動物細胞培養基干粉組合物、培養基組合物及其制備方法

專利名稱：：動物細胞培養基干粉組合物、培養基組合物及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及細胞培養基干粉組合物、細胞培養基組合物以及它們的制備方法，尤其涉及動物細胞培養基干粉組合物、動物細胞培養基組合物以及它們的制備方法。
背景技術：
：現有的動物細胞培養中，一般將動物細胞培養基干粉組合物分散于載劑(如重蒸水)中形成液體培養基組合物，然后與終濃度至少10體積°/。的動物血清配合使用；或者將不含動物血清的動物細胞液體培養基組合物與終濃度至少10體積％的動物血清配合使用；或者直接使用包括終濃度至少10體積％的動物血清的液體培養基組合物，才能保證細胞的正常生長傳代。然而動物血清是成分不明確的復雜混合物。一方面動物血清含有例如，攜帶激素、礦物質、-敞量元素、脂類物質的轉運蛋白；細胞貼壁因子和擴散因子等可以促進細胞生長、穩定解毒、維持培養基的pH值，并抑制蛋白酶直接或間接的酶解。但另一方面，動物血清存在很多問題例如，添加及補充過程中導致培養基pH值變化大，存儲過程中易受其他微生物污染，低溫貯存解凍后易產生沉淀，不同批次差異大，成本高，以及難以從細胞下游產品中去除、安全性差等。因此存在動物細胞培養基中盡量不用或少用動物血清的趨勢。現有技術一般通過額外添加胰島素、重組胰島素、人源轉鐵蛋白、牛血清白蛋白、細胞因子、生長因子等重組蛋白和動物來源成分，來降低使用動物血清的量，例如CN1723277中公開了一種源自肌肉組織的祖細胞/干細胞的培養基組合物，該組合物中添加了胰島素、FGF型生長因子，可以降低Ajfe清的使用量。但是重組蛋白和動物來源成分對生物制品(比如疫苗)的安全性有很大影響，比如重組蛋白和動物來源成分引起過敏反應等。綜上，需要配合低含量動物血清(終濃度小于10體積％)使用的動物細胞培養基干粉組合物或不含動物血清的動物細胞液體培養基組合物，或者低含量動物血清(終濃度小于10體積％)的動物細胞液體培養基組合物。
發明內容本發明的目的是克服現有動物細胞培養基干粉組合物必須與高含量動物血清配合使用才能促進動物細胞生長、安全性差的缺點，提供一種動物細胞培養基干粉組合物，該組合物配合低含量的動物血清濃度就能促進動物細胞生長、安全性好。本發明的第二個目的是提供上述動物細胞培養基干粉組合物的制備方法。本發明的第三個目的是提供包括上述動物細胞培養基干粉組合物的動物細胞培養基組合物。本發明的第四個目的提供包括上述動物細胞培養基干粉組合物的動物細胞培養基組合物的制備方法。本發明的發明人意外地發現，僅僅將動物細胞培養基干粉組合物按照表1的組分和含量范圍進行調整，加入載劑并與低含量動物血清(終濃度1至小于10體積％)配合使用，就能達到含重組蛋白和動物來源成分的動物細胞培養基與低含量動物血清配合使用(終濃度1體積°/。至小于10體積％)、或者現有動物細胞培養基與高含量動物血清(終濃度至少10體積％)配合使用的同樣的促進細胞生長作用。本發明提供了一種動物細胞培養基干粉組合物，其中，該動物細胞培養基干粉組合物包括下表1所示的組分表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發明還提供了上述動物細胞培養基干粉組合物的制備方法，該方法包括將本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物的組分*在分散劑中，移除所得混合物中的分散劑。本發明還提供了一種動物細胞培養基組合物，該組合物包括動物細胞培養基干粉組合物及其載劑，其中，所述動物細胞培養基干粉組合物選自本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物中的一種或幾種。本發明還提供了上述動物細胞培養基組合物的制備方法，該方法包括將動物細胞培養基千粉組合物分散在載劑中，過濾滅菌，其中，所述動物細胞培養基干粉組合物選自本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物中的一種或幾種。與現有的通過引入重組蛋白或動物來源組分來降低動物血清用量的動物細胞培養基干粉組合物相比，由于本發明的動物細胞培養基干粉組合物，無需額外引入蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細胞因子等),能配合低含量動物血清使用達到與高含量動物血清持平甚至更好的促進動物細胞生長的作用，因此本發明的動物細胞培養基干粉組合物不產生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本發明的動物細胞培養基干粉組合物培養的細胞，不同批次差異小，成本低，利于分離細胞下游產品、安全性好，適于用作生產疫苗等生物制品的病毒宿主、表達載體等。圖1為使用本發明實施例1的動物細胞培養基干粉組合物、并配合低動物血清濃度(3體積％小牛血清)培養72小時的Vero細胞的照片；圖2為使用對比例1的動物細胞培養基干粉組合物、并配合高動物血清濃度(10體積％小牛血清)培養72小時的Vero細胞的照片；圖3為使用CN1723277培養基組合物(含有細胞因子+激素+低血清濃度3體積％小牛血清)培養72小時的Vero細胞的照片；圖4為使用對比例1的動物細胞培養基干粉組合物、并配合低動物血清濃度(3體積％小牛血清)培養72小時的Vero細胞的照片；圖5為使用實施例5的動物細胞培養基組合物(含2.9體積°/。小牛血清)培養72小時的CHO細胞的照片。具體實施例方式本發明提供了一種動物細胞培養基干粉組合物，其中，該動物細胞培養基干粉組合物包括下表1所示的組分表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>優選所述細胞培養基干粉組合物包括下表2所示的組分:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>優選所述細胞干粉組合物還可以包括1-3重量份的亞油酸、1-3重量份的維生素D2、1-3重量份的維生素K3和2-10重量份的酚紅中的一種或幾種。其中，亞油酸、維生素D2和維生素K3可以進一步促進細胞的生長；酚紅作為pH值指示劑加入，可以通過目測隨時掌握細胞的生長情況。更優選所述細胞干粉組合物還可以包括1.5-2重量份的亞油酸、1.5-2重量份的維生素D2、1.5-2重量份的維生素K3和3-5重量^f分的酚紅中的一種或幾種。制備動物細胞培養基干粉組合物可以使用干法和濕法兩類方法。所謂干法指在干燥的條件下混合固體組分的粉末(比如利用球磨機球磨混合)。使用干法時，優選首先按照構成培養基干粉組合物的各個組分的性質對它們分別干燥。比如將無水磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水辟u酸鎂、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀可以在100-120°C，優選100-105。C下干燥1-5小時；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L一月甫氨酸、L一絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽在30-8(TC優選35-50。C下干燥l-3小時；無水磷酸二氫鉀將四水合賄酸铞、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合硫酸鋅、丙酮酸鈉放入真空干燥箱內抽真空干燥10小時以上。所謂濕法指將可以形成動物細胞培養基干粉組合物的固體組分與分散劑混合，然后移除所得混合物的分散劑。還可以將干法與濕法結合，即將一部分固體組分用濕法混合，移除分散劑后，用干法與其余部分的固體組分混合。本發明還提供了一種動物細胞培養基干粉組合物的優選制備方法，該方法散劑中，移除所得混合物中的分散劑。所述動物細胞培養基干粉組合物的組分在分散劑中的分散可以通過本領域常用的各種分散方法實現，比如攪拌、超聲振蕩等。所述分散劑可以選自本領域用于制備動物細胞培養基干粉組合物的各種分散劑。所述分散劑的作用是使動物細胞培養基干粉組合物的各種組分均勻地混合，一般對分散劑沒有特別的要求，只要不引入新的影響細胞生長的離子、污染雜質(如內毒素、微生物等)，不改變該動物細胞培養基干粉組合物溶于載劑后的適宜細胞生長的pH值范圍、在不破壞培養基組分的前提下容易去除即可。因此所述*劑優選選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水、超純水、能與水以任意比互溶的醇、堿性水溶液和酸性水溶液中的一種或幾種，其中所述堿性水溶液為氨水或者本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物中出現的陽離子的堿的水溶液，所述酸性水溶液為本發明中所述的動物細胞培養基干粉組合物出現的酸才艮離子的酸的水溶液。所述能與水以任意比互溶的醇可以為乙醇、曱醇、丙醇中的一種或幾種。所述^威性水溶液優選氫氧化鈉的水溶液、氬氧化卸的水溶液、氬氧化鈣的水溶液、氨水、堿性氨基酸的水溶液中的一種或幾種，最優選氫氧化鈉的水溶液。所述酸性水溶液優選鹽酸溶液、疏酸的水溶液、硝酸的水溶液、有機酸(碳酸、草酸、琥珀酸、蘋果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一種或幾種，最優選鹽酸的水溶液。本發明對構成動物細胞培養基干粉組合物的各個組分加入分散劑中的順序沒有特別的要求。此外，可以將構成動物細胞培養基干粉組合物的各種組分分散在同一種分散劑中，也可以將不同組分分散在不同的分散劑中，然后混合得到的^t體。優選后者，例如優選將胸苷、；欠黃嘌呤分散于i-io重量％的氬氧化鈉的水溶液(氬氧化鈉的水溶液優選用重蒸水配制)中，可以適當加熱至60°C;將親脂性物質(如維生素K3、維生素D2)先分散于低沸點親水小分子有機溶劑(如乙醇)中。對于所述培養基組合物中含量很少的組分(比如含量不超過10重量份的組分)，在制備時，可以先用分散劑配制該組分的高濃度液體分散體，然后按照最終培養基干粉組合物中該組分所需的定量以該高濃度液體M體的形式使該組分與其他組分混合。所用分散劑的溫度不應高于被分散組分的最低分解溫度。所述分散劑的用量沒有特別的限制，只要能使培養基干粉組合物的組分與分散劑形成均一穩定的分散體即可；另外，在滿足前述條件的前提下，出于能耗的考慮，分散劑的用量越少越好。可以采用本領域常用的方法除去分散劑，比如干燥。所述干燥可以為加熱、真空干燥、真空冷凍千燥、千燥劑(如硅膠、氧化鋁凝膠、分子篩、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化鈣等)吸濕等。本發明還提供了一種動物細胞培養基組合物，該組合物包括動物細胞培養基干粉組合物及其載劑，其中，所述動物細胞培養基干粉組合物本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物中的一種或幾種。所述載劑可以選自本領域用作培養細胞的各種載劑，優選選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水中的一種或幾種，更優選所述載劑為注射用水和/或超純水。所述載劑的用量為600000-1500000重量份，優選為800000-1200000重量份，更優選為1000000重量份。所述載劑的單位重量份與表1和表2中各個組分所采用的單位重量份相同。所述動物細胞培養基組合物還可以包括終濃度為1體積％至小于10體積%的動物血清，優選包括終濃度為3體積％至5體積％的動物血清。所述動物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、馬血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一種或幾種。本發明的動物細胞培養基組合物可以將本發明動物細胞培養基干粉組合物的組分，——稱量，然后分散在相同的載劑中；或者使所述動物細胞培養基干粉組合物的組分分別分散在不同載劑中，然后混合不同的分散體。對于所述培養基組合物中含量很少的組分(比如含量不超過10重量份的組分)，在制備時，可以先用載劑配制該組分的高濃度液體分散體，然后按照最終液體培養基中組分所需的定量以該高濃度液體分散體的形式添加該組分。所用載劑的溫度不應高于被分散組分的最低分解溫度。更優選本發明提供的動物細胞培養基組合物的制備方法，該方法包括將動物細胞培養基干粉組合物分散在載劑中，過濾滅菌，其中，所述動物細胞培養基干粉組合物選自本發明所述的動物細胞培養基干粉組合物中的一種或幾種。優選該方法還包括，在過濾滅菌前，向分散有所述培養基干粉組合物的載劑中加入終濃度為1體積％至小于10體積％的動物血清，更優選加入包括終濃度為3重量％至5重量％的動物血清。所述過濾滅菌的方法為本領域^^知，可以采用孔徑不大于0,22jLim的濾菌膜，進行一次或幾次過濾。所述動物細胞培養基干粉組合物在載劑中的分散可以通過本領域常用的各種分歉方法實現，比如攪拌、超聲振蕩等。本發明的動物細胞培養基干粉組合物、動物細胞培養基組合物(液體)對能夠培養的細胞沒有特別的限制，可以培養體細胞(如Vero細胞)或生殖細胞(CHO細胞)，原代細胞(如地鼠腎細胞)或傳代細胞(恒河猴腎細胞MA-104),癌細胞如hela細胞、正常細胞以及經過基因工程修飾的細胞(雜交瘤細胞)或經過人工選育的細胞(如BHK21細胞)。除非特別說明，本發明使用的各種試劑均可以商購，也可以采用本領域常用的方法制備。用于細胞培養的試劑，不僅純度要求高，優選分析純，而且不能存在任何影響細胞正常生理活動的物質，因此還需要符合醫藥制品的要求，優選注射級原料藥。以下結合實施例，進一步說明本發明。實施例14兌明本發明的動物細月包培<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表3及以下各表中固體組分的單位mg/L是指，以將該培養基干粉組合物與載劑混合所得最終液體培養基的體積為基準，相對于每升最終液體培養基，在制備培養基時需要加入的固體物質的毫克數。將表3所示的固體組分按照10升最終液體培養基的用量，用萬分之一天平——精確稱量混合后，再加入IO升蒸餾水，用上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司85-2型攪拌器攪拌2小時后，得到均勻分散體，使用FD-3A中型冷凍干燥機(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預冷溫度-45°C,緩慢升溫保持儀器內真空度9Pa下冷凍干燥50小時，得到本發明的動物細胞培養基干粉組合物。實施例2表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4所示的固體組分按照10升最終液體培養基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃嘌呤、胸苷溶于1000ml的lmol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羥脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、抗壞血酸、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡噴醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12溶于3000ml蒸餾水中得到B溶液；將維生素D2、亞油酸溶于10ml99%的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、無7K磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸、L-天門冬酰胺、四水合硝酸4丐、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合硫酸鋅、丙酮酸鈉、酚紅，用蒸餾水定容至10000ml搖勻，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷凍干燥機(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預冷溫度-50°C,緩慢升溫保持真空度10Pa下冷凍干燥40小時，即得到本發明的動物細胞培養基干粉組合物。實施例3本實施例用于說明本發明的動物細胞培養基干粉組合物及其制備方法。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表5所示的固體組分按照10升最終液體培養基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃噪呤、胸苷，溶于1000ml的lniol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將維生素K3、維生素D2、亞油酸溶于10ml99%乙醇溶液，得到B溶液；將抗壞血酸、氯化膽-威、D-泛酸鉀、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12溶于1000ml蒸餾水中得到C溶液，合并A溶液、B溶液和C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖，用蒸餾水定容至10000ml搖勻，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷凍干燥機(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預冷溫度-40°C,緩慢升溫保持真空度10Pa下冷凍干燥30小時，得到凍干粉。將無水磷酸二氫鈉、氯化鉀、無K硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、無水氯化4丐、于105。C干燥2小時，將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、酚紅于40"C下干燥1小時。將四水合硝酸釣、六水合氯化鎂、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合硫酸鋅、丙酮酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-天門冬酰胺、L-幾脯氨酸放入真空干燥箱內干燥20小時。將上述所有干燥后的組分以及凍干粉裝入球磨罐內，球磨10小時，即得本發明動物細胞培養基干粉組合物。對比例1本對比例用于說明現有的動物細胞培養基千粉組合物(商品名為MD500型199培養基)及其制備方法。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6為商品名199培養基的組分，按照IO升最終液體培養基的用量，用萬分之一分析天平稱取。將膽固醇、維生素A醋酸酯、維生素E、維生素D2、維生素K3和吐溫80溶于0.1升乙醇中；將胸腺嘧啶、尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤加入含有0.5毫升氨水的1升重蒸水中，并60。C加熱至溶解；使葉酸和核黃素振蕩溶于2.5升重蒸水；將維生素H和鹽酸鳥嘌呤加入到2升0.075N的鹽酸溶液中，并50。C加熱至溶解；將三磷酸腺苷二鈉、腺苷酸、脫氧核糖、谷胱甘肽、D-核糖、D-泛酸鉤、維生素C、葉酸、氯化膽堿、i-肌醇、煙酸、煙酰胺、對氨基苯曱酸、鹽酸吡噴醛、鹽酸吡眵醇和鹽酸硫胺溶于200毫升重蒸水中；合并得到的五種溶液，然后加入D-葡萄糖，用雙蒸水定容至10升搖勻。使用FD-3A中型冷凍干燥機(西安德派生物儀器有限公司)，按照該儀器說明書，在預冷溫度-5(TC，緩慢升溫保持真空度8Pa下冷凍干燥24小時，得到凍干粉。將氯化鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、硫酸腺噤呤、九水合硝酸鐵、氯化4丐、乙酸鈉、無7jc疇酸二氳鈉、在105。C烘箱中干燥2小時。將L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-異亮氨酸、L-曱硫氨酸、L-羥脯氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-天門冬氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-酪氨酸、酚紅用真空干燥箱抽真空干燥15小時。將上述所得凍干粉和干燥固體組分在球磨機中進行連續IO小時混合，所得固體粉末即為現有的動物細胞培養基干粉組合物，商品名MD500型199培養基。實施例4本實施例用于說明本發明的動物細胞培養基組合物及其制備方法。將實施例3制得的干粉組合物123.64克，溶于9升蒸餾水中，然后用蒸餾水定容至10升混勻，使用0.22jum的濾菌膜過濾滅菌，即得到本發明的動物細胞培養基組合物。實施例5本實施例用于說明本發明的動物細胞培養基組合物及其制備方法。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表7所示的固體組分按照10升最終液體培養基的用量，用萬分之一分析天平稱取。其中，將次黃噤呤、胸苷溶于1000ml的lmol/LNaOH蒸餾水溶液中，得到A溶液；將L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L一亮氨酸、L—蛋氨酸、L一苯丙氨酸、L—月甫氨酸、L一羥月黹氨酸、L—絲氨酸、L-色氨酸、L-蘇氨S吏、L-纈氨酸、抗壞血酸、氯化膽堿、D-泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、鹽酸他"多醇、核黃素、鹽酸硫胺、維生素B12溶于3000ml蒸餾水中得到B溶液；將維生素D2、亞油酸、維生素K3溶于10ml99。/。的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、無水磷酸二氫鈉、氯化鉀、無水硫酸鎂、無水氯化釣、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鉀、甘氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-酪氨酸、L-天門冬酰胺、四水合硝酸鉤、谷胱甘肽、七水硫酸亞鐵、七水合硫酸鋅、丙酮酸鈉、酚紅，用蒸餾水定容至10000ml搖勻。將300ml小牛血清加入所得培養基混勻，將所得混合物使用0.22pm的濾菌膜過濾滅菌，得到10300ml含2.9%牛血清的本發明培養基組合物。性能測試(1)澄清度按照中華人民共和國藥典2005年版二部附錄IXB澄清度檢查法，分別檢測新制的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物和在室溫、相對濕度50%的環境下儲存30天后的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物與蒸餾水混合后形成的培養基液體，以及新制實施例4-5的培養基組合物(液體)和過濾滅菌后在2'C下保存一周后的實施例4-5的培養基組合物(液體)。對于培養基干粉組合物，取配制l升的用量，置于1000ml燒杯中，加水1000ml，攪拌至溶解；對于培養基組合物(液體)直接進行測試。測試結果如下表所示表8<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>從表8的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能達到與現有培養基組合物相同水平的澄清度。(2)pH值按照中華人民共和國藥典2005年版二部附錄VIHpH值測定法，用pH計分別檢測新制的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物和在室溫、相對濕度50%的環境下儲存30天后的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物與蒸餾水混合后形成的培養基液體，以及新制實施例4-5的培養基組合物(液體)和過濾滅菌后在2。C下保存一周后的實施例4-5的培養基組合物(液體)。對于培養基干粉組合物，取配制1升的用量，置于1000ml燒杯中，加水1000ml，攪拌至溶解；對于培養基組合物(液體)直接進行測試。測試結果如下表所示表9<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從表9的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能達到與現有培養基組合物相同的pH水平，而且本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物存儲前后pH的變化不超過0.1。(3)干燥減量按照中華人民共和國藥典2005年版二部附錄預L干燥失重測定法，分別檢測新制的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物和在室溫、相對濕度50%的環境下儲存30天后的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物。測試結果如下表所示表10<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從表10的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能達到與現有培養基組合物相當的干燥減量水平，而且本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物存儲前后的干燥減量變化不超過0.2%。(4)滲透壓按照中華人民共和國藥典2005年版二部附錄IXG滲透壓摩爾濃度測定法，分別檢測新制的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物和在室溫、相對濕度50%的環境下儲存30天后的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物與蒸餾水混合后形成的培養基液體，以及新制實施例4-5的培養基組合物(液體)和過濾滅菌后在2°C下保存一周后的實施例4-5的培養基組合物(液體)。對于培養基干粉組合物，取配制l升的用量，置于1000ml燒杯中，加水1000ml，攪拌至溶解；對于培養基組合物(液體)直接進行測試。測試結果如下表所示表11<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從表11的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能達到與現有培養基組合物相同的滲透壓水平，而且本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物存儲前后滲透壓的變化不超過10mOsmol/KgH2O。(5)細菌內毒素按照中華人民共和國藥典2005年版附錄XIE細菌內毒素檢查法中的凝膠法，分別檢測新制的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物和在室溫、相對濕度50%的環境下儲存30天后的對比例1和實施例1-3的培養基干粉組合物與蒸餾水混合后形成的培養基液體，以及新制實施例4-5的培養基組合物(液體)和過濾滅菌后在2。C下保存一周后的實施例4-5的培養基組合物(液體)。對于培養基干粉組合物，取配制l升的用量，置于1000ml燒杯中，加水1000ml,攪拌至溶解；對于培養基組合物(液體)直接進行測試。取0.1ml培養基(液體)加入細菌內毒素檢查用水(美國ACC)3.9ml，混勻即得試驗溶液。測試結果如下表所示表12<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>從表12的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能與現有培養基組合物的細菌內毒素水平相當，符合本行業標準對內毒素水平的要求(<10EU/ml),而且本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物存儲前后細菌內毒素水平變化不超過lEU/ml。(6)微生物限度按中華人民共和國藥典2005年版附錄XIJ微生物限度檢查法進行，檢查項目為細菌數、霉菌數，檢查法為平皿法。對于動物細胞培養基干粉組合物，稱取lg,精確至0.0lg,加入無菌純化水10ml溶解，混勻可得試驗溶液；對于動物細胞培養基(液體)組合物用滅菌移液器在無菌條件下轉移10ml以直接作為試驗溶液。測試結果如下表所示表13<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>從表13的結果可以看出，本發明的培養基干粉混合物和培養基組合物(液體)無論是新制還是存儲一段時間后，都能與現有培養基組合物的微生物限度水平相當，符合本行業標準對內毒素水平的要求(《00CFU/g的細菌)，而且本發明的培養基千粉混合物和培養基組合物存儲前后微生物限度水平并未發生變化。(7)細胞生長試驗培養實施例1將實施例1制得的動物細胞培養基干粉組合物11022.4毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入30ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.20lam的濾菌膜過濾滅菌，即得培養液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cn^細胞培養瓶中，接種Vero細胞懸液，接種密度為5x1(^細胞/ml。然后在(37±1)。C溫度條件及(5±0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14，細胞培養72小時的照片見圖1。由圖l可以看出，被培養的細胞密度大，細胞的邊緣非常清晰，形態正常。培養實施例2將實施例2制得的動物細胞培養基干粉組合物13294.6毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入40ml小牛血清混合，然后用超純水定容至lOOOml。使用O.lOium的濾菌膜過濾滅菌，即得培養液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cn^細胞培養瓶中，接種Vero細胞懸液，接種密J乙為5xl0"田胞/ml。然后在(37±1)。C溫度條件及(5±0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14。培養實施例3將實施例3制得的動物細胞培養基干粉組合物12316毫克，溶于900ml超純水中，向所得混合物中加入10ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.15jum的濾菌膜過濾滅菌，即得培養液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cn^細胞培養瓶中，接種Vero細胞懸液，接種密度為5x10S田胞/ml。然后在(37±1)。C溫度條件及(5±0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14。培養實施例4向970ml實施例4制得的動物細胞培養基組合物中加入30ml馬血清混合，使用0.15pm的濾菌膜過濾滅菌，即得培養液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cn^細胞培養瓶中，接種Vero細胞懸液，接種密度為5x1(^細胞/ml。然后在(37±1)。C溫度條件及(5士0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14。培養實施例5取實施例5制得的培養基組合物1000ml直接使用，其中含有2.9體積％的小牛血清。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cm"田胞培養瓶中，接種CHO細胞懸液，接種密度為5x1(y4田胞/ml。然后在(37土1)。C溫度條件及(5士0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14，細胞培養72小時的照片見圖5。由圖5可以看出，被培養的細胞密度大，細胞的邊緣非常清晰，形態正常。培養對比例1將對比例1制得的動物細胞培養基干粉組合物9513.11毫克，溶于850ml超純水中，向所得混合物中加入100ml小牛血清混合，然后用超純水定容至1000ml。使用0.20jJm的濾菌膜過濾滅菌，即得培養液。在無菌條件下，用滅菌移液器將10ml上述培養液轉移到25cn^細胞培養瓶中，接種Vero細l包懸液，接種密度為5xio4細胞/ml。然后在(37±1)。C溫度條件及(5±0.1)%二氧化碳體積分數條件下進行培養，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14，細胞培養72小時的照片見圖2。由圖2可以看出，被培養的細胞密度大，細胞的邊緣清晰，形態正常。培養對比例2采用CN1723277的實施例2記載的培養基[5%牛血清+0-2(10昭/1111)+胰島素(IOjug/ml)+PDGF(lng/ml)+EGF(10ng/ml)地塞米松(5x1()-9]\4)+凝血酶(l單位)]，按照培養對比例l相同的條件下培養細胞，記錄單位天數細胞覆蓋瓶底的面積以及細胞長滿培養瓶底的時間。培養結果見后文表14,細胞培養72小時的照片見圖3。由圖3可以看出，被培養的細胞密度大，細胞的邊緣清晰，形態正常。i咅養^J"比例3按照培養對比例1的方法制備培養液并培養細胞，不同的是，只加入30ml小牛血清。培養結果見后文表14，細胞培養72小時的照片見圖4。從圖4可以看出，由于培養過程中使用的血清少，導致Vero細胞生長速度慢、密度低，細胞的邊緣不清晰，形態不正常。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>從表14的結果可以看出，本發明的動物細胞培養基干粉組合物和培養基組合物能配合低含量動物血清使用(或含有低含量的動物血清)，達到與使用高含量動物血清持平甚至更好的促進動物細胞生長的作用。由于采用本發明的動物細胞培養基干粉組合物和培養基組合物，在動物細胞培養的整個過程中，在不影響細胞生長的前提下，血清的使用量可以顯著降低，從而使大規模生產的成本顯著降低。由于本發明的動物細胞培養基干粉組合物，無需額外引入蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細胞因子等)，因此不產生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好。權利要求1.一種動物細胞培養基干粉組合物，其特征在于，該動物細胞培養基干粉組合物包括下表1所示的組分表1組分重量份組分重量份L-丙氨酸80-120四水合硝酸鈣30-80L-精氨酸鹽酸鹽180-210氯化鉀320-500L-天門冬氨酸5-30無水硫酸鎂40-80L-天門冬酰胺30-60氯化鈉6000-8000L-半胱氨酸鹽酸鹽10-30無水磷酸氫二鈉300-400L-谷氨酸100-150七水硫酸亞鐵0.1-1L-谷氨酰胺200-500七水合硫酸鋅0.2-3L-組氨酸鹽酸鹽20-50D-葡萄糖1000-3000L-羥脯氨酸2-15谷胱甘肽0.2-2L-異亮氨酸90-150丙酮酸鈉20-120L-亮氨酸10-70抗壞血酸1-10L-賴氨酸鹽酸鹽100-200氯化膽堿5-25L-蛋氨酸10-50D-泛酸鈣1-10L-苯丙氨酸10-50葉酸2-10L-脯氨酸20-60煙酰胺1-5L-絲氨酸20-60鹽酸吡哆醇1-10L-蘇氨酸60-100核黃素0.2-2L-色氨酸10-50鹽酸硫胺1-10L-纈氨酸30-70維生素B121-10L-酪氨酸30-80六水合氯化鎂40-100甘氨酸30-80次黃嘌呤1-10L-胱氨酸鹽酸鹽30-80胸苷0.1-2無水氯化鈣30-80無水磷酸二氫鉀20-100無水磷酸二氫鈉30-802.根據權利要求1所述的動物細胞培養基干粉組合物，其中，所述動物細胞培養基干粉組合物包括下表2所示的組分<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3.根據權利要求1或2所述的動物細胞培養基干粉組合物，其中，所述細胞干粉組合物還包括1-3重量份的亞油酸、1-3重量份的維生素D2、1-3重量份的維生素K3和2-10重量份的酚紅中的一種或幾種。4.一種動物細胞培養基干粉組合物的制備方法，該方法包括將選自權利要求1-3中任意一項所述的動物細胞培養基干粉組合物的組分分散在分散劑中，移除所得混合物中的分散劑。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述分散劑選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水、超純水、能與水以任意比互溶的醇、堿性水溶液和酸性水溶液中的一種或幾種。6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述堿性水溶液為氫氧化鈉溶液或者權利要求1-3中所述的動物細胞培養基干粉組合物中出現的陽離子的堿的水溶液，所述酸性水溶液為權利要求1-3中所述的動物細胞培養基干粉組合物出現的酸才艮離子的酸的水溶液。7.—種動物細胞培養基組合物，該組合物包括動物細胞培養基干粉組合物及其載劑，其特征在于，所述動物細胞培養基干粉組合物選自權利要求1-3中任意一項所述的動物細胞培養基干粉組合物中。8.根據權利要求7所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述載劑選自蒸餾水、去離子水、注射用水、重蒸水和超純水中的一種或幾種。9.根據權利要求8所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述載劑為注射用水和/或超純水。10.根據權利要求7所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述載劑的用量為600000-1500000重量份。11.根據權利要求10所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述載劑的用量為800000-1200000重量份。12.根據權利要求11所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述載劑的用量為1000000重量份。13.根據權利要求7所述的動物細胞培養基組合物，其中，所述動物細胞培養基組合物還包括終濃度為1體積％至小于10體積％的動物血清。14.一種動物細胞培養基組合物的制備方法，該方法包括將動物細胞培養基干粉組合物分散在載劑中，過濾滅菌，其特征在于，所述動物細胞培養基干粉組合物選自權利要求1-3中所述的動物細胞培養基干粉組合物中的一種或幾種。15.根據權利要求14所述的動物細胞培養基組合物的制備方法，該方法還包括向分散有所述培養基干粉組合物的載劑中加入終濃度為1體積％至小于10體積％的動物血清。全文摘要本發明提供了一種動物細胞培養基干粉組合物，與現有的通過引入重組蛋白或動物來源組分來降低動物血清用量的動物細胞培養基干粉組合物相比，由于本發明的動物細胞培養基干粉組合物，無需額外引入蛋白成分(例如重組蛋白、植物蛋白或動物來源組分如細胞因子等)，就能配合低含量動物血清使用達到與高含量動物血清持平甚至更好的促進動物細胞生長的作用，因此本發明的動物細胞培養基干粉組合物不產生伴隨蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本發明的動物細胞培養基干粉組合物培養的細胞，不同批次差異小，成本低，利于分離細胞下游產品、安全性好，適于用作生產疫苗等生物制品的病毒宿主、表達載體等。文檔編號C12N5/06GK101386836SQ200710121709公開日2009年3月18日申請日期2007年9月12日優先權日2007年9月12日發明者韌張,陳文慶申請人:北京清大天一生物技術有限公司