專利名稱：重組金黃色葡萄球菌腸毒素m及制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物工程，涉及一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素M(Staphylococcal Enterotoxin M，SEM)的制備以及在制備用于刺激淋巴細胞增殖、抑制腫瘤細胞生長的藥物中的用途。
背景技術：
1989年，超抗原的概念由瑞典科學家White提出，它是一類由細菌、病毒、寄生蟲產生的對淋巴細胞有強大刺激功能的蛋白質，由于其對T淋巴細胞的激活能力是普通抗原的2000-50000倍，故稱為超抗原。金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin，SE)是目前全世界范圍內廣泛研究的一種超抗原。其中研究最為深入的主要包括A型金黃色葡萄球菌腸毒素(StaphylococcalEnterotoxin A，SEA)、B型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal EnterotoxinB，SEB)、C2型金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin C2，SEC2)等。
與普通抗原不同，腸毒素超抗原首先以完整分子結合于抗原提呈細胞(APC)表面的II類主要組織相容性復合體(MHC)的抗原結合溝槽外側，而后與T細胞表面的抗原受體分子(TCR)的Vβ區結合，形成SE-MHC-TCR三分子復合物后大量激活T細胞。由此激活的T細胞可直接殺傷表達MHC-II類分子的腫瘤細胞，而對不表達MHC-II類分子的腫瘤細胞也可產生間接的殺傷效應。同時，被SE激活的CD4+T細胞可分泌大量細胞因子，如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，對腫瘤細胞有強烈的殺傷作用。IL-2等因子亦可激活NK細胞，使其發揮自然殺傷作用，IFN-γ、TNF-α等細胞因子還可促進腫瘤細胞的MHC-II類分子的表達，增強T細胞的識別。因此，經SE激活的T細胞能對腫瘤細胞和腫瘤組織產生高效的直接或者間接的殺傷作用。如Perabo等人證實經SEB刺激的外周血單核細胞(PBMC)能高效誘導人膀胱癌細胞株RT112細胞和RT4細胞調亡。Hedlund等人進行的體內實驗表明，SEA激活T細胞使之增殖作用在每只小鼠0.1-100μg范圍內呈劑量依賴關系，注射后1天出現最大效應，增殖效應維持4天。為提高在腫瘤治療中的靶向性和特異性，人們針對不同腫瘤細胞表面特異性抗原，制備了多種相關抗原的單抗—超抗原融合蛋白或將單抗與超抗原偶聯，大大增強了所激活的T細胞對腫瘤細胞和腫瘤組織的靶向性，使其能特異地殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤生長。此外，人們還利用腫瘤細胞表面過度表達的受體的配體制備了配體—超抗原融合蛋白，有效地提高了由此激活的T細胞對腫瘤組織的靶向性。另外，將超抗原基因轉染腫瘤細胞，將超抗原修飾的腫瘤細胞作為瘤苗繼而免疫動物，亦獲得了令人滿意的抵抗腫瘤細胞再次攻擊的效果。
在我國，以金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)為主要有效成分的金黃色葡萄球菌濾液制劑作為腫瘤防化療治療的輔助藥物應用于臨床已有近十個年頭，大量的臨床數據證明使用后腫瘤患者的免疫能力獲得了顯著的提高，患者的食欲、睡眠以及全身狀況均得到了明顯好轉。如羅鋒等對35例淺表轉移性腫瘤應用金葡菌濾液制劑進行局部治療，治療一個月后總有效率達82.9％。湯煒等通過對早期口腔癌采用局部金葡菌濾液制劑治療及對晚期口腔癌應用金葡菌濾液制劑聯合化療，發現其可使大量淋巴細胞及纖維組織聚集在癌巢附近，并能觀察到腫瘤細胞顯著減少甚至部分病例腫瘤細胞消失。吳潔等將金葡菌濾液制劑作為化療的輔助藥物應用于食管癌治療，結果顯示與對照組相比，可明顯升高白細胞，減輕胃腸道反應。
盡管目前以SEC為主要有效成分的金葡菌濾液制劑已取得廣泛的應用，但由于制劑中存在著大量的蛋白質以及多肽類雜質，而主要有效成分腸毒素相對含量極低，使得一部分腫瘤患者在該制劑臨床使用過程中出現了一定程度的相似副反應。如，李洪等報道了分別有28％和24％的腫瘤患者在使用金葡菌濾液制劑并聯合卡鉑治療惡性胸腔積液過程中出現了發熱和局部疼痛等副反應。劉秀英等在對鼻咽癌患者使用金葡菌濾液制劑聯合放療治療的過程中觀察到的主要副作用為中、低度發熱，約占治療組患者總數的5％。黎佳全等也報導了患者在應用金葡菌濾液制劑聯合順鉑治療惡性胸水過程中出現的主要副作用為發熱，約占治療組患者總數的65.5％。雖然這些副反應基本是暫時性的，癥狀可以自行緩解或者通過對癥治療進行消除，但仍然對腫瘤患者的治療和康復造成了不良的影響。因此，對于目前金葡菌濾液制劑在臨床應用中遇到的問題，需要制備高純度的腸毒素并建立嚴格可控的質量標準逐步克服解決，以求減少在使用過程中產生的毒副作用并增強其腫瘤抑制療效。目前，已經有人利用基因工程手段制備金黃色葡萄球菌腸毒素超抗原，如姜永強等將SEA、SEB、SEC1基因片段克隆至pBV220，在大腸桿菌中經熱激誘導獲得表達，但這些方法中純化步驟均采用了離子交換的方法，存在吸附選擇特異性差等弱點。徐明愷等將SEC2基因克隆至pET-28a中表達，但表達的重組產物比天然蛋白增加36個氨基酸，因此抗原決定簇及產物活性改變的可能性均較大。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種利用基因工程手段制備獲得的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M(Staphylococcal Enterotoxin M，SEM)，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列。本發明利用其超抗原活性應用于體外促脾淋巴細胞增殖和以及體外抑制腫瘤細胞生長，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C(Staphylococcal Enterotoxin C，SEC)進行超抗原活性比較。
本發明的另一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素M(SEM)的制備方法，本發明構建一種可用于表達金黃色葡萄球菌腸毒素M的重組質粒，該質粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經過重組構建而成，質粒見說明書附圖4。
本發明方法具體通過以下步驟實現(1)設計一對分別帶有BamH I和Xho I酶切位點的上下游引物SEQ IDNO.45’-cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcg ca-3′(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點)，SEQ ID NO.55’-gcc tcg agt caa ctt tcg tcc tta taa gat att tct ac-3’(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點)，以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組為模板，采用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增獲得編碼SEM蛋白的基因片段，利用T-A克隆將其連入至pGEM-T質粒載體上的多克隆位點，成功構建pGEM-T-SEM重組質粒。通過測序證實獲得的編碼SEM蛋白的基因片段序列(見SEQ ID NO.2)與SignalP 3.0 Server預測的SEM成熟肽蛋白質的基因序列(見SEQ ID NO.3)相比，僅在N端多出2個氨基酸殘基。
(2)將上述步驟中得到的含內切酶位點的編碼SEM蛋白成熟肽的基因片段用相應內切酶切割后與用相同內切酶處理后的pGEX-4T-1質粒相連接，成功構建表達質粒pGEX-4T-1-SEM。
(3)將pGEX-4T-1-SEM表達質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達帶谷胱甘肽轉移酶(GST)標簽的GST-SEM融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心并收集上清。將菌體上清液與能特異結合GST的親和填料充分混合，用洗脫液洗脫GST-SEM融合蛋白并收集，將收集到的融合蛋白與凝血酶在合適條件下充分反應，反應后的混合物再次與能特異結合GST的親和填料充分混合，分離并收集經過純化的SEM蛋白，取樣電泳檢測。能特征性地結合GST的親和填料，優選偶聯有谷胱甘肽的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow。經檢測獲得電泳純的純化產物后，將該純化產物經過脫鹽、冷凍干燥即得重組SEM凍干粉。
初始獲得的蛋白為帶有GST(谷胱甘肽轉移酶)標簽的融合蛋白GST-SEM，先利用親和填料純化該融合蛋白，進一步去除該標簽后再次利用親和填料純化重組SEM蛋白。
初始獲得的GST-SEM融合蛋白占細菌總蛋白含量的15-25％。
(4)獲得電泳純的SEM蛋白后，采用單核細胞直接細胞毒性測定法(MTT法)，以有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)為陽性對照，建立合適的體外模型以觀察重組SEM蛋白對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以及受SEM刺激增殖的小鼠脾淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。應用此模型同時觀察金黃色葡萄球菌腸毒素C(SEC)的超抗原活性并與重組SEM蛋白的活性進行比較，結果顯示重組SEM蛋白具有典型的超抗原活性，并與SEC的作用相當。
本發明的又一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素O在制備刺激淋巴細胞增殖、抑制腫瘤細胞生長藥物中的應用。
本發明方法的特點是(1)提供了一種高純度的重組SEM蛋白，利用體外小鼠脾淋巴細胞增殖實驗和腫瘤細胞抑制實驗證實該重組蛋白具有典型的超抗原活性，且較SEC更強。該重組蛋白在未被凝血酶切割前帶有GST標簽，適合親和純化，經凝血酶處理后的該蛋白質氨基酸序列及相應的核苷酸序列見SEQ ID NO.1，與相應的天然蛋白相比，該重組蛋白在N端增加了2個氨基酸殘基；(2)提供了一種含有SEM基因的重組表達質粒pGEX-4T-1-SEM，該質粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合構建而成，可轉化入合適的表達宿主，它含有強啟動子，在誘導劑誘導下可高效表達帶有GST標簽的GST-SEM融合蛋白；(3)使用含有由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸構建而成的表達質粒的工程菌，表達產物帶有GST標簽，并使用含有能特異結合GST的親和填料來純化該產物；(4)提供了一種工程菌，該菌株含有表達質粒pGEX-4T-1-SEM，在合適的誘導劑作用下可高效表達帶有GST標簽的GST-SEM融合蛋白。(5)適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發。
本發明方法對重組SEM進行了高效表達，表達強度占全菌蛋白的15-25％左右，且為可溶性表達，便于后續分離純化。融合蛋白經凝血酶高效切割后，所得到的重組蛋白與相應的天然蛋白相比，只在N端多出2個氨基酸。本發明方法采用親和層析對目的蛋白進行純化，具有步驟簡單，純化速度快的特點，相比從金葡菌培養濾液中分離提取以及利用離子交換層析或分子篩層析等方法能獲得高純度的重組SEM蛋白。體外應用該蛋白刺激小鼠脾淋巴細胞增殖和抑制腫瘤細胞生長，結果證明該目的蛋白具有典型的超抗原活性。鑒于在臨床獲得應用的金葡菌濾液制劑的主要有效成分為SEC，本發明通過比較證實重組SEM蛋白的超抗原活性與SEC相當，因此該重組SEM蛋白有望開發成為一種新的超抗原制劑用于腫瘤患者的臨床康復和治療。
在本說明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術術語具有本領域普通技術人員在本領域中通常理解的含義，而未注明的實驗方法是按照常規實驗方法進行或按照供應商所建議的操作說明進行。
圖1為PCR擴增所得含酶切位點的編碼SEM蛋白成熟肽基因瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2為PCR擴增后所測編碼SEM基因序列測序結果圖。
圖3為重組pGEX-4T-1-SEM質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4為重組SEM表達質粒pGEX-4T-1-SEM示意圖。
圖5為重組SEM在BL21(DE3)大腸桿菌中誘導表達電泳圖。
圖6為GST-SEM純化電泳圖。
圖7為重組SEM純化電泳圖。
圖8為重組SEM與SEC對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用(48h)。
圖9為重組SEM與SEC對耐阿霉素慢性髓原性白血病細胞(K562-AD)的抑制作用(48h)。
具體實施例方式
以下實施例提供了實現本發明的優選實施方案。本領域技術人員可以理解的是，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。下面的實施例中所公開的技術表示由本發明人所發現的技術，這些技術能有效實施本發明。不過，本領域技術人員可以理解，在不超出本發明的構思的前提下，可以對這些具體實施方案進行多種改變，仍然能獲得相似的結果。
實施例1SEM的基因克隆和pGEM-T-SEM重組質粒的構建編碼含酶切位點的SEM蛋白的成熟肽基因序列的PCR擴增設計如下一對引物序列
SEQ ID NO.4(上游引物，劃線部分為BamH I酶切位點)5’-cag gat cct tttgct att cgc aaa atc ata tcg ca-3′SEQ ID NO.5(下游引物，劃線部分為Xho I酶切位點)5’-_gcc tcg agt caa ctttcg tcc tta taa gat att tct ac-3’以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組模板，按照以下條件進行PCR擴增，擴增獲得703bp的DNA片段，PCR結果凝膠電泳圖參見圖1，其中泳道1核酸標準對照(Marker)；泳道2含酶切位點的編碼SEM蛋白成熟肽基因PCR產物。
PCR體系H2O 60μLBuffer(10×) 10μLMg2+(25mmol/L) 8μLBSA(5mg/mL) 10μLPrimer-up(25μmol/L) 4μLPrimer-down(25μmol/L)4μLdNTP(20mmol/L)2μLTemplate(Genome of FRI 1230，10ng/μL)1μLTaq Polymerase(5U/μL)1μLPCR程序1、95℃預變性3min2、95℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min3、依步驟2循環34次4、72℃延伸10min含編碼SEM蛋白的成熟肽基因序列的pGEM-T-SEM重組質粒的構建將PCR擴增所得的SEM成熟肽基因克隆入pGEM-T質粒，轉化至大腸桿菌DH5α中擴增。提取該重組質粒，經酶切鑒定后送樣測序，結果顯示獲得的編碼SEM蛋白的成熟肽基因序列與SignalP 3.0 Server預測的蛋白質的基因序列相比，僅在N端增加了2個氨基酸。測序結果參見圖2。
含編碼SEM成熟肽基因的pGEX-4T-1-SEM重組表達質粒的構建用BamH I和Xho I分別酶切上述步驟中得到的含內切酶位點的編碼SEM蛋白成熟肽的基因片段和pGEX-4T-1質粒。分別回收酶切后的含酶切位點的編碼SEM成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-1質粒酶切產物的大片段，并將兩者連接，構建了表達質粒pGEX-4T-1-SEM。將該重組質粒轉入大腸桿菌DH5α擴增并提取質粒，經過BamH I和Xho I酶切鑒定，結果表明目的基因片段已插入載體質粒，電泳結果參見圖3，其中泳道1核酸Marker；泳道2重組pGEX-4T-1-SEM質粒；泳道3重組pGEX-4T-1-SEM質粒BamH I與Xho I雙酶切產物。pGEX-4T-1-SEM質粒示意圖參見圖4，標示的“SEM”即為編碼SEN蛋白基因序列插入位置。目的基因在pGEX-4T-1-SEM質粒上的詳細序列見SEQ IDNO.1。
實施例2重組SEM的表達SEM表達菌株的構建從含有pGEX-4T-1-SEM重組質粒的大腸桿菌DH5α中提取該質粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過抗生素抗性篩選陽性克隆，獲得可以大量表達GST-SEM融合蛋白的工程菌菌株。
融合蛋白GST-SEM的表達將上述工程菌單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃振蕩培養6h，作為種子液。將該種子液以1-5％的接種量接種于含氨芐青霉素的2×YT培養基中，37℃振蕩培養4h，按0.01％-0.1％的體積比加入0.1mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達5h。
實施例3重組SEM的純化樣品的預處理經IPTG誘導的菌液4℃10000rpm離心，棄上清收集沉淀。沉淀用原菌液體積的1/10量的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸，將混懸液置FRENCH細胞破碎儀中，于700psi下破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎儀繼續超聲破碎2min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂解液中加入20％的Triton-100至終濃度為1％，充分混勻，冰浴靜置30min。靜置完畢后將菌體裂解液4℃12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進行SDS-PAGE檢測，在分子量50kD處有較濃的條帶，此即為誘導表達的GST-SEM融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示該條帶濃度大約占總蛋白濃度的15-25％。經誘導后菌體裂解液蛋白電泳結果參見圖5，其中泳道1蛋白質Marker；泳道2未經誘導表達的菌體總蛋白；泳道3經過誘導表達的菌體總蛋白。
GST-SEM融合蛋白的純化取1mL經過預處理的蛋白溶液，經0.45μm膜過濾后加入至預平衡的1mL Glutathione Sepharose 4 Fast Flow柱中，輕輕混勻，結合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3次，每次10mL，流盡液體。向柱中加入0.5mL還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。反應20min后收集溶液，用紫外分光光度計測蛋白濃度。重復上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于0.1mg/mL停止收集，結果顯示各洗脫液組分中蛋白濃度呈正態分布。將各收集組分用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢驗純度與濃度，結果顯示純化得到的GST-SEM融合蛋白為單一條帶，分子量約53kD，電泳結果參見圖6。
融合蛋白的切割將上述純化得到的GST-SEM融合蛋白收集組分合并，經過脫鹽柱或者用10000截留分子量的透析帶透析，將溶液置換成含1.5mol/LNaCl、2.5mmol/LCaCl2的凝血酶緩沖溶液并同時去除溶液中的谷胱甘肽。每1mL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2μL，25℃反應24h，取樣電泳，檢測酶切反應程度，電泳結果參見圖6，其中泳道1凝血酶(thrombin)和重組SEM蛋白；泳道2Thrombin切割后的GST-SEM蛋白；泳道3純化后的GST-SEM融合蛋白；泳道4蛋白質Marker。
重組SEM的純化將反應后的蛋白溶液加入至預平衡的GlutahioneSepharose 4 Fast Flow柱子中，輕輕混勻，靜置20min后使液體流盡并收集。SDS-PAGE檢測溶液中蛋白純度與濃度。結果顯示融合蛋白的GST標簽已去除，在26KD分子量附近有單一條帶，即為純化的SEM蛋白，將純化后的蛋白溶液脫鹽后凍干保存。SEM純化蛋白電泳結果參見圖7，其中泳道1蛋白質Marker；泳道2Thrombin切割后純化的重組SEM蛋白。
實施例4MTT法測定重組SEM對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以ICR小鼠的脾淋巴細胞為靶細胞，將其懸浮于含10％小牛血清的RPMI1640培養液中，調整細胞濃度為5×106個/mL，每孔100μL鋪于96孔板中，設調零孔(僅含培養基)、空白孔(脾淋巴細胞+培養基)、陽性對照孔(培養基+脾淋巴細胞+Con A)和實驗孔(培養基+脾淋巴細胞+三個不同濃度梯度的SEM)，每種設四個復孔。其中，ConA終濃度為10μg/mL，SEM終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。于鋪板后44h在待測孔中加入10μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養箱中繼續培養4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的二甲基亞砜(DMSO)，吹打助溶后培養箱中放置10min，酶標儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm為參考波長)測定各孔OD570nm-OD630nm值，計算淋巴細胞增殖指數(供試品組平均吸光度值/空白對照組平均吸光度值)(增殖指數≥1.5認為結果呈陽性)，作圖分析作用腸毒素對淋巴細胞的增殖作用，并用student t檢驗做統計分析。
與陰性對照組相比，在陽性對照Con A和1μg·mL-1SEM作用48h后，小鼠脾淋巴細胞均有極顯著增加(P＜0.001)；0.1μg·mL-1rSEM作用48h后，小鼠脾淋巴細胞有非常顯著的增加(P＜0.01)；0.01μg·mL-1rSEM作用48h后，小鼠脾淋巴細胞有顯著增加(P＜0.05)，同時隨著作用蛋白濃度的增加作用效果也更加顯著，參見圖8(與空白對照組相比***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05)。按相同實驗方案檢測SEC對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用，經比較，在實驗濃度范圍內，重組SEM對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用較SEC更強。
實施例5MTT法測定重組腸毒素SEM的體外抑瘤活性設調零孔(僅含培養基)、腫瘤細胞對照孔(培養基+腫瘤細胞)、淋巴細胞本底釋放孔[含空白孔(培養基+脾淋巴細胞)、陽性對照孔(培養基+脾淋巴細胞+ConA)和實驗孔(培養基+脾淋巴細胞+四個不同濃度梯度的SEM)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養基+脾淋巴細胞+腫瘤細胞)、陽性對照孔(培養基+脾淋巴細胞+腫瘤細胞+Con A)和實驗孔(培養基+脾淋巴細胞+腫瘤細胞+四個不同濃度梯度的SEM)]，每種設三個復孔。其中，Con A終濃度為10μg/mL，SEM終濃度分別為1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL，本底釋放孔中5×106個/mL脾淋巴細胞以100μL/孔加入，腫瘤作用孔中5×106個/mL脾淋巴細胞和2.5×105個/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病細胞(K562-AD)的混合懸液以100μL/孔加入到實驗孔中，最后按用10％FCS RPMI 1640培養基稀釋藥物至要求濃度，50μL/孔加入各孔，并小心吹打混勻。
鋪板后44h在待測孔中加入15μL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培養箱中繼續培養4h后，小心吸除上清，并加入120μL/孔的DMSO，吹打助溶后培養箱中放置10min，酶標儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm為參考波長)測定各孔OD570nm-OD630nm值，僅含培養基的調零孔調零。按下式計算抑瘤率抑瘤率(％)＝100-[(抑瘤作用孔-淋巴細胞本底釋放孔)/腫瘤細胞對照孔]×100，作圖分析腸毒素對腫瘤細胞的抑制作用，并用student t檢驗做統計分析。
MTT法測定SEM體外抑瘤活性實驗，SEM以K562-AD作靶細胞，與抑瘤陰性對照孔相比，在陽性對照Con A和0.01～1μg/mL的SEM作用48h后抑瘤率均有極顯著的增高(P＜0.001)；并且隨著SEM濃度的增加作用效果也更加顯著，參見圖9(與空白對照組相比***P＜0.001)。按相同實驗方案檢測SEC對K562-AD細胞的抑制作用，經比較，在實驗濃度范圍內，重組SEM對K562-AD細胞的抑制作用與SEC相當。
本發明涉及的序列<110>浙江大學<120>重組金黃色葡萄球菌腸毒素M的制備及應用<160>5<210>1<211>690<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(690)<223>克隆所得含部分凝血酶酶切位點序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M<440>1gga tcc ttt tgc tat tcg caa aat cat atc gca acc gct gat gtc45Gly Ser Phe Cys Tyr Ser Gln Asn His Ile Ala Thr Ala Asp Val1 5 10 15gga gtt ttg aat ctt agg aac tat tat ggt agc tat cca att gaa90Gly Val Leu Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile Glu16 20 25 30gac cac caa agt att aat cct gaa aat aat cat ctt tcg cat caa135Asp His Gln Ser Ile Asn Pro Glu Asn Asn His Leu Ser His Gln31 35 40 45tta gtt ttt tct atg gat aat tcg aca gta aca gct gaa ttt aag180Leu Val Phe Ser Met Asp Asn Ser Thr Val Thr Ala Glu Phe Lys46 50 55 60
aac gtt gat gat gta aag aaa ttc aaa aat cat gct gta gat gta225Asn Val Asp Asp Val Lys Lys Phe Lys Asn His Ala Val Asp Val61 65 70 75tat ggt cta agt tat agt gga tat tgt ttg aaa aac aaa tat ata270Tyr Gly Leu Ser Tyr Ser Gly Tyr Cys Leu Lys Asn Lys Tyr Ile76 80 85 90tac ggt gga gtt aca tta gca ggt gat tat tta gag aaa tct aga315Tyr Gly Gly Val Thr Leu Ala Gly Asp Tyr Leu Glu Lys Ser Arg91 95 100105cgt att cct att aat ctt tgg gtt aat gga gaa cat caa act ata360Arg Ile Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Glu His Gln Thr Ile106 110 115120tct act gac aaa gta tca act aat aaa aag tta gta aca gct caa405Ser Thr Asp Lys Val Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln121 125 130135gaa att gat act aaa tta aga aga tat cta caa gaa gaa tat aat450Glu Ile Asp Thr Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn136 140 145150att tat ggc ttt aat gat aca aat aaa gga aga aat tat ggt aat495Ile Tyr Gly Phe Asn Asp Thr Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn151 155 160165aag tca aaa ttt agt tct gga ttt aat gca gga aaa ata tta ttt540Lys Ser Lys Phe Ser Ser Gly Phe Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe166 170 175180
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<221>CDS<222>(1)...(690)<223>含部分內切酶酶切位點序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M<440>2gga tcc ttt tgc tat tcg caa aat cat atc gca acc gct gat gtc45Gly Ser Phe Cys Tyr Ser Gln Asn His Ile Ala Thr Ala Asp Val1 5 10 15gga gtt ttg aat ctt agg aac tat tat ggt agc tat cca att gaa90Gly Val Leu Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile Glu16 20 25 30
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<221>CDS<222>(1)...(684)<223>克隆所得金黃色葡萄球菌腸毒素M<440>3
ttt tgc tat tcg caa aat cat atc gca acc gct gat gtc gga gtt45Phe Cys Tyr Ser Gln Asn His Ile Ala Thr Ala Asp Val Gly Val1 5 10 15ttg aat ctt agg aac tat tat ggt agc tat cca att gaa gac cac90Leu Asn Leu Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Tyr Pro Ile Glu Asp His16 20 25 30caa agt att aat cct gaa aat aat cat ctt tcg cat caa tta gtt135Gln Ser Ile Asn Pro Glu Asn Asn His Leu Ser His Gln Leu Val31 35 40 45ttt tct atg gat aat tcg aca gta aca gct gaa ttt aag aac gtt180Phe Ser Met Asp Asn Ser Thr Val Thr Ala Glu Phe Lys Asn Val46 50 55 60gat gat gta aag aaa ttc aaa aat cat gct gta gat gta tat ggt225Asp Asp Val Lys Lys Phe Lys Asn His Ala Val Asp Val Tyr Gly61 65 70 75cta agt tat agt gga tat tgt ttg aaa aac aaa tat ata tac ggt270Leu Ser Tyr Ser Gly Tyr Cys Leu Lys Asn Lys Tyr Ile Tyr Gly76 80 85 90gga gtt aca tta gca ggt gat tat tta gag aaa tct aga cgt att315Gly Val Thr Leu Ala Gly Asp Tyr Leu Glu Lys Ser Arg Arg Ile91 95 100105cct att aat ctt tgg gtt aat gga gaa cat caa act ata tct act360Pro Ile Asn Leu Trp Val Asn Gly Glu His Gln Thr Ile Ser Thr106 110 115120
gac aaa gta tca act aat aaa aag tta gta aca gct caa gaa att405Asp Lys Val Ser Thr Asn Lys Lys Leu Val Thr Ala Gln Glu Ile121 125 130135gat act aaa tta aga aga tat cta caa gaa gaa tat aat att tat450Asp Thr Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Gln Glu Glu Tyr Asn Ile Tyr136 140 145150ggc ttt aat gat aca aat aaa gga aga aat tat ggt aat aag tca495Gly Phe Asn Asp Thr Asn Lys Gly Arg Asn Tyr Gly Asn Lys Ser151 155 160165aaa ttt agt tct gga ttt aat gca gga aaa ata tta ttt cat ttg540Lys Phe Ser Ser Gly Phe Asn Ala Gly Lys Ile Leu Phe His Leu166 170 175180aat gat ggt tca tca ttt tct tat gac tta ttt gat act gga aca585Asn Asp Gly Ser Ser Phe Ser Tyr Asp Leu Phe Asp Thr Gly Thr181 185 190195gga caa gct gaa agt ttc tta aaa ata tat aat gac aac aaa act630Gly Gln Ala Glu Ser Phe Leu Lys Ile Tyr Asn Asp Asn Lys Thr196 200 205210gtc gaa act gaa aaa ttc cat tta gat gta gaa ata tct tat aag675Val Glu Thr Glu Lys Phe His Leu Asp Val Glu Ile Ser Iyr Lys211 215 220225gac gaa agt684Asp Glu Ser226 228
<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素M基因所用的上游引物<440>4cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcg ca<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素M基因所用的下游引物<440>5gcc tcg agt caa ctt tcg tcc tta taa gat att tct ac
權利要求
1.一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素M，該蛋白為一種超抗原，具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M的制備方法，具體通過以下步驟實現(1)以金黃色葡萄球菌基因組作為模板，在目的基因兩端添加BamH I和Xho I酶切位點，按照常規方法進行PCR擴增，通過基因測序證實獲得的目的基因片段序列與SignalP 3.0 Server預測的SEM成熟肽蛋白質的基因序列相比，僅在N端多出了2個氨基酸，將獲得的目的基因片段序列連入pGEM-T載體；(2)利用亞克隆技術構建pGEX-4T-1-SEM重組質粒，將該質粒轉入大腸桿菌后，采用常規方法IPTG誘導蛋白表達；(3)利用能特異性地結合谷胱甘肽轉移酶(GST)的親和純化填料純化重組SEM蛋白，電泳鑒定結果顯示獲得了高純度的重組SEM蛋白；其特征是步驟(1)用于擴增含BamH I和Xho I酶切位點的編碼腸毒素SEM成熟肽基因的上下游引物是SEQ ID NO.45’-cag gat cct ttt gct att cgc aaa atc ata tcgca-3′，劃線部分為BamH I酶切位點，SEQ ID NO.55’-gcc tcg agt caa ctt tcg tcctta taa gat att tct ac-3’，劃線部分為Xho I酶切位點，pGEX-4T-1-SEM重組質粒是由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經過重組構建而成；步驟(2)適合質粒pGEX-4T-1-SEM原核表達系統表達蛋白的宿主，選用大腸桿菌BL21。
3.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M的制備方法，其特征是重組金黃色葡萄球菌腸毒素M的原核表達系統是由pGEX-4T-1質粒和重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的基因序列重組構建而成，可用于帶谷胱甘肽轉移酶標簽的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的表達。
4.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的制備方法，其特征是通過PCR擴增從金黃色葡萄球菌菌株基因組中獲得添加了酶切位點的編碼金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的目的基因片段，將其克隆至pGEX-4T-1質粒，構建了原核表達系統pGEX-4T-1-SEM，并將該質粒轉化至合適的大腸桿菌宿主用于表達重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白。
5.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的制備方法，其特征是初始獲得的蛋白為帶有谷胱甘肽轉移酶標簽的融合蛋白GST-SEM，先利用親和填料純化該融合蛋白，進一步去除該標簽后再次利用親和填料純化重組SEM蛋白。
6.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的制備方法，其特征是初始獲得的GST-SEM融合蛋白占細菌總蛋白含量的15-25％。
7.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的制備方法，其特征是最終經過親和層析純化得到的重組SEM蛋白純度大于95％。
8.根據權利要求2所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M蛋白的制備方法，其特征是所述的親和填料是結合谷胱甘肽轉移酶的親和填料，優選偶聯有谷胱甘肽的。
9.根據權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M在制備刺激淋巴細胞增殖藥物中的應用。
10.根據權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素M在制備抑制腫瘤細胞生長藥物中的應用。
全文摘要
一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素M，該蛋白屬于一種超抗原，具有SEQ IDNO.1的氨基酸序列，是利用來源于金黃色葡萄球菌的編碼SEM的基因與一種質粒載體重組，并將其轉化至合適宿主進行表達，通過親和純化獲得。本發明利用體外小鼠脾淋巴細胞增殖實驗和腫瘤細胞抑制實驗證實該重組蛋白具有典型的超抗原活性，且較SEC更強，可在制備刺激淋巴細胞增殖、抑制腫瘤細胞生長的藥物中的應用。適用于高效制備具有超抗原活性的高純度腸毒素以及超抗原制劑的開發。本發明設計合理，對重組SEM進行高效表達，表達強度占全菌蛋白的15－25％左右，且為可溶性表達，便于后續分離純化；采用親和層析對目的蛋白進行純化，步驟簡單，純化速度快。
文檔編號C12N1/21GK101066993SQ200710067890
公開日2007年11月7日 申請日期2007年3月30日 優先權日2007年3月30日
發明者陳樞青, 潘映秋, 丁丁 申請人:浙江大學