菌株的存活表明殺傷質粒被成功的轉移進入到受體菌株中。因此，敏感菌株的生長缺乏表明這些細胞被轉移的ColE3基因的表達所殺傷，而不是因為選擇性生長培養基(參見圖2，從上到下，稀釋度如下×1，×102，×104和×106)。
從殺傷質粒或非殺傷質粒處理的受體中分別計數了大約55和6×106個生長菌落(參見，例如，圖2)。這兩個數字的對比說明用殺傷質粒處理的接合后體的存活率大約為0.001％。因此，使用此處所述的組合物，本發明提供了非常有效率的和有效的殺死靶細菌細胞的方法。
實施例5 體內效果檢測 使用實施例4中所述的供體/質粒對，使用鼠灼傷/膿血病模型，檢測了體內效果。簡單的說，實驗動物通過浸入100℃水中9秒接受3級全厚度(15％總體表面積)背側燙傷。隨后將綠膿假單胞菌PA14局部應用于灼傷傷口處。已經顯示這種菌株對于一些宿主包括植物、蠕蟲和動物是有毒力的(Rahme等人Science 268，1899-1902(1995))。根據其OD600計算將病原體的數量調節為2×104cfu。隨后立即使用不同數量的包含質粒的供體細胞，并監測動物的生存率。
3天后幾乎所有的單獨暴露于PA14的小鼠都死亡了，并且在第5天所有的都死亡(參見，例如，圖3)。但是，暴露于PA14和含有殺傷質粒的供體細菌的小鼠顯著降低了死亡率。在第10天，對不同處理組之間的生存動物百分比進行來比較并計算了P值。所有的P值都小于0.000001，表明未處理小鼠(即，灼傷加病原體)和處理小鼠(即，灼傷加病原體加所有劑量的供體細菌細胞)之間的差異是高度顯著的。
實施例6 構建新的殺傷質粒 RSF1010是屬于IncQ組的可遷移質粒。使用一些接合系統包括RK2(Less1等人，J Bacteriol 174，2493-2500(1992))，該組質粒能夠接合遷移。當RK2和RSF1010共存于一個細菌中時，RK2提供的接合裝置能非常有效的遷移RSF1010。因為對宿主細菌的復制因子依賴性較小，該質粒能非常有效地接合綠膿假單胞菌，并且在實施例3中的過濾接合檢測中經常達到100％的效率。RSF1010和RK2被組合在一起來產生自體轉移型質粒來有效地接合綠膿假單胞菌。
特別的，衍生自RK2的tra基因和RSF1010的骨架結合在一起產生了pCON19-79。來自于RK2的oriT序列被誘變處理來防止質粒從該區域轉移。通過刪除源自RK2的復制起點oriV去除RK2的質粒復制功能。不同的是，pCON19-79利用源自RSF1010的oriT和oriV來分別進行質粒的遷移和復制。colE3在lacPO啟動子的控制之下，并且其泄漏表達被該質粒前面串聯位置的轉錄終止子所進一步抑制(參見，例如，Anthony等人，J Microbiol Methods 58，243-250(2004))。
RK2上tra基因的表達成功地被其自身質粒編碼的一套抑制子蛋白所調整(Bingle等人，Mol Microbiol 49，1095-1108(2003))。沒有這些抑制子，質粒中的tra基因的組成型表達會變得對宿主細胞致死性的，大概是因為在細菌細胞被膜中形成了微孔(Grahn等人，JBacteriol 182，1564-74(2000))。我們把這種抑制子降低型接合質粒導致的高水平的組成型tra表達稱為CDC(ConstitutivelyDerepressed Conjugation，組成型脫阻抑接合)。該質粒的結構如圖7所示。
pCON1-93(參見圖8)被設置為為使用殺傷基因和強大的質粒轉移來最大化受體/靶殺傷。在輔助質粒pCON1-93的伴隨下該質粒能在大腸桿菌供體中維持(例如，con4-11c，參見實施例1)。輔助質粒攜帶有編碼針對大腸桿菌素E3的免疫蛋白immE3，并且該質粒的結構如圖8所示。pCON1-93的骨架源自于pUC19，并且通過PCR擴增immE3并克隆到質粒中。immE3在組成型啟動子Pneo(新霉素耐藥性決定子的啟動子)的控制之下。
這兩種質粒，pCON19-79和pCON1-93，在大腸桿菌供體CON4-11c(實施例1)中維持，并用于體外的殺傷實驗。
實施例7 新質粒改善的體外殺傷示例 檢測來開發作為本發明的一部分的新殺傷質粒(例如，參見實施例6)的殺傷能力。除了此處討論的新質粒以外，還設計了一種新的檢測來證明本發明的質粒(例如，實施例6的質粒pCON19-79和pCON1-93)的增強的殺傷能力。在這個實施例中，使用了兩種不同的綠膿假單胞菌菌株和一種鮑氏不動桿菌菌株。兩種綠膿假單胞菌菌株都是臨床分離的菌株。其中一個分離自受傷病人，顯示對多種抗生素有耐藥性(PanR多抗生素耐藥)。鮑氏不動桿菌與灼傷和/或創傷有關，并且經常被發現對多種臨床有用的抗生素有耐藥性，因此成為主要的健康威脅。兩種綠膿假單胞菌菌株都是利福平抗性的，而鮑氏不動桿菌菌株不是。如實施例2所述，需要合適的選擇標記來監測接合效率，并且使用利福平抗性來選擇性生長受體菌株。通過在染色體DNA上的自發突變獲得利福平抗性突變。簡而言之，鮑氏不動桿菌的過夜生長培養物被涂布到含有利福平的LB平板上，分離在這些平板上生長的突變體用于后續實驗。靶菌株的過夜生長的細菌培養物覆蓋到含有利福平的LB平板上。
攜帶有殺傷質粒(例如，實施例6的質粒)的供體細菌生長過夜，被系列稀釋，并點到靶細菌的菌苔上面。只有受體/靶細菌以及接合后體能在含有利福平的LB平板上選擇性生長。如果殺傷質粒遷移并有效殺死了受體細胞，供體斑點區域維持澄清，留下生長抑制地帶。該實驗策略如圖4A所示。
簡而言之，供體細菌的細胞懸液被點到均勻涂布在含有利福平的LB平板上的靶細菌的表面上。在利福平的存在下，只有靶細菌能夠生長。當靶細胞被供體細菌殺死時，點上細胞懸液的區域變得澄清，因為供體和靶細菌的生長都被抑制了。如果供體對靶細菌沒有效果(例如，如果供體不殺死受體/靶細菌或減弱其生長)，點上的區域就會變得被生長的靶細胞所覆蓋。因此，使用這種檢測方法能夠測定新構建的供體/質粒對對于三種病原體的效果(參見，例如，圖4B)。
每種病原體都用非殺傷質粒(處理′a′)和殺傷質粒(處理′b′)處理。如圖4B所示，殺傷質粒(即，實施例6中產生的pCON19-79)在病原體菌苔上形成了生長抑制地帶(在圖4B中顯示為變黑斑點)，證明了質粒殺死靶細菌的能力。要注意的是，供體細菌向培養基中分泌少量的大腸桿菌素E3。但是，在此實驗中檢測的每種病原體都對培養基中的毒素不敏感，有可能是因為它們在細胞表面缺乏這種毒素的受體。
實施例8 pCON19-79的體內效果檢測 對于實施例6產生的質粒pCON19-79進行了和實施例5中完成的那些實驗相似的實驗。簡而言之，通過浸入85℃的水中9秒使實驗動物帶上3級12％TBSA(總體表面積)背側燙傷。隨后將綠膿假單胞菌PA14局部應用于灼傷傷口。應用PA14后，立即將攜帶有pCON19-79的供體細胞以不同劑量應用于灼傷表面。監測10天的小鼠的生存率。接受2×104cfu綠膿假單胞菌PA14處理而未應用包含有pCON19-79的供體細胞的52只對照小鼠中有42只在應用綠膿假單胞菌PA14到灼傷部位后的6天之內死亡(見表1，下面)。而和對照組相比，接受2×104cfu綠膿假單胞菌PA14加多種劑量的含有pCON19-79的供體細胞處理的小鼠顯示顯著改善的生存率(參見，例如，圖9)。例如，在接受2×104cfu綠膿假單胞菌PA14和1.3×1010cfu供體細胞處理的52只小鼠中，沒有一只在應用后10天內死亡。當使用較低劑量的供體細胞時觀察到了死亡率的顯著改善(參見，例如，圖9)。
在上面詳述中提到的所有出版物和專利在此處引用作為參考。發明描述的組合物和方法的多種修改和變化對于本領域熟練人員是明白的，沒有脫離發明的范圍和精神。雖然發明和特定的優選的實施方案結合在一起進行描述，但是應該了解所權利要求的發明不應當被不適當的限制在這些特定的實施方案中。事實上，所描述的執行發明的模型的多種修改對于相關領域的那些熟練人員是明白的，屬于本發明的范圍內。
權利要求
1.一種處理組織的方法，包括將組織暴露于供體細胞中，其中所述供體細胞包含
i)包含編碼殺菌蛋白的基因的重組的可轉移質粒；和
ii)包含編碼免疫蛋白的基因的輔助質粒，其中所述免疫蛋白被設置為抑制所述殺菌蛋白；
其中所述供體細胞被設置為接合性地轉移所述重組的可轉移質粒到受體細胞中，并且其中所述重組的可轉移質粒被設置為為在所述受體細胞中表達所述的編碼殺菌蛋白的基因。
2.權利要求1的方法，其中所述的編碼殺菌蛋白的基因的表達對于所述受體細胞是致死的。
3.權利要求1的方法，其中所述殺菌蛋白是大腸桿菌素。
4.權利要求3的方法，其中所述大腸桿菌素是colE3。
5.權利要求1的方法，其中所述殺菌蛋白選自于colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9和溶菌酶。
6.權利要求1的方法，其中所述免疫蛋白結合所述殺菌蛋白。
7.權利要求4的方法，其中所述免疫蛋白是immE3。
8.權利要求1的方法，其中所述免疫蛋白選自于大腸桿菌素A、大腸桿菌素B、大腸桿菌素D、大腸桿菌素Ia、大腸桿菌素Ib、大腸桿菌素K、大腸桿菌素N、大腸桿菌素E1、大腸桿菌素E2、大腸桿菌素E4、大腸桿菌素E5、大腸桿菌素E6、大腸桿菌素E7、大腸桿菌素E8、和大腸桿菌素E9免疫蛋白。
9.權利要求1的方法，其中對所述組織的所述處理包含處理所述組織中的創傷。
10.權利要求9的方法，其中所述創傷包含灼傷。
11.權利要求1的方法，其中在所述組織暴露于所述供體細胞之前所述組織和受體細胞接觸。
12.權利要求1的方法，其中在所述組織暴露于所述供體細胞之前所述所述組織不和受體細胞接觸。
13.權利要求1的方法，其中所述組織是皮膚。
14.權利要求1的方法，其中所述重組的可轉移質粒是可自我轉移的。
15.權利要求1的方法，其中所述重組的可轉移質粒選自于pCON15-56A、pCON19-79。
16.權利要求1的方法，其中所述輔助質粒選自于pON1-93和pCON1-94。
17.權利要求1的方法，其中所述受體細胞包含細菌細胞。
18.權利要求17的方法，其中所述細菌細胞是病原性細菌細胞。
19.權利要求18的方法，其中所述細菌細胞屬于選自下述的菌屬沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏桿菌屬(Shigella)、大腸桿菌屬(Escherichia)、腸道細菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)、耶爾森菌屬(Yersinia)、檸檬酸細菌屬(Citrobacter)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、愛文菌屬(Ewingella)、克羅非菌屬(Kluyvera)、摩根氏菌屬(Morganella)、動性球菌屬(Planococcus)、口腔球菌屬(Stomatococcus)、細球菌屬(Micrococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、弧菌屬(Vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、(Plessiomonas)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、放線桿菌屬(Actinobacillus)、巴斯德菌屬(Pasteurella)、支原菌屬(Mycoplasma)、脲原體屬(Ureaplasma)、立克次體(Rickettsia)、柯克斯氏體屬(Coxiella)、羅卡利馬氏體菌屬(Rochalimaea)、埃里希氏體屬(Ehrlichia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、氣球菌屬(Aerococcus)、兼性雙球菌屬(Gemella)、乳球菌屬(Lactococcus)、白聯珠菌屬(Leuconostoc)、片球菌屬(Pedicoccus)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、隱秘桿菌屬(Arcanobacterium)、放線菌屬(Actinomyces)、紅球菌屬(Rhodococcus)、李斯特菌屬(Listeria)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、加德納菌屬(Gardnerella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、弓形菌屬(Arcobacter)、沃廉菌屬(Wolinella)、纏繞桿菌屬(Helicobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、華麗單胞菌屬(Chryseomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、埃肯菌屬(Eikenella)、黃色單胞菌屬(Flavimonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、摩拉克氏菌屬(Moraxella)、寡源桿菌屬(Oligella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、威克氏菌屬(Weeksella)、黃(單包)桿菌屬(Xanthomonas)、博德特氏菌屬(Bordetella)、弗朗西絲氏菌屬(Franciesella)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、軍團桿菌屬(Legionella)、阿菲波菌屬(Afipia)、巴爾通氏體屬(Bartonella)、莢膜菌屬(Calymmatobacterium)、心桿菌屬(Cardiobacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、螺旋菌屬(Spirillum)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、消化球菌屬(Peptococcus)、八迭球菌屬(Sarcinia)、糞球菌屬(Coprococcus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸菌屬(Propionibacterium)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、羅氏菌屬(Rothia)、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、嗜膽菌屬(Bilophila)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、沃廉菌屬(Wolinella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、韋榮氏球菌屬(Veilonella)、諾卡氏菌屬(Norcardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、擬諾卡氏菌屬(Norcardiopsis)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、小多孢菌屬(Micropolysporas)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、密螺旋體(Treponema)、包柔氏螺旋體屬(Borrelia)、鉤端螺旋體屬(Leptospira)、或衣原體(Chlamydiae)。
20.包括供體細胞的組合物，所述供體細胞包含
i)包含編碼殺菌蛋白的基因的重組的可轉移質粒；和
ii)包含編碼免疫蛋白的基因的輔助質粒，其中所述免疫蛋白被設置為抑制所述殺菌蛋白；
其中所述供體細胞被設置為接合性地轉移所述重組的可轉移質粒到受體細胞中，其中所述重組的可轉移質粒被設置為在所述受體細胞中表達所述的編碼殺菌蛋白的基因。
21.權利要求20的組合物，其中所述殺菌蛋白是大腸桿菌素。
22.權利要求21的組合物，其中所述大腸桿菌素是colE3。
23.權利要求20的組合物，其中所述殺菌蛋白選自colA、colB、colD、colIa、colIb、colK、colN、colE1、colE2、colE4、colE5、colE6、colE7、colE8、colE9和溶菌酶。
24.權利要求20的組合物，其中所述免疫蛋白結合所述殺菌蛋白。
25.權利要求22的組合物，其中所述免疫蛋白是immE3。
26.權利要求20的組合物，其中所述免疫蛋白選自于大腸桿菌素A，大腸桿菌素B、大腸桿菌素D、大腸桿菌素Ia、大腸桿菌素Ib、大腸桿菌素K、大腸桿菌素N、大腸桿菌素E1、大腸桿菌素E2、大腸桿菌素E4、大腸桿菌素E5、大腸桿菌素E6、大腸桿菌素E7、大腸桿菌素E8、和大腸桿菌素E9免疫蛋白。
27.權利要求20的組合物，其中所述可轉移質粒包含RSF1010的oriT和oriV，并且其中所述編碼ColE3的基因在lac啟動子/操縱子的控制之下。
28.權利要求20的組合物，其中所述編碼免疫蛋白的基因在啟動子的控制之下，其中所述啟動子是組成型活性的。
29.權利要求28的組合物，其中所述啟動子是Pneo。
30.權利要求20的組合物，其中所述的編碼免疫蛋白的基因在啟動子的控制之下，其中所述啟動子是可誘導的。
31.權利要求20的組合物，其中所述可轉移質粒是pCON15-56A或pCON19-79。
32.權利要求20的組合物，其中所述輔助質粒是pCON1-93或pCON1-94。
33.處理表面的方法，包括向所述表面提供包含供體細胞的組合物，其中所述供體細胞包含
i)包含編碼殺菌蛋白的基因的重組的可轉移質粒；和
ii)包含編碼免疫蛋白的基因的輔助質粒，其中所述免疫蛋白被設置為抑制所述殺菌蛋白；
其中所述供體細胞被設置為接合性地轉移所述重組的可轉移質粒到受體細胞中，其中所述重組的可轉移質粒被設置為在所述受體細胞中表達所述的編碼殺菌蛋白的基因。
34.權利要求33的方法，其中所述表面存在于醫學裝置、創傷護理裝置、體腔裝置、人體、動物體、個人保護裝置、生育控制裝置和藥物運輸裝置中的一種或多種上。
35.權利要求33的方法，其中所述表面包含硅、塑料、玻璃、聚合物、陶瓷、光致抗蝕劑、皮膚、組織、硝酸纖維素、水凝膠、紙、聚丙烯、衣服、棉花、羊毛、木、磚、皮革、乙烯樹脂、聚苯乙烯、尼龍、聚丙烯酰胺、光導纖維、天然纖維、尼龍、金屬、橡膠或它們的復合物。
36.權利要求33的方法，其中所述處理抑制受體細胞在所述表面上的生長。
37.權利要求36的方法，其中所述處理殺死與所述表面發生接觸的受體細胞。
38.權利要求33的方法，其中所述質粒是可自我轉移的。
39.處理表面的方法，包括
a)提供包含供體細胞的組合物，其中所述供體細胞包含一種或多種選自于pCON15-56A、pCON19-79、pCON1-93和pCON1-94的質粒；和
b)將所述組合物暴露于所述表面。
40.權利要求1的方法，其中所述供體細胞是低毒力細菌細胞。
41.權利要求40的方法，其中所述低毒力細菌細胞是大腸桿菌(E.coli)83972細胞。
42.權利要求1的方法，其中所述組織是膀胱組織。
43.權利要求20的組合物，其中所述供體細胞是低毒力細菌細胞。
44.權利要求20的組合物，其中所述低毒力細菌細胞是大腸桿菌83972細胞。
45.權利要求33的方法，其中所述供體細胞是低毒力細菌細胞。
46.權利要求45的方法，其中所述低毒力細菌細胞是大腸桿菌83972細胞。
47.權利要求34的方法，其中所述表面是膀胱組織。
48.權利要求34的方法，其中所述表面包括導管表面。
全文摘要
本發明涉及細菌學領域。特別的，本發明涉及用于改變(例如抑制)病原性微生物種群的生長和毒力的新的組合物和方法。
文檔編號C12N5/02GK101223269SQ200680024955
公開日2008年7月16日 申請日期2006年5月26日 優先權日2005年5月26日
發明者M·菲盧托維奇, H·鈴木 申請人:康尤戈恩公司