與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：：與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：茉莉酸類物質是環戊酮類的衍生物，通過亞麻酸合成(SembdnerandParthier,1993，Annu.Rev.PlantPhysiol54:328-332.1)。其主要的生理活性物質為茉莉酸(JA)及其甲酯(JM)。這兩種化合物廣泛存在于各種植物組織中，在快速生長的組織中含量比較高，如莖尖，根尖，未成熟的果實和幼葉等。最早證明茉莉酸具有信號傳導作用是通過研究茉莉酸促進葉片的衰老(Mueller-Uri等，1988，Planta，176:241-247)。現在大量的證據表明茉莉酸在聯系外界環境變化和細胞內代謝變化的信號傳導過程中起重要作用，是一類新型的植物生長調節物質，特別是在植物的受傷反應和抵御病蟲害的防御反應中發揮重要作用(Creelman，andMullet,1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:4114-41191)。在番茄中如果缺乏茉莉酸合成(茉莉酸合成缺失突變體)，將天蛾幼蟲在這種植物上放養時，幼蟲的生長量會增加四倍，反之在植物上噴灑茉莉酸不僅能降低有害毛蟲的生長，而且還使寄生性黃蜂對毛蟲的捕食增加兩倍(Thaler,1999，Nature,399:686-688)。茉莉酸作為一類植物生長調節物質，其作用主要是將各種信號傳遞到植物細胞中，并引起基因表達的改變，合成新的蛋白質和酶，從而發揮各種生理功能(WasternackandParthier，1997,TrendsPlantSci.，2:302-307)。因此研究受茉莉酸誘導的基因，闡明其編碼的蛋白質，以及其生物學作用，對于了解茉莉酸的作用，更好的利用茉莉酸調節植物對病蟲害的防御反應，具有非常重要的意義。在植物中已經確定受茉莉酸誘導而新合成的蛋白質包括蛋白酶抑制劑、病理相關蛋白、植保素合成酶，細胞壁蛋白、滲調素、脂肪氧化酶等，這些蛋白質和酶在植物抵御病蟲害侵襲中也發揮著重要作用。對于禾本科重要糧食作物中有關茉莉酸誘導蛋白的研究還很少。至今，在國內外尚未見有關在小麥中發現與抵御病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白基因研究的報道。
發明內容本發明的目的是提供一種來源于小麥的與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白及其編碼基因。本發明所提供的與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白，名稱為Ta-JA1，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抵御植物病害侵襲相關的由(a)衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2由304個氨基酸殘基組成。在該蛋白質序列中，疏水氨基酸占104個，親水氨基酸占90個，堿性氨基酸占25個，酸性氨基酸占22個，該蛋白質的分子量為32.7KD，等電點為8.7。序列表中的序列2分為兩個結構域，自序列表中序列2的氨基末端第45至145位的氨基酸殘基組成一個對病害反應的結構域，自序列表中序列2的氨基末端第170至300位的氨基酸殘基組成一個植物凝集素(jacalin-relateddomain)的結構域，自序列表中序列2的氨基末端第164位的甘氨酸，285位的甘氨酸和295位的天門冬氨酸構成了與甘露糖結合的結合位點。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在(a)中的蛋白的氨基酸殘基序列的N端或C端連接上如表1所示的標簽。表l.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白編碼基因可通過將序列表中序列1的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因，其核苷酸序列是編碼序列表中序列2的蛋白質的多核苷酸。所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因，具體可為如下1)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第58位至972位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列l;3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述與抵御植物病害侵襲相關蛋白的DNA分子。所述的雜交條件具體可為，將雜交膜置于預雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7%SDS)中，65。C預雜交30min;棄預雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，7%SDS，同位素標記的核苷酸片段)，65t:雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，5%SDS)，65。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(20咖ol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2，1%SDS)，65。C洗膜2次，每次30min。序列表中的序列1由1158個脫氧核糖核苷酸組成。序列表中序列1的自5'末端第58位至972位脫氧核糖核苷酸為編碼序列。序列表中的序列l，5'端未翻譯區包括57個堿基，3'端未翻譯區包括186個堿基(其中包括17個堿基組成的PolyA)，編碼區由915個堿基(從58位到972位)組成，其中A占27.43%(251個)，C占23.50%(215個)，G占25.36%(232個)，T占23.72%(217個)，A+T占51.15%(468個)，C+G占48.85%(447個)。在國際基因序列數據庫(GenBank\EMBL\DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-JA1基因是小麥中未曾報道的新基因。含有上述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉基因重組細胞系和轉基因重組菌均屬于本發明的保護范圍。所述含有上述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的重組表達載體包括可將Ta-JA1基因翻譯成活性蛋白質的表達質粒(如將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入pET-29b(Novagen公司，USA)的多克隆位點得到的重組質粒，具體如pET-Ta-JAl)，以及可以轉化植物細胞的植物表達載體(如將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入pBI121(Clontech公司，USA)的多克隆位點得到的重組質粒。具體如pTa-JA1，該載體含有CaMV35S啟動子和Kar^選擇基因標記。pET-Ta-JAl是將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入植物表達載體pET-29b的HindIII和Notl位點間得到的重組表達載體。pTa-JA1是將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入植物表達載體pBI121(Clontech,USA)BamHI和EcoRI位點間得到的重組表達載體。重組植物表達載體可以通過農桿菌、基因槍法或花粉管通道轉化植物細胞，從而提高其抵御病害侵襲的能力。本發明的另一個目的是提供一種培育抗病害轉基因植物的方法。本發明所提供的培育抗病害轉基因植物的方法，是將所述與抵御植物病害侵襲的茉莉酸誘導相關蛋白的編碼基因導入植物中，得到抗病害轉基因植物。所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因可通過如下方法導入植物中將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入植物表達載體得到含有所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的重組表達載體，用所述重組表達載體轉化植物細胞，將轉化的植物細胞培育成植株。所述重組表達載體具體可為將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入pBI121(Clontech,USA)的多克隆位點得到的重組質粒，具體如pTa-JAl。pTa-JAl是將所述與抵御植物病害侵襲相關蛋白的編碼基因插入植物表達載體pBI121(Clontech，USA)HindIII和Notl位點間得到的重組表達載體。抗病性檢測實驗表明，轉入與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的煙草對煙草花葉病毒(TobaccoMosaicVirus)和煙草寄生疫霉(尸力j^op力力力oraparasj'"cavar.nicotianae)引起的病害表現出明顯的抗性。圖1為含有Ta-JA1基因的重組表達質粒pET-Ta-JAl的物理圖譜圖2為含有Ta-JA1基因的重組植物表達載體pTa-JAl的物理圖譜圖3為Ta-JA1基因在大腸桿菌中的體外表達圖4為轉Ta-JAl基因煙草的PCR檢測圖5為轉Ta-JA1基因煙草的RT-PCR檢測具體實施例方式應當指出的是，在本發明
技術領域：
的一般技術人員應用本發明的Ta-JA1基因或含有Ta-JA1基因表達質粒，通過轉基因生物技術，構建植物表達載體，用構建的植物表達載體轉化植物細胞和將轉化的植物細胞培育成植株，轉化是通過農桿菌介導、基因槍法或花粉管通道，是能夠實現本發明的，可開發出具有增強抵御病害能力的轉基因植物。正如本發明的一個優選實施例所表明的那樣，利用轉基因獲得煙草新品系，增強其抵御病害侵染的能力。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白Ta-JA1及其編碼基因的獲得1、與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白Ta-JA1基因探針的分離及序列分析將小麥(rw'"c咖3e"iw加L)品種邯4564(河北省邯鄲市種子公司)種植于溫室中，正常澆水和施肥，至生長到2-3個節間，采集根、莖、葉組織，用TRI試劑(MolecularResearchCenter,Inc,Cincinnati,USA)提取總RNA，用PolyATtract*mRNAIsolation試劑盒(Promega公司，Madison，USA)分離Poly(A)+RNA，用紫外分光光度計分析RNA的含量和純度。反轉錄合成cDNA第一條鏈Poly(A)+RNAlug,5umol/L引物5，-GACTCGAGTCGACATCGA(T)n-3，，0.5ramol/LdNTP,50單位RNasin,65。C保溫10分鐘，在冰上冷卻后，加入200USuperscriptIIRNaseH——ReverseTranscriptase(Gibco)，42。C保溫1小時，加EDTA至終濃度10raM，并于95°C保溫10分鐘，在冰上冷卻。以反轉錄合成的cDNA第一條鏈為模板，利用引物Jl和J2進行第一輪PCR。Jl:5，-GGnwsnAAyCArAAyCAr-3'，J2:5，-GACTCGAGTCGACATCG-3，。其中，n為A或T或C或G;w為A或T;s為C或G;r為G或A;y為T或C。條件為3"c腿反應液，lumol/L引物，0.4ramol/LdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA),于95°C變性5分鐘，50°C復性2分鐘，72°C延伸40分鐘，然后進行40個循環(95°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C3分鐘)，最后72°C延伸10分鐘。以第一輪PCR為模板，利用引物J3和J4進行第二輪PCR。J3:5，-AThTGyGAyGGnCCnwsnCC—3，，J4:5，—AAnGGnCCrTAnGTyTTnAC—3'。其中，n為A或T或C或G;w為A或T;s為C或G;r為G或A;y為T或C;h為A或C或T。條件為使用1第一輪PCR反應液，于95°C變性5分鐘，其它反應同第一輪。PCR產物經l.O%瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAX⑧DNAIsolation試劑盒(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)純化電泳產物。純化后連接在pGEM-TEasy載體上(Promega公司，Madison,USA)。連接條件為16°C12小時。轉化受體菌為E.coliDH5a，感受態細胞的制備采用CaCl2處理方法(Sambrook,J.等(eds)，J/o7ecw2arc7o/7i/g..^7a力orafor/歷aoi/37，2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)。將連接產物加入到感受態細胞中，冰浴30分鐘，42t:熱激90秒，加入LB液體培養基，37°C保溫45分鐘，涂布在含氨芐青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37。C培養過夜。白色克隆接種于LB液體培養基上(含氨芐青霉素100ug/ml)，37。C培養過夜，提取質粒，進行酶切分析后，以ABI377DNA序列分析儀進行序列分析，確定Ta-JAl基因探針。序列分析的結果表明，所分離的Ta-JA1基因探針具有623個核苷酸，是序列1的自5'末端第229位至851位脫氧核糖核苷酸。2、Ta-JAl基因的篩選和序列分析以小麥莖Poly(A)+RNA為模板，以ZAP載體(Stratagene公司，LaJolla，CA，USA)合成cDNA，方法按照Stratagene公司實驗流程進行，經過體外包裝，構建成小麥莖的cDNA文庫。取50ng探針DNA，加50uCi32P-dCTP進行標記，37°C保溫1小時，加EDTA至終濃度10raM終止反應。探針通過S印hadexG-50柱后，于100°〇煮沸10分鐘，立即在冰上冷卻，進行雜交。取50000pfu鋪平板，并將其轉移到硝酸纖維素膜上，于0.5MNa0H加1.5MNaCl變性2分鐘，L5MNaCl加0.5MTris-HCl(p朋.0)復性5分鐘，0.2MTris-HC1(pH7.5)加2XSSC漂洗30秒，將膜夾在兩層Whatman濾紙中，80。C真空烘烤2小時，之后加入雜交液(6XSSC,5XDenhardt，0.5%SDS，100ug/mL魚精DNA，50%甲酰胺)，42°C保溫2小時，加入標記的探針，42°C雜交過夜，經過6XSSC加0.1%SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1xSSC加0.1%SDS于65。C洗兩次，每次20分鐘，之后于-8(TC下放射自顯影，確定陽性克隆后，將噬菌斑取下，于SM溶液中4t:提取過夜，再按同樣的程序進行兩輪篩選。對于獲得的陽性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法將其轉化為質粒DNA，經過酶切分析后，采用ABI377DNA序列分析儀進行序列分析。測得的DNA序列如序列表中的序列1所示，將其命名為7^-/^。3、Ta-JA1基因編碼蛋白質的翻譯人工合成一對引物5，—引物5，—CACAAGCTTATGGCCAATTTCCAGATAAC—3'，3'-引物5'-AATTGAATGCGGCCGCTTAGAGAGGGTGCACGTAG-3，。在引物兩端分別引入HindIII及Notl酶切位點，以步驟2得到的含有Ta-JA1基因的質粒為模板，PCR擴增核苷酸序列是序列1的自5'末端第58位至972位脫氧核糖核苷酸的片段，擴增條件為10ngDNA，lumol/L引物，0.4mmol/LdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)。于95°C變性5分鐘，然后進行30個循環(95°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C1.5分鐘)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAX②DNAIsolation試劑盒(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)純化電泳產物，用HindIII及Notl雙酶切后，連接在載體pET-29b(Novagen公司，USA;CatNo.69872-3)上得到重組表達載體pET-Ta-JAl(圖1)。酶切鑒定和序列分析證明重組表達載體pET-Ta-JAl完整和正確。pET-Ta-JA1轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，轉化細胞冰浴30分鐘后，42°C熱激50秒，加入LB液體培養基，37'C保溫45分鐘，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。將抗性菌落于LB液體培養基(含卡那霉素50ug/ml)中37t:震蕩培養過夜，再進行1/100稀釋后，37。C震蕩培養2小時，加入IPTG至終濃度1raM，繼續培養3小時，12000g離心10分鐘，收集菌體，菌體加入100ul裂解液(50mMTris-HC1p朋.8,100mM二硫蘇糖醇，2%SDS，0.1%溴酚藍，10%甘油)，10(TC煮沸5分鐘，菌體蛋白按常規方法進行SDS-PAGE電泳(凝膠濃度12%)，以常規電轉移法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上(轉移時間4小時)，膜在磷酸生理鹽緩沖液(加0.05。/。Tween20，5%脫脂奶粉)洗滌過夜，然后加入S-Tag抗體(Novagen,USA)，震蕩2小時，再用磷酸生理鹽緩沖液(加0.05%Tween20)洗滌6次，每次IO分鐘，再加入過氧化物酶標記的羊抗兔抗體(Bio-Rad，USA)，在磷酸生理鹽緩沖液(加0.05%Tween20)中保育1小時，用磷酸生理鹽緩沖液(加0.05%Tween20)洗滌6次，每次10分鐘，加入顯色劑(ECL，Amersham)進行顯色，以沒有連接Ta-JA1基因的空白質粒pET-29b為對照，結果見圖3。從圖中顯示Ta-JA1基因能在細菌中表達出預期的蛋白質，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。4、Ta-JAl蛋白的結構和功能分析對Ta-JAl所編碼的蛋白質進行結構和構象分析，結果表明這種蛋白主要有e折片(extendstrand)和無規則的巻曲(randomcoil)組成，很少有a螺旋結構。整個蛋白質分為兩個結構域，自序列表中序列2的氨基末端第45至145位的氨基酸殘基組成一個對病害反應的結構域，自序列表中序列2的氨基末端第170至300位的氨基酸殘基組成一個植物凝集素(jacalin-relateddomain)的結構域，自序列表中序列2的氨基末端第164位的甘氨酸，285位的甘氨酸和295位的天門冬氨酸構成了與甘露糖結合的結合位點。Ta-JAl蛋白質的這些特點，使其可以在對病害侵襲做出反應的同時，發揮其抵御病害在植物細胞中進一步擴散的功能。實施例2、小麥組織中Ta-JAl基因表達產物的檢測與茉莉酸的誘導采用Northernblot雜交檢測小麥品種邯4564(河北省邯鄲市種子公司)不同組織中的Ta-JA1基因的表達產物，分別從小麥的根、莖、葉組織中提取總RNA，按常規方法在1.4%瓊脂糖/甲醛變性凝膠電泳上分離，以20xSSC按毛細管法轉移到尼龍膜上(轉移時間12小時)，尼龍膜夾在兩層Whatman濾紙中，80°C真空烘烤2小時，將膜放在雜交瓶中，之后加入雜交液(6xSSC，5xDenhardt,0.5%SDS，100yg/mL魚精DNA，50%甲酰胺)10ml，42°C預雜交2小時，加入標記的實施例1中制備的Ta-JA1基因探針，42°C雜交過夜，經過6xSSC加0.1%SDS室溫下洗兩次，每次30分鐘，再用0.1xSSC加0.1%SDS于65t:洗兩次，每次10分鐘，于-8(TC下放射自顯影一周。顯影后的膜加入O.lxSSC加O.ly。SDS于95'C洗兩次，每次15分鐘，之后加入含有18SrRNA探針(18SrRNA探針作為對照使雜交信號標準化)的雜交液，42°C雜交過夜。將膜取出，按相同的程序洗膜，于-80。C下放射自顯影l小時。對雜交的信號經過PhosphorImage掃描，并與rRNA信號標準化，得到小麥不同組織中Ta-JA1相對表達量，如表2所示結果顯示Ta-JA1基因在正常小麥植株中只在莖中表達，在根和葉中不表達。表2.小麥不同組織中Ta-JAl基因的表達量(以莖為100)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將小麥品種邯4564的種子萌發，取萌發14天的幼苗，轉移到含有50mM茉莉酸甲酯(methyljasmonate，Sigma公司，USA)的培養皿中，光照26。C處理10小時，收獲幼苗，以沒有處理的幼苗為對照，按前述方法進行Northernblot雜交檢測，結果如表3所示表3.茉莉酸對小麥Ta-JAl基因的誘導(以誘導后為100)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>結果顯示茉莉酸能夠明顯誘導Ta-JA1基因的表達，表明Ta-JA1屬于小麥中的一類茉莉酸誘導蛋白。實施例3、Ta-JA1在轉基因煙草中的抗病作用人工合成一對引物5'-引物pl:5'-GTCGGATCCACTAGTCACCATGGCCAATTT-3，，3，-引物p2:5，—CGCGAATTCAATACACACCGAAAATGAGAGC-3，。在引物兩端分別引入BamHI及EcoRI酶切位點，以實施例1步驟2得到的含有Ta-JA1基因的質粒為模板，PCR擴增核苷酸序列是序列1的自5'末端第48位至1014位脫氧核糖核苷酸的片段，擴增條件為:10ngDNA，lnmol/L引物，0.4ramol/LdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)。于95°C變性5分鐘，然后進行30個循環(95°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C1.5分鐘)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，采用GlassMAX②DNAIsolation試劑盒(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)純化電泳產物，用BamHI及EcoRI雙酶切后，連接到含有CaMV35S啟動子和KanK選擇基因標記載體pBI121(Clontech公司，USA)BamHI及EcoRI位點間，得到重組植物表達載體PTa-JA1(圖2)。酶切鑒定和序列分析證明重組表達載體pTa-JAl完整和正確。將pTa-JAl載體轉化根癌農桿菌LBA4404感受態細胞，轉化細胞用液氮速凍5分鐘后，37°C熱激10分鐘，加入LB液體培養基，28'C保溫45分鐘，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。將抗性菌落于LB液體培養基(含卡那霉素50ug/ml)中28。C震蕩培養過夜，再進行1/100稀釋后，28。C震蕩培養3小時。取生長良好的煙草品種W38(Wco"3朋z^tec鵬cvWisconsin38)(云南省玉溪中煙種子公司)葉片，切去葉片邊緣和葉中脈，將葉片的其余部分切成0.5-1cm2的小塊。將切好的煙草葉片浸入MS基本培養基(Sigma公司，USA，CatNo.M9274)懸浮的農桿菌菌液中浸染5-8分鐘，確保葉片切傷的邊緣與菌液完全接觸。用無菌濾紙將浸染過的葉片上多余的菌液吸干。將感染的煙草葉片葉腹面向下放在不含有抗生素的固體MS基本培養基上，26。C黑暗中共培養兩天。將暗培養兩天的煙草葉片轉入分化培養基(MS+6-節基腺嘌呤(2mg/L)+萘乙酸(0.2mg/L)+卡那霉素(100mg/L)+羧芐青霉素(500mg/L))，26T:持續光照培養。待芽長至2-3厘米長時，將芽切下轉入MS+卡那霉素(100rag/L)培養基上生根，生根后的煙草轉到溫室生長。所獲得的轉基因煙草經過PCR檢測，PCR反應體系為25W，包括10XReactionbuffer,10mMdNTPs，10幽pl，10MMp2，2U/WTaq酶以及煙草基因組DNA。反應循環條件為94。C，變性4min;然后94°C，變性1min，55°C，退火1min，72°C,延伸lmin，共35個循環；最后72°C，延伸10min。反應結束后，進行電泳檢測。同時，以煙草品種W38(Wco"朋a"6acw/cvWisconsin38)作為對照。結果在轉基因煙草中能夠擴增出預期的lKb基因片段，而對照(CK)中沒有此片段，表明Ta-JAl基因已經整合到煙草基因組中，共獲得6株PCR陽性的轉pTa-JAl煙草，即Tl-T6(圖4)。進一步對6株PCR陽性轉pTa-JA1煙草進行RT-PCR分析，RT反應體系為20/4，包括2ylRNA樣品，1n1oligo(dT)18，4ti15XReactionbuffer,1u1RNaseinhibitor,2u1dNTPmix(10ramol/L)，42°C保育5min后，加入4u1AMV(5U/ul)以及6u1無RNase水，42。C保育60min后，7(TC保育10min。其后取1u1進行PCR反應，反應條件同上。RT-PCR分析結果表明Ta-JA1基因在6株PCR陽性轉pTa-JA1基因煙草(即Tl-T6)中獲得正確的表達(圖5)。圖4和圖5中，CK為煙草品種W38d'c"i朋ata力ac咖cvWisconsin38)。同時，以轉入pBI121的煙草品種W38(yVico"s/scvWisconsin38)作為對照。攻毒實驗設四個處理轉入pBI121煙草的煙草花葉病毒攻毒處理(對照)、轉入pTa-JAl基因RT-PCR陽性的煙草(5個株系)花葉病毒攻毒處理、轉入pBI121煙草的煙草黑脛病攻毒處理(對照)、轉入pTa-JA1基因RT-PCR陽性煙草的煙草(6個株系)寄生疫霉攻毒處理。各處理每個株系均設三次重復。每個重復3株。取正常生長兩月齡的轉基因煙草葉片，人工接種煙草花葉病毒(TobaccoMosaicVirus,中國普通病毒保藏中心，保藏號為2.0030)或煙草寄生疫霉(尸An^p力Morsparaw'&'cavar.nicotianae，中國農業微生物菌種保藏管理中心，保藏號為30377)。煙草花葉病毒采用機械摩擦接種，把金剛砂均勻的抖在健康煙葉上，用移液槍把煙草花葉病毒100ul滴在煙葉上，用手輕輕摩擦讓病毒接種在健康煙葉上讓其發病，正常培養至10天后觀察發病癥狀，并用ELISA方法檢測葉片中煙草花葉病毒濃度。ELISA方法如下取煙草的嫩葉用5mM碳酸鹽緩沖液研磨充分，3000rprn低速離心15分鐘后取上清液，按照不同比例稀釋后加到酶聯板上，每孔加200wl，加蓋后4t:過夜，倒盡酶聯板上的溶液，洗滌3次，每次3分鐘，加入煙草花葉病毒抗體(AgdiaInc.公司，Indiana,USA)，每孔185ul，37。C保溫1小時。洗滌3次，每次3分鐘。加入不同稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶標記抗體(Proraega公司，Madison,USA)，每孔165ul，37"保溫1小時。洗滌3次，每次3分鐘。加1%四甲基聯苯胺二鹽酸(用二甲基亞砜配成)，每孔150iU，室溫反應30分鐘后加lmol/L1^04終止反應，測0.D45。值，以轉入pBI121煙草進行同樣煙草花葉病毒攻毒處理為對照，結果見表4。表4數據表明，各轉基因煙草株系(T1至T5)病毒積累明顯低于對照煙草，表明轉基因煙草具有抗煙草花葉病毒的能力。表4轉Ta-JA1基因煙草抗煙草花葉病毒測定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>煙草寄生疫霉培養用馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA):稱取200克馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000毫升煮沸半個小時，紗布過濾，再加10-20克葡萄糖和20克瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，滅菌后備用。用無菌的鑷子或打孔器從保存的試管菌種中取一塊含菌絲的瓊脂塊置于PDA固體培養基平板表面，然后將PDA平板倒置于25。C生化培養箱中培養10天進行活化。將培養好煙草寄生疫霉的平板用打孔器打成直徑為5毫米大小的菌絲塊，用牙簽將菌絲塊接種到預先用針刺傷的離體煙草葉片表面，用牙簽在葉片兩邊分別扎孔，每邊2個孔，每張葉片接種2點于同一側，彼此相隔約2厘米左右，另一側用針刺。接種后放入培養皿內，用吸水紙保濕，置于16小時光照8小時黑暗交替的25'C光照培養箱中，24小時后開始記錄病情，觀察并統計發病病斑數及病斑大小。病癥分級按如下標準l級(+):無癥狀或表示病斑小于0.5厘米，擴展慢；2級(++):病斑大小介于0.5-1厘米；3級(+++):病斑大小介于1.0-1.5厘米，各接種點之間相互不愈合；4級(++++):病斑大于1.5厘米，各接種點之間相互愈合。結果如表5所示，表明轉Ta-JA1煙草(Tl至T6)比對照煙草(轉入pBI121煙草)表現出明顯的抗病特征，病斑少而且病斑均小于對照煙草。表5轉Ta-JAl基因煙草對煙草寄生疫霉的抗性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>因此，在各種植物組織中過量表達這種與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白Ta-JA1，可以明顯增強這些組織抵御病害侵襲的能力，包括病毒病和真菌病害。所以此基因和蛋白質在禾本科作物的抗病害育種方面具有重要意義。序列表<160>2〈210>1<211>1158<212>腿〈213〉小麥(W"c咖aeWirafflL)<400〉1atctcataagcctacaacatcccttgaaccagagccccacccaactcactagtcaccatg60gccaatttccagataactccccgcgcagcgttcgtggagagcaatgagctcaacttccgc120agcctgtaccttttccacactccccttggttcaaaccagaatcagtcaggcataatagac180tcgaatgttactaccggtttgggtgcgacagtcgttaacaactggccgatatgtgatggc240cctagccccggcgccaccgttattgcgcgtgcacaaggcctgcatatctatgccggtaac300tggcagaatactttcagcataacattcgaggttgaaaggtttaagggatcaacgcttcaa360gtgatggggatatccgtcgaagaaggtgagtgggctattgttggtgggacaggacagttc420gctatggcgatcggtgtcatctacaaaaagttccatgaacaaaggagcgatggtaacatc480atagaactcactgtccatgga^tttgtcccatgctgaaaggttcacagagccttcgcaca540aaggttggaccatggggtggaaatggaggctcagataaagacatcgtcgaggcaccaaga600cgtctagagagcatcacagttagcagcggcactatcattgattcaatcaaattttcttat660gtcgaccaagctggtcagaagcgcactgttggaccctggggaggttctggaggeiaaacaa720aatacgttcgtactcggcacttctgagtttgtgaaggaagtttctggaacattcggcctt780tatggcagagacaaccacaacataataacatcactgaaatttgtcaccaacgtgaagaca840tacgggcctttcggacaagcgaagggaaccactttcaccataccagtgcaaaagaatagc900agcatcgtgggcttcttcggacgcagtgggatatatctcgatgcacttggtgtctacgtg960caccctctctaagctactagctagcggctaatgctctcattttcggtgtgtatttctcaa1020tcwtttggiataagcggaagagatctagtagacttttctcttgtctag肌gatcctatca1080agccgcccaactggcttttttatttacctttgttgtgatgaataaaagta"tcggttttta1140taaaaaaaaaaaaaaaaa1158<210>2<211〉304<212>PRT<213〉小麥(7h2Yic咖ses"razz7U<400>2MetAlaAsnPheGinlieThrProArgAlaAlaPheValGluSerAsn151015GluLeuAsnPheArgSerLeuTyrLeuPheHisThrProLeuGlySer202530AsnGinAsnGinSerGlylielieAspSerAsnValThrThrGlyLeu354045GlyAlaThrValValAsnAsnTrpProlieCysAspGlyProSerPro505560GlyAlaThrVallieAlaArgAlaGinGlyLeuHislieTyrAlaGly65707580AsnTrpGinAsnThrPheSerlieThrPheGluValGluArgPheLys859095GlySerThrLeuGinValMetGlylieSerValGluGluGlyGluTrp100105110AlalieValGlyGlyThrGlyGinPheAlaMetAlalieGlyVallie115120125TyrLysLysPheHisGluGinArgSerAspGlyAsnlielieGluLeu130135140ThrValHisGlyPheCysProMetLeuLysGlySerGinSerLeuArg145150155160ThrLysValGlyProTrpGlyGlyAsnGlyGlySerAspLysAsplie165170175ValGluAlaProArgArgLeuGluSerlieThrValSerSerGlyThr180185190lielieAspSerlieLysPheSerTyrValAspGinAlaGlyGinLys195200205ArgThrValGlyProTrpGlyGlySerGlyGlyLysGinAsnThrPhe210215220ValLeuGlyThrSerGluPheValLysGluValSerGlyThrPheGly225230235240LeuTyrGlyArgAspAsnHisAsnlielieThrSerLeuLysPheVal245250255ThrAsnValLysThrTyrGlyProPheGlyGinAlaLysGlyThrThr260265270PheThrlieProValGinLysAsnSerSerlieValGlyPhePheGly275280285ArgSerGlylieTyrLeuAspAlaLeuGlyValTyrValHisProLeu290295300權利要求1、與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抵御植物病害侵襲相關的由(a)衍生的蛋白質。2、權利要求1所述的與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因。3、根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因為如下l)或2)或3)的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第58位至972位脫氧核糖核苷酸；2)其核苷酸序列是序列表中的序列1;3)在嚴格條件下與l)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的DNA分子。4、含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、轉基因重組細胞系或轉基因重組菌。5、根據權利要求4所述的重組表達載體、轉基因重組細胞系或轉基因重組菌，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求1所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入pBI121或pET-2%的多克隆位點得到的重組質粒。6、根據權利要求5所述的重組表達載體、轉基因重組細胞系或轉基因重組菌，其特征在于所述重組表達載體為pET-Ta-JAl或pTa-JA1;所述pET-Ta-JAl是將權利要求1所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入表達載體pET-29b的HindIII和Notl位點間得到的重組質粒；所述pTa-JAl是將權利要求1所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入植物表達載體PBI121的BamHI和EcoRI位點間得到的重組質粒。7、一種培育抗病害轉基因植物的方法，是將所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因導入植物中，得到抗病害轉基因植物。8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述病害為由煙草花葉病毒(TobaccoMosaicVirus)禾口/或煙草寄生疫霄(戶力/fo;力t/oraparawYicavar.nicotianae)引起的病害；所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因通過如下方法導入植物中將權利要求1所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因插入植物表達載體得到含有權利要求1所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的重組表達載體，用所述重組表達載體轉化植物細胞，將轉化的植物細胞培育成植株。9、根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述含有權利要求l所述與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白的編碼基因的重組表達載體是權利要求5或6所述的重組表達載體。10、根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物為煙草；所述煙草優選為煙草品種W38(iy/co"朋az^力3c"歷cvWisconsin38)。全文摘要本發明公開了一種與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白及其編碼基因與應用。該與抵御植物病害侵襲相關的茉莉酸誘導蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與抵御植物病害侵襲相關的由(a)衍生的蛋白質。該蛋白的編碼基因可用于培育抗病害轉基因植物，特別是抗煙草花葉病和煙草寄生疫霉的轉基因植物。文檔編號C12N15/82GK101121746SQ20071011824公開日2008年2月13日申請日期2007年7月3日優先權日2007年7月3日發明者斌田,馬慶虎申請人:中國科學院植物研究所