專利名稱：：吡咯并喹啉醌依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶的改良突變體的制作方法吡咯并喹啉醌依賴性可溶性葡萄糖脫氬酶的改良突變體本發明涉及對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高特異性的PQQ-依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH;EC1丄5.2)的突變體，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸替代了蘇氨酸，并且其中所述突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變和一個或多個用于提高突變體對己糖例如優選葡萄糖的親和性的突變，和/或一個或多個用于進一步提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的特異性的突變，并且其中這些位置對應于乂人醋酸4丐不動桿菌(爿.ca/coace"cw)s-GDH野生型序列已知的氨基酸位置。還公開了編碼該突變體s-GDH的基因，和這些s-GDH突變體的不同應用，特別是用于測定樣品中葡萄糖的濃度。'
背景技術：
：血糖濃度的測定在糖尿病的臨床診斷和監控中是非常重要的。全世界大約150百萬人患有慢性疾病糖尿病，根據WHO,到2025年，該數字將加倍。盡管糖尿病能容易地得到診斷和治療，成功的長期監控需要快速而精確地報道血糖濃度的低成本診斷工具。PQQ-依賴性葡萄糖脫氬酶(EC1丄5.2)催化將葡萄糖氧化成葡糖酸內酯的反應。因此，將這種類型的酶用于測量血糖中。這些工具之一是基于可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GlucDOR,EC1.1.5.2)的診斷試條，可溶性葡萄糖脫氬酶是最初源自醋酸4丐不動桿菌(v4"'""o6a"erca/coace"cws)的含p比咯并會啉醌的酶。醌蛋白使用醌作為輔因子，將醇、胺和醛糖氧化成其相應的內酯、醛和膝糖酸(Duine,J.A.,EnergygenerationandtheglucosedehydrogenasepathwayinJc7'w"0Z^"er(不動桿菌中的能量產生和葡萄糖脫氬酶途徑)，在"TheBiologyofJ"'"e/oM"e,'(不動桿菌的生物學)NewYork,PlenumPress(1991),pp.295-312;Duine,J.A.,Eur.J.Biochem.200(1991)271-284;Davidson,V丄.，在"Principlesandapplicationsofquinoproteins"(醌蛋白的原理和應用)，整本書，NewYork,MarcelDekker(1993);Anthony,C.,Biochem.J.320(1996)697-711;Anthony,C.和Ghosh,M.，CurrentScience72(1997)716-727;Anthony,C.,Biochem.Soc.Trans.26(1998)413-417;Anthony,C.和Ghosh，M.,Prog.Biophys.Mol.Biol.69(1998)1-22)。在醌蛋白中，含有非共價結合輔因子2,7,9-三羧基-lH-吡咯[2,3-f]喹啉-4,5-二酉同(PQQ)的那些構成最大的亞群(Duine1991,上文)。迄今為止已知的所有細菌性醌葡萄糖脫氬酶屬于該亞群，使用PQQ作為輔因子(Anthony和Ghosh1997上文；Goodwin,P.M.和Anthony,C.,Adv.Microbiol.Physiol.40(1998)1-80;Anthony,C.,Adv.inPhot,andResp.15(2004)203-225)。在細菌中已經表征了兩種類型的PQQ依賴性葡萄糖脫氬酶(ECl丄5.2):—種是膜結合的(m-GDH);另一種是可溶性的(s-GDH)。兩種類型沒有共享任何顯著的序列同源性(Cleton-Jansen,A.M.,等，Mol.Gen.Genet.217(1989)430-436;Cleton-Jansen,A.M.,等，AntonieVanLeeuwenhoek56(1989)73-79;Oubrie,A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(1999)11787-11791)。關于它們的動力學以及免疫特性也是不同的(Matsushita,K.,等，BioscienceBiotechnol.&Biochem.59(1995)1548-1555)。m-GDH在革蘭氏陰性細菌中廣泛分布，然而，只在不動桿菌菌抹如醋酸鈣不動桿菌(Duine，J.A.,1991a;Cleton-Jansen,A.M.等，J.Bacteriol.170(1988)2121-2125;Matsushita和Adachi,1993)和鮑氏不動桿菌(AMwma""")(JP11243949)的周質間隙中發現了s-GDH。通過搜索序列數據庫，已經在大腸桿菌K-12和集胞藻屬(5y"ec/zoc，to)中鑒定了兩個與全長醋酸4丐不動桿菌s-GDH同源的序列。此夕卜，還分別在綠膿桿菌(Raemginosa)和百日咳桿菌(Bordetellapertussis)(Oubrie等.1999a,b,c)以及中間腸桿菌(Enterobacterintermedium)(Kim,C.H.等，CurrentMicrobiol.47(2003)457-461)的基因組中發現了與醋酸朽不動桿菌s-GDH同源的兩個不完整序列。這四個未表征蛋白質的推論氨基酸序列與醋酸鉤不動桿菌s-GDH密切相關，在推定的絕對保守的活性位點具有許多殘基。這些同源蛋白可能具有相似的結構并催化相似的PQQ依賴性反應(Oubrie等，1999a,b,c;OubrieA.，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151;Reddy,S.,和Brmce,T.C.,J.Am.Chem.Soc.126(2004)2431-2438;Yamada,M.等，Biochim.Biophys.Acta1647(2003)185-192)。已經發現細菌性s-GDH和m-GDH具有非常不同的序列和不同的底物特異性。例如，醋酸釣不動桿菌含有兩種不同的PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶，一種稱為m-GDH,其在體內是活性的，而另一種稱為s-GDH,因為其只在體外可以顯示出活性。Cleton-Jansen等，1988;1989a,b克隆了編碼兩種GDH酶的基因并測定這兩種GDH基因的DNA序列。在m-GDH和s-GDH之間不存在明顯的同源性，確證了m-GDH和s-GDH表示兩種完全不同的分子的事實(Laurinavicius,V,等，Biologija(2003)31-34)。已經在大腸桿菌中克隆了來自醋酸鈣不動桿菌的s-GDH的基因。在細胞中產生后，s-GDH通過細胞質膜轉移至周質間隙(Duine,J.A.,(不動桿菌中的能量產生和葡萄糖脫氫酶途徑)，在"TheBiologyofJ"'""o6a"w"(不動桿菌的生物學)NewYork,PlenumPress(1991),pp.295-312;Matsushita,K.和Adachi,O.,Bacterialquinoproteinsglucosedehydrogenaseandalcoholdehydrogenase(細菌性酷蛋白葡萄糖脫氬酶和醇脫氳酶)，在"PrinciplesandapplicationsofQuinoproteins"(酉昆蛋白的原理和應用)，NewYork,MarcelDekker(1993)pp.47-63)。和來自醋酸鈣不動桿菌的天然s-GDH—樣，在大腸桿菌中表達的重組s-GDH是同型二聚體，每個單體具有一個PQQ分子和三個鈣離子(Dokter,P.等，Biochem.J.239(1986)163-167;Dokter,R等，FEMSMicrobiol.Lett.43(1987)195-200;Dokter,R等，Biochem.J.254(1988)131-138;Olsthoorn,A.J.牙口Duine,J.A.,Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48;Oubrie,A.,等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333;Oubrie,A.，等，Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A96(1999)11787-11791;Oubrie,A.,等，EmboJ.18(1999)5187-5194)。s-GDH將多種單糖和二糖氧化成相應的酮，其進一步水解成醛糖酸，它還能夠給PMS(吩。秦硫酸曱酯)、DCPIP(2,6-二氯-酚靛酚)、WB(Wurster，s藍)和短鏈泛醌如泛醌Ql和泛醌Q2(Matsushita,K.，等，Biochem.28(1989)6276-6280;Matsushita,K.,等，AntonieVanLeeuwenhoek56(1989)63-72),幾種人工電子受體如N-甲基phenazonium碌l酸二甲醋(Olsthoom,A.J.和Duine,J.A.,Arch.Biochem.Biophys.336(1996)42-48;Olsthoom,A丄和Duine,J.A.,Biochem.37(1998)13854-13861)和導電聚合物(Ye，L.,等，Anal.Chem.65(1993)238-241)提供電子。鑒于s-GDH對葡萄糖的高比活性(Olsthoorn,A丄andDuine,J.A.,(1996)上文)及其寬泛的人工電子受體特異性，這種酶非常適于分析應用，特別是用于診斷應用中葡萄糖測定的(生物)傳感器或試條中(Kaufmann,N.等,Developmentandevaluationofanewsystemfordeterminingglucosefromfreshcapillarybloodandheparinizedbloodin"Glucotrend"(1997)1-16(用于在"Glucotrend"中測定來自新鮮毛細管血液和肝素化血液的葡萄糖的新系統的研發和評價)，BoehringerMannheimGmbH;Woosuck，S.等，SensorsandActuatorsB100(2004)395-402)。葡萄糖氧化可以通過至少三種非常不同的酶組來催化，即，通過NAD/P-依賴性葡萄糖脫氳酶、通過黃素蛋白葡萄糖脫氫酶或通過醌蛋白GDH(Duine,J.A.，Biosens.Bioelectronics10(1995)17-23)。已經觀察到還原的s-GDH相當慢的自體氧化，證明了氧對于s-GDH是非常差的電子受體(OlsthoornandDuine,1996)。s-GDH可以有效地將來自還原的醌的電子提供給介質如PMS、DCPIP、WB和短鏈泛醌如Ql和Q2，但是沒有有效地將電子直接提供給氧。用于監控例如來自糖尿病患者的血液、血清和尿液中的葡萄糖水平的傳統試條和傳感器使用葡萄糖氧化酶。這種酶的性能依賴于氧濃度。在空氣中具有不同氧濃度的不同高度的葡萄糖測量可能導致假結果。PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶的主要優勢是它們不依賴于氧。這種重要的特征例如描述于US6,103,509中，其中研究了膜結合GDH的一些特征。對該領域的重要貢獻是一起使用了s-GDH和合適的介質。基于s-GDH的測試方法和試條裝置詳細7>開于US5,484,708中。該專利還含有關于測試的設定和用于測量葡萄糖的基于s-GDH的試條的生產的詳關于i領域和包括關于具有葡萄糖脫氫酶活性的酶的各鄉種應用模式的信息的其他專利或申請是US5,997,817;US6,057,120;EP0620283;和JPll-243949-A。利用s-GDH和反應發生時產生顏色變化的指示劑的商業系統(Kaufmann等，1997,上文)是由RocheDiagnosticsGmbH配售的Glucotrend系統。盡管以上討論了使用PQQ依賴性s-GDH的優勢，但認為在葡萄糖的測定中還是有缺陷的。該酶與m-GDH相比，具有相當寬的底物譜。即，s-GDH不僅氧化葡萄糖，而且還氧化幾種其他的糖，包括麥芽糖、半乳糖、乳糖、甘露糖、木糖和核糖(Dokter等，1986a;OubrieA.,Biochim.Biophys.Acta1647(2003)143-151)。在特定情況中，針對葡萄糖以外的糖的反應性可能削弱測定血糖水平的精確性。特別在進行腹膜滲析的患者中，使用淀粉類多糖(葡萄糖聚合物)的治療可能在他們的體液例如血液中含有高水平的其他糖，尤其是麥芽糖(Wens,R.,等，Perit.Dial.Int.18(1998)603-609)。因此，臨床樣品，如從糖尿病患者獲得的，尤其是從腎并發癥患者獲得的，尤其是從滲析下的患者獲得的，可以含有顯著水平的其他糖，尤其是麥芽糖。從這樣的臨床患者獲得的樣品中的葡萄糖測定受到了麥芽糖的削弱(Frampton,J.E.和Plosker,G丄.，Drugs63(2003)2079-2105)。關于產生具有改變的底物特異性的改良PQQ依賴性s-GDH的嘗試，在文獻中有一些報道。Igarashi，S.,等，Biochem.Biophys.Res.Commun.264(1999)820-824報道了在位置Glu277引入點突變形成了具有改變的底物特異性特征的突變體。Sode,EP1176202，報道了s-GDH內的特定氨基酸取代形成了對葡萄糖具有提高的親和性的突變體s-GDH。在EP1167519中，同一作者報道了具有提高穩定性的突變體s-GDH。此外，同一作者在JP2004173538中報道了對葡萄糖具有提高的親和性的其他s-GDH突變體。Kratzsch,P.等，WO02/34919報道了可以通過s-GDH的特定位置中的氨基酸置換來提高s-GDH對葡萄糖的特異性，與其他糖底物相比較，尤其是與麥芽糖相比較。重要且決定性的是氨基酸位置348的置換。例如在位置348含有替代野生型s-GDH中存在的蘇氨酸的甘氨酸的突變體s-GDH對底物葡萄糖具有顯著提高的選擇性，例如，與底物麥芽糖相比較。它們還公開了在位置348和428具有置換的雙突變體對葡萄糖具有更加提高的特異性。在WO2006/008132中，顯示了s-GDH的氨基酸428和429之間的氨基酸插入，尤其是結合位置348的合適氨基酸置換，對底物特異性具有非常有利的作用。含有該插入的突變體例如對底物葡萄糖具有更高的特異性，與底物麥芽糖相比較。然而，已經報道了對葡萄糖特異性的一些改進，顯示出這些改進經常和不幸地結合一些缺陷，例如這樣突變的S-GDH降低的穩定性、降低的活性和/或降低的對葡萄糖的親和性。例如，已經清楚的是在位置348包括氨基酸置換的s-GDH突變體花費于所述突變體的穩定性、親和性和活性，與野生型酶相比^1。因此對于進一步改進的突變形式的s-GDH存在著^艮大的需求和臨床需要，該突變形式的s-GDH對葡萄糖具有高特異性，并且同時其特征在于合適的熱穩定性，以及比活性或對葡萄糖的親和性的提高，或特征在于比活性和對葡萄糖的親和性同時提高。本發明的任務是提供新的s-GDH突變體或變體，其與在位置348包括置換的具有提高的特異性的突變體相比較，具有顯著提高的熱穩定性、比活性和對葡萄糖的親和性。已經發現了通過從所附權利要求中給出的位置選擇突變，可以顯著提高在位置348具有置換的s-GDH突變體的熱穩定性、比活性和對葡萄糖的親和性。由于新形式的s-GDH的改良特性，用于各種應用領域中葡萄糖測定的有意義的技術方法是可能的。例如可以根據本發明的改良s-GDH突變體，對于生物樣品中葡萄糖的特異性檢測或測量具有很大的優勢。發明概述本發明涉及s-GDH的突變體。公開了PQQ-依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH;ECL1.5.2)的突變體，其對于葡萄糖(與麥芽糖相比)具有提高的特異性，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸，并且其中所述突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變，至少一個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變，和任選一個或多個用于進一步提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比)的特異性的突變，并且其中給出的位置對應于從醋酸4丐不動桿菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)已知的氨基酸位置。還公開了分離的編碼s-GDH突變蛋白的多核苷酸，含有可操作連接啟動子序列的所述分離多核苷酸的表達載體，該啟動子序列能夠促進所述多核苷酸再宿主細胞中的表達，以及含有所述表達載體的宿主細胞。此外，描述了生產s-GDH突變體的方法，包括在適于產生s-GDH突變體的條件下培養用合適的表達載體轉染的宿主細胞。還公開了使用根據本發明的改良s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法，所述改進包括將樣品接觸所述突變體。還描述了用于檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置，包括根據本發明的改良s-GDH和所述測量需要的其他試劑。發明詳述在第一個實施方案中，本發明涉及PQQ-依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH;EC1丄5.2)的突變體，其對于葡萄糖(與麥芽糖相比)具有提高的特異性，在位置348由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸，并且其中所述突變體包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變，另外包括至少一個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變，和任選一個或多個用于進一步提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比)的特異性的突變，并且其中給出的位置對應于從醋酸釣不動桿菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)已知的氨基酸位置。如WO02/34919中所述的，對應于從醋酸4丐不動桿菌分離的野生型序列的s-GDH序列的位置348中的氨基酸置換可以用來顯著提高s-GDH的葡萄糖特異性。這是為什么本發明的框架中所述的改進得到了全部描述，并且是基于在位置348含有氨基酸置換的s-GDH突變體。優選，位置348的殘基蘇氨酸是由選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的氨基酸殘基置換的。在更優選的實施方案中，甘氨酸或絲氨酸用來替代位置348的蘇氨酸。術語T348G是本領域技術人員已知的，并且表示位置348的蘇氨酸由甘氨酸替代。如上所討論的，將具有葡萄糖脫氬酶活性的兩種完全不同的醌蛋白酶類型(膜結合的和可溶性的)一起分組在EC1丄5.2下。這兩種類型顯示出彼此不相關。對于本發明的目的，只有可溶性形式的GDH(s-GDH)是相關的，并且以下討i侖其改良的突變體。本領域已知可以從不動桿菌的菌抹分離出可溶性PQQ依賴性葡萄糖脫氬酶的野生型DNA-序列。最優選的是從醋酸釣不動桿菌型菌抹LMD79.41分離s-GDH。這種野生型s-GDH的多肽序列(成熟蛋白)和DNA序列各自在SEQIDNO:2和SEQIDNO:l中給出。其他不動桿菌的LMD菌株也可以用作野生型s-GDH的來源。可以將這樣的序列與從醋酸釣不動桿菌獲得序列進行比對并進行序列比較。還可行的是篩選其他細菌菌抹的DNA文庫，如例如所述的大腸桿菌K-12(Oubrie,A.,等，J.Mol.Biol.289(1999)319-333),并用來鑒定這樣的基因組中與s-GDH相關的序列。這樣的序列以及尚未鑒定的同源序列可以用來產生具有提高的熱穩定性的s-GDH突變體。通過參考從SEQIDNO:2已知的氨基酸位置，更詳細地描述本發明的成就，SEQIDNO:2是從醋酸鈣不動桿菌型菌林LMD79.41分離的野生型s-GDH序列。通過合適的序列比較容易地鑒定出不同的s-GDH分離物中對應于SEQIDNO:2的氨基酸位置。l尤選^f吏用GCGPackageVersion10.2(GeneticsComputerGroup,Inc.)的PileUp程序進行s-GDH序列與野生型SEQIDNO:2序列的多重比對和比較。PileUp形成了多個序列比對，使用Feng，D.F.和Doolittle,R.F.，J.Mol.Evol.25(1987)351-360的漸進性比對方法的簡化，并且因此限定用于相同、相似或不同氨基酸殘基的記分矩陣。這種方法開始于兩個最相似序列的成對比對，產生了兩個受比對序列的簇。然后，可以將該簇與下一個最相關的序列或受比對序列的簇進行比對。可以通過兩個單獨序列的成對比對的簡單延伸來比對兩個蔟的序列。通過一系列漸進性的成對比對來完成最終的比對，該漸進性的成對比對包括遞增的不同序列和簇，直至所有序列包括在最終的成對比對中。可以容易地將另一個同源s-GDH分子中這樣的氨基酸位置鑒定為對應于SEQIDNO:2中的醋酸4丐不動桿菌s-GDH給出的位置。這是為什么在此給出的氨基酸位置應當理解為SEQIDNO:2的氨基酸位置或作為另一個同源s-GDH分子中與其對映的位置。在本發明的意義傷，術語"突變體"或"變體"涉及s-GDH蛋白，其與SEQIDNO:2給出的野生型氨基酸序列相比較，呈現出至少一個氨基酸置換、刪除或插入。s-GDH突變體可以包括其他置換和/或刪除和/或插入，只要本發明的s-GDH突變體與SEQIDNO:2的s-GDH的不同不超過45個氨基酸，例如，總共呈現出最多45個氨基酸置換、插入或刪除。是在短期溫度應力模型中提高S-GDH突變體的熱穩定性的任何氨基置換和/或刪除和/或插入。如上所述，只有并且很大程度地以降低的穩定性、對葡萄糖降低出王見葡萄j唐特異性的提高，'、、。、、p在這樣的短期應力模型中測定根據本發明的穩定性，并將該模型中測定的s-GDH穩定性稱為熱穩定性。通過測量樣品無應力的和受應力的s-GDH酶活性來測定熱穩定性。通過將無應力樣品活性設定為100%,可以以百分比計算應力處理后的剩余活性。對于具有提高的底物特異性的s-GDH的突變體，選擇了64。C持續30分鐘的應力條件。使用這些條件，野生型酶具有約80%剩下的最初活性，而大部分對葡萄糖具有提高的特異性的突變體，將它們接受這種短期應力模型后，只具有10%或更低剩下的最初活性。優選，用于提高在位置348由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換蘇氨酸的s-GDH變體的穩定性的突變是置換。優選，所述置換選自D87R;N122K;S124K;S146A或G;L187F或M;N267Y;V298L;T313D和L368F。還優選用于提高s-GDH變體的穩定性的所述置換選自D87R;N122K;S124K;S146G;V298L和L386F。在進一步優選的實施方案中，在突變的s-GDH中使用兩個、三個或四個這些置換的組合，或者還優選的是，使用所有這些五個置換。在優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置87含有精氨酸，如從醋酸鈣不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置87的位置中。在進一步優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置122含有賴氨酸，如從醋酸釣不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置122的位置中。在進一步優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置124含有賴氨酸，如從醋酸釣不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置124的位置中。在進一步優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置146含有甘氨酸，如從醋酸鉤不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置146的位置中。在進一步優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置298含有亮氨酸，如從醋酸鈣不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置298的位置中。在進一步優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在位置386含有苯丙氨酸，如從醋酸仍不動桿菌野生型s-GDH(SEQIDNO:2)已知的或在對應于同源酶中的所述位置386的位置中。就熱穩定性而言，已經發現六個s-GDH的位置對于獲得顯著提高似乎是相當重要的，即，位置87、122、124、146、298和386。在此顯著相關的是已經發現這些置換對突變體的熱穩定性具有顯著作用的事實，該突變體是之前為了提高葡萄糖特異性而產生的，但是是以降低的熱穩定性為代價的。在優選的實施方案中，根據本發明的s-GDH突變體在SEQIDNO:2的位置87含有精氨酸，在位置122和124含有賴氨酸，在位置146含有甘氨酸，在位置298含有亮氨酸，而在位置386含有苯丙氨酸，或者如果使用了同源s-GDH,在對應于所述位置的位置中。在進一步優選的實施方案中，本發明涉及PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氬酶(s-GDH;EC1丄5.2)的突變體，其對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348由甘氨酸或由丙氨酸或由絲氨酸置換了蘇氨酸，其中所述突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變和至少一個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變。術語對底物的"親和性"是本領域公知的。以mM給出，稱為Km-值。本領域已知各種方法來測定s-GDH的親和性，使用葡萄糖或其他糖作為底物，參考，Igarashi,S.,等，BiochemBiophysResCommun264(1999)820。在使用粗制大腸桿菌提取物篩選新變體中，進行Km-值的百分比計算，用于對所產生的克隆進行較快的評價。對于候選的s-GDH突變體，根據公知的Michaelis-Menten-動力學計算對葡萄糖的親和性。與在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸的突變體相比較，根據本發明的s-GDH突變體對葡萄糖具有提高的親和性。優選，如實施例部分中詳細所述的來測定對底物葡萄糖的親和性。優選，用于提高已經在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸的s-GDH突變體對葡萄糖的親和性的一個或多個突變選自L110H或Y;N229A、G或S;Q246H、M或N;Y333A;G339T;M341V;V349A或G和V436P。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置110的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸亮氨酸由選自組氨酸和酪氨酸的氨基酸置換。更優選，位置110的置換是由組氨酸置換的。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置229的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸天冬酰胺由選自丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的氨基酸置換。更優選，位置229的置換是由丙氨酸置換的。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置349的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸纈氨酸由選自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸置換。更優選，位置349的置換是由甘氨酸置換的。還優選的是，用于提高對葡萄糖的親和性的突變選自L110H、Q246H;G339T;M341V、V349G和V436P。還優選的是，用于提高對葡萄糖的親和性的所述置換選自Q246H;G339T;M341V和V349G。根據本發明優選的s-GDH包括這些置換中的兩個或三個或所有這些四個置換。在進一步優選的實施方案中，上述對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸并且包括至少一個用于提高穩定性的突變的s-GDH突變體另外包括一個或多個用于提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性的突變。對于特定的應用，對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸的s-GDH突變體的底物特異性還不足以用于特定的常規應用。在特定的實施方案中，需要產生除了上述在位置348的突變外還包括一個或多個其他用于進一步提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的特異性的突變的s-GDH突變體。術語"底物特異性"或"特異性"是本領域技術人員公知的。為了計算底物特異性或交叉反應性，一種容易的方法是將用葡萄糖作為底物測量的活性設定為100%并將使用其他選定的糖測量的活性與葡萄糖值進行比較。有時候，為了不多余，簡單使用術語特異性，一方面沒有特意參照葡萄糖，而另一方面沒有特意參照選定的其他糖。本領域的專家清楚使用公認的條件以等摩爾濃度的所研究底物分子進行酶活性比較是最好的。另外必須進行濃度差異的校正。為了測試底物特異性(的提高)，必須選擇標準化和公認的測試條件。如實施例部分中所述的來測量s-GDH對作為底物的葡萄糖以及對其他選定的糖底物的酶活性。基于各自對葡萄糖或對麥芽糖的酶活性的測量，測定交叉反應性(及其提高)。按照交叉反應性[%]=(麥芽糖活性/葡萄糖活性)xl00。/o計算以百分比計的s-GDH對麥芽糖的(交叉)反應性。根據上述等式已經將野生型s-GDH對麥芽糖的(交叉)反應性測定為約105%(參見WO02/34919)。根據以下等式計算特異性突變體葡萄糖活性野生型麥芽糖活性脅性=--------..........——-——x..................................—…突變體麥芽糖活性野生型葡萄糖活性與對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換了蘇氨酸的s-GDH突變體相比較，認為新的s-GDH突變體特異性的提高在上述計算中為較小的值。本領域技術人員將認識到絕對數取決于突變體中已經存在的突變的數量和種類。將突變體中已經存在的突變的數量和種類稱為突變背景。任何新的突變最好與突變背景直接比較。優選，用于進一步提高對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性的突變是選自Q145P;D163G或N;Q164F;L169F;Y171G;I208L或V;T224I;E245D;G276S;A294D或E;V300A、S、N、Y或I;T307G;T323V;A354Y、E或L;R378I、M、A或D;N428P的氨基酸置換和插入429P。術語"插入429"用來表示SEQIDNO:2的位置428和位置429之間插入脯氨酸。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置169的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸亮氨酸由選自苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的氨基酸置換。更優選，位置169的置換是由苯丙氨酸置換的。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置171的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸酪氨酸由選自丙氨酸、曱硫氨酸和甘氨酸的氨基酸置換。更優選，位置171的置換是由甘氨酸置換的。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置245的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸谷氨酸由選自天冬氨酸、天冬酰胺或谷酰胺的氨基酸置換。更優選，位置245的置換是由天冬氨酸置換的。在本發明的變體中對應于從醋酸鈣不動桿菌已知的s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)的位置341的氨基酸被置換的情況中，優選天然產生的氨基酸曱硫氨酸由選自纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的氨基酸置換。更優選，位置341的置換是由纈氨酸置換的。還發現了可以在位置428和429之間插入氨基酸優選脯氨酸來進一步提高已經在位置348包括置換的s-GDH突變體的底物特異性。還優選的是，用于提高對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性的其他突變選自L169F;Y171G;E245D;N428P和插入429P。優選，用于提高對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性的其他突變選自L169F;Y171G;E245D;和N428P。在進一步優選的實施方案中，使用兩個、三個或所有這四個置換的組合來提高該突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性。還優選的是，用于提高對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性的其他突變選自L169F;Y171G;E245D;和插入429P。在進一步優選的實施方案中，在突變的s-GDH中和插入429P—起使用兩個或全部三個置換的組合來提高該突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的底物特異性。如WO02/34919和WO2006/008132中分別所述的，位置428的置換，由此天冬酰胺由脯氨酸替代的，或位置428和429之間的氨基酸脯氨酸的插入，分別進一步提高了已經在位置348包括置換的s-GDH突變體的特異性。在進一步優選的實施方案中，本發明因此涉及PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氬酶(s-GDH;EC1.1.5.2)的突變體，其對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348具有由甘氨酸或由丙氨酸或由絲氨酸置換了蘇氨酸，由此天冬酰胺由脯氨酸替代或位置428和429之間插入氨基酸脯氨酸，其中所述突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變，至少一個用于提高突變體的比活性的突變，和任選一個或多個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變，和/或一個或多個用于進一步提高突變體對葡萄糖(與麥芽糖相比較)的特異性的突變，并且其中給出的位置對應于從醋酸鈣不動桿菌s-GDH野生型序列(SEQIDNO:2)已知的氨基酸位置。在另一個實施方案中，本發明涉及PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH;EC1.1.5.2)的突變體，其對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性，在位置348具有由甘氨酸或由丙氨酸或由絲氨酸置換了蘇氨酸，其中所迷突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變和至少一個用于提高突變體的比活性的突變。術語"比活性"是本領域公知的。它用來描述每含量蛋白質的酶活性。本領域已知用各種方法來測定s-GDH的比活性，使用葡萄糖或其他糖作為底物，參見，例如，Igarashi,S.,等，BiochemBiophysResCommun264(1999)820。與在位置348包括由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換蘇氨酸的突變體相比較，根據本發明的s-GDH突變體對底物葡萄糖具有提高的比活性。優選，用于提高對葡萄糖的比活性的突變是選自H30F或R;A301G或S和A302S或T的氨基酸置換。如本領域技術人員所知的，可以采取氨基酸置換，例如，沉默突變，其沒有將s-GDH的特性影響至顯著擴大。然而，根據本發明的變體與SEQIDNO:2相比較，具有不超過45個氨基酸變化。優選，變體將包括20個或更少的氨基酸置換，更優選，只有15個氨基酸置換或更少的置換存在。在實施例部分給出了根據本發明的一些特異性s-GDH變體。優選，具有低葡萄糖千擾而關于熱穩定性和對葡萄糖的底物親和性具有提高的特征的s-GDH變體包括具有以下置換的突變體N122K+L169F+Y171G+E245D+M341V+T348G+ins429P;429P;386F+ins429P;8L+M341V+T348S+L386F+ins429P;8L+G339T+M341V+T348G+L386F+ins429P;8L+M341V+T348S+L386F+ins429P+V436P;8L+M341V+T348S+V349G+A354T+L386F+ins429P;6H+V298L+M341V+T348S+L386F+ins429P。本領域中已知產生突變蛋白的各種可能性。基于本發明公開了特定殘基對提高突變體s-GDH的熱穩定性、對葡萄糖的親和性和底物特異性的關鍵重要性的重要發現，本領域技術人員現在可以容易地產生更多合適的帶有這些和其他有利改進的s-GDH變體。例如，可以通過已知的方法如隨機誘變(Leung,D.W.,等，Technique1(1989)11-15)和/或定點誘變(Hi11,D.E.，等，MethodsEnzymol.155(1987)558-568)來獲得這樣的變體。生產具有所需特性的蛋白的可替換方法是提供嵌合構建體，其含有來自至少兩個不同來源的序列要素，或完全合成合適的s-GDH基因。這樣本領域已知的方法可以結合本發明公開的信息使用來提供s-GDH的突變體或變體，其包括，例如，其他的氨基酸置換結合SEQIDNO:2的位置348置換的已知關鍵重要性。例如，可以通過從醋酸鈣不動桿菌型菌抹LMD79.41分離的s-GDH基因以及通過從同源序列開始來產生根據本發明的s-GDH變體。在本申請的范圍中，術語"同源"意思是與SEQIDNO:2相比較，包括具有至少90%同一性的s-GDH氨基酸序列。換句話說，使用PileUp程序進行合適的比對后，該同源s-GDH至少90%的氨基酸與SEQIDNO:2中所述的氨基酸相同。將理解DNA和氨基酸序列的變化天然存在，或可以是使用本領域已知的方法有意引入的。這些變化可以導致整個序列與SEQIDNO:2相比較高達10%的氨基酸差異，這些差異是由于所述序列中一個或多個氨基酸殘基的刪除、置換、插入、顛倒或添加引起的。例如，可以基于所涉及殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質，進行這樣的氨基酸置換。例如，負電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有不帶電的極性頭部基團或非極性頭部基團并具有相似親水性值的氨基酸包括以下的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其他考慮的變化包括上述多肽的鹽和酯，以及上述多肽的前體，例如，具有N-端置換的前體，如用作前導序列的曱硫氨酸、N-曱酰曱硫氨酸。可以進行這樣的變化，而沒有必然地脫離本發明的范圍和精神。法，可以獲得編碼上述任一種s-GDH突變體的多核苷酸序列。本發明因此還包括分離的多核苷酸序列，其編碼如上所述的根據本發明的s-GDH突變蛋白。本發明進一步包括表達載體，其含有可操作連接能夠在宿主細胞中指導其表達的啟動子序列的根據本發明的核酸序列。本發明進一步包括表達載體，其含有可操作連接能夠在宿主細胞中指導其表達的啟動子序列的根據本發明的核酸序列。優選的載體是質粒，如圖2和3中所示的pACSGDH。本發明中有用的表達載體通常含有復制起點、用于選擇的抗生素抗性、用于表達的啟動子和完整的或一部分s-GDH基因變體。表達載體還可以包括本領域已知的其他DNA序列，如信號序列(用于更好的折疊、轉運至胞間質中或分泌)、用于更好地調節表達的誘導劑，或用于克隆的分裂位點。選定的表達載體的特征必須與待使用的宿主細力包相容。例如，在大腸桿菌細胞系統中克隆時，表達載體應當含有從大腸桿菌的基因組分離的啟動子(例如，/ac或^;)。可以-使用合適的復制起點，如ColEl質粒復制起點。合適的啟動子包括，例如，/ac和^。還優選的是表達載體包括編碼選擇標記如抗生素抗性基因的序列。作為可選擇的標記，通常氨基芐青霉素抗性或卡那霉素抗性。所有這些材料是本領域已知的并可購得。可以4吏用本領域已知的標準重組DNA^支術構建含有所需編碼和控制序列的合適表達載體，其中許多技術描述于Sambrook等的"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(分子克隆實-驗室手冊)中，(1989)ColdSpringHarbor,NY,ColdSpringHarborLaboratoryPress。本發明另外涉及含有表達載體的宿主細胞，該載體包括編碼全部或部分突變體s-GDH的DNA序列。宿主細胞優選含有如下的表達載體，該表達載體包括編碼具有實施例2-8中所示的一個或多個突變的突變體s-GDH的DNA序列之一的全部或部分。合適的宿主細胞包括，例如，/人Promega(2800V/oodsHollowRoad,Madison,WI,USA)可獲得的大腸桿菌HB101(ATCC33694)、從Stratagene(11011NorthTorreyPineRoad,LaJolla,CA,USA)可獲得的XL1-BlueMRF，等。可以通過本領域已知的各種方法將表達載體引入宿主細胞中。例如，可以通過聚乙二醇介導的原生質體轉化方法(Sambrook等，1989，上文)進行用表達載體轉化宿主細胞。然而，也可以使用其他將表達載體引入宿主細胞中的方法，例如，電穿孔、彈道注射或原生質體融合。一旦將含有s-GDH變體的表達載體引入合適的宿主細胞，可以在允許所需s-GDH變體表達的條件下培養宿主細胞。可以通過即抗生素選擇來容易地鑒定含有所需表達載體的宿主細胞，該表達載體具有編碼突變體s-GDH的全部或部分的DNA序列。可以通過不同的方法如測量-GDHmRNA轉錄產物的產生、免疫檢測基因產物或檢測基因產物的酶活性來鑒定s-GDH變體的表達。優選，4吏用酶測試。本發明還教導了s-GDH突變體的產生和篩選。按照本領域中所知的進行隨機誘變和飽和誘變。篩選變體的熱穩定性(將沒有熱應力處理的活性與熱應力處理后的剩余活性相比較)。調整所選擇的測試條件，以確保可以測量例如由單個氨基酸置換引起的預期少量提高。實施例3中給出了一種合適突變體的選擇或篩選的優選模式。可以清楚地檢測與起始酶(突變體或野生型)相比較的任何變化或提高。當然，應當理解不是所有的表達載體和DNA調控序列將同樣地起很好的作用來表達本發明的DNA序列。也不是所有的宿主細胞將同樣地與相同的表達系統一起起到很好的作用。然而，本領域技術人員將清楚使用在此提供的指導在表達載體、DNA調控序列和宿主細胞中進行選擇，而不需要過度的實驗。本發明還涉及用于產生本發明的s-GDH變體的方法，包括在適于產生本發明的突變體s-GDH的條件下培養本發明的宿主細胞。對于細菌宿主細胞，典型的培養條件是含有碳源和氮源、合適的抗生素和誘導劑(取決于所用的表達載體)的液體培養基。典型的合適抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素等。典型的誘導劑包括IPTG、葡萄糖、乳糖等。優選的是通過在宿主細胞中表達編碼突變體s-GDH的DNA序列的產生來獲得本發明的多肽。還可以通過由編碼突變體s-GDH的DNA序列編碼的mRNA的體外翻譯來獲得本發明的多肽。例如，可以如上所述的合成DNA序列并插入合適的表達載體中，隨后將其用于體外轉錄/翻i奪系統中。含有可操作地連接能夠在無細胞肽合成系統中促進表達的啟動子序列的如所限定的和上述的分離多核普酸的表達載體表示本發明的另一個優選實施方案。例如，通過如上所述的方法產生的多肽，然后使用各種常規蛋白純化技術來分離和純化。例如，可以使用色譜方法，如離子交換色譜、凝膠過濾色譜和親和性色譜。本發明改良的s-GDH變體的一個主要應用是用于試條中，用來監控糖尿病患者的血糖水平。如上所討論的，PQQ-依賴性葡萄糖脫氫酶對氧的不敏感性是優于葡萄糖氧化酶的一個大優勢。現在使用具有提高的熱穩定性以及對葡萄糖提高的特異性的新s-GDH變體可以顯著降低由于待分析樣品中可能存在的例如麥芽糖、半乳糖和/或其他相關糖引起的干擾。當然，可以研究許多種類的樣品。體液，如血清、血漿、小腸液或尿液是這些樣品的優選來源。本發明還包括使用根據本發明的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中的葡萄糖的方法。特別優選的是用于檢測樣品中的葡萄糖的改良方法的特征在于使用傳感器或試條裝置進行葡萄糖的所述檢觀'J、須'J定或測量。也在本發明范圍內的是用于檢測或測量樣品中的葡萄糖的裝置，其包括根據本發明的S-GDH突變體以及所述測量需要的其他試劑。本發明具有提高的熱穩定性的s-GDH變體也可以很有利地用于生物傳感器中(D'Costa,E丄，等，Biosensors2(1986)71-87;Laurinavicius,V，等，AnalyticalLetters32(1999)299-316;Laurinavicius,V.,等，MonatsheftefuerChemie130(1999)1269-1281;Woosuck，S.等，SensorsandActuatorsB100(2004)395-402)，用于在線監控樣品或反應器中的葡萄糖。出于該目的，例如，s-GDH變體可以用于覆蓋氧不敏感玻璃質電極，該電極具有含有氧化還原傳導環氧網絡的鋨復合物(Ye等，1993,上文)，用于更精確的測定葡萄糖濃度。在以下的實施例中，所有試劑、限制酶和其他材料都獲自RocheDiagnosticsGermany,除非特意指出其他商業來源，并根據供應商給出的說明來使用。用于DNA的純化、表征和克隆的搡作和方法是本領域7>^口的(Ausubel,F.，等,在"Currentprotocolsinmolecularbiology"(分子生物學的通用方案)中，(1994)WileyVerlag)，并可以按照需要由本領域技術人員來調整。以下的實施例進一步說明了本發明。不打算將這些實施例用來限制本發明的范圍，但提供了更多的本發明的理解。提供了以下的實施例、序列表和附圖來幫助理解本發明，其真實范圍列于所附權利要求中。理解可以對所示方法進行改動，但沒有脫離本發明的精神。附圖描述圖1:根據序列同源性比對的醋酸鈣不動桿菌PQQ-依賴性s-GDH(上圖)和鮑氏不動桿菌s-GDH(下圖)的蛋白序列。圖2:實施例1中提及的pACSGDH載體的說明，其各自含有可溶性PQQ依賴性葡萄糖脫氬酶的野生型或突變的DNA序列。圖3:實施例1中提及的pACSGDH載體的核苷酸(DNA)序列，其含有可溶性PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶的野生型DNA序列。實施例1大腸桿菌中野生型醋酸《丐不動桿菌可溶性PQQ依賴性葡萄糖脫氫酶的克隆和表達根據標準方法從醋酸釣不動桿菌菌林LMD79.41分離s-GDH基因。將野生型s-GDH基因亞克隆至含有用于可調節表達的wg/啟動子的質粒中(參考專利申請WO88/09373)。將新的構建體稱為pACSGDH(參見圖2和3以及SEQIDNO:3)。將重組質粒引入選自大腸桿菌組的s-GDH活性的菌S。口、'、"、、使用QIAGENPlasmidMaxi試劑盒(Qiagen)根據制造商的方案從200ml上述克隆的過夜培養物中分離出質粒pACSGDH。將質粒重懸浮于lml重蒸水中。使用BeckmanDU7400光度計測定質粒的濃度。產量為600j^g。然后，通過瓊脂糖凝膠電泳測定質粒的質量。實施例2產生突變體T348G和突變體T348S制造了各自用于產生具有突變T348G或T348S的改良變體突變體s-GDH的起始模板。選擇這些s-GDH的突變體，是因為已知它們對葡萄糖具有提高的底物特異性，與底物麥芽糖相比較(參見WO02/34919)。使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene,Cat.200518),以在位置348由甘氨酸或絲氨酸替代蘇氨酸。設計合適的引物。用于誘變的5，-和3，-引物彼此互補，并在特定的位置含有改變的密碼子，用于將蘇氨酸變成甘氨酸(ACA至GGG)或從蘇氨酸變成絲氨酸(ACA至TCA)。這些核苷酸的兩側在每一端為12至16個核香酸。核苷酸的序列與用于氨基酸變換的密碼子兩側的正義和反義DNA-鏈相同。替代密碼子ACA二蘇氨酸用于正義鏈，TGT用于反義鏈，含有GGG-甘氨酸或TCA二絲氨酸的引物給自用于正義鏈，CCC二甘氨酸或AGT二絲氨酸各自用于反義鏈。用于變換T348G的正義和反義鏈各自如SEQIDNO:3和4中所示。CATTTGCTGGCCAGGGGTTGCACCGTCAT(=SEQIDNO:4)ATGACGGTGCAACCCCTGGCCAGCAAATG(=SEQIDNO:5)根據手冊進行PCR反應和Z)pw/消化。此后，將的樣品用于XL-MRF，-細胞的電穿孔。在0.2cm的比色皿中使用BioRad大腸桿菌脈沖儀(BioRad)用2.5KV來實現電穿孔。在lmlLB中37。C生長一小時后，將細菌涂布于"4x酵母"培養基(20g酵母提取物+5gNaCl，pH7.0至11Aquadest.)-氨千青霉素瓊脂平板(lOOpg/ml氨千青霉素)，并在37。C生長過夜。使用以下的篩選方法檢測突變的s-GDH克隆。實施例3篩選將上述瓊脂平板上的突變體克隆挑選至微量滴定平板(MTP)中，每孔含有200jil"4x酵母，，-氨芐青霉素培養基，并在37。C孵育過夜。將這些平澤反稱為主(master)平板。從每個主平板，將5^1樣品/孔轉移至含有5]Lil/孔B(B:細菌蛋白提取試劑；PierceNo.78248)的MTP中，用于細胞破裂，并加入240jnl0.0556mM吡咯并會啉醌(PQQ);50mMHepes;15mMCaCl2pH7.0/孔，用于s-GDH的激活。為了完成全酶的形成，將MTP在25。C孵育2小時并在l(TC孵育過夜。將該平板稱為工作平板。從工作平板，將4x10ji1樣品/孔轉移至四個空的MTP中。此后，用標準濃度(即，30mM)的葡萄糖測試第一個等份，用降低的葡萄糖濃度(1.9mM替代30mM)測試第二個等份，用麥芽糖作為底物測試第三個等份，而在和第一個等份一樣測試第四個等份之前，將其在64。C接受應力30分鐘。以等摩爾標準濃度即30mM使用所有選擇的其他糖分子。對于所有的測試，使用已經含有待分析糖的介質溶液(參見實施例8)。計算dE/min,并將使用30mM葡萄糖作為底物的值設定為100%活性。將用其他糖獲得的值與葡萄糖值相比較并以百分比活性來計算((例如，對于麥芽糖為dE/min麥芽糖/dE葡萄糖)*100)。這等于(變體)酶的交叉反應性。在以下的表中，給出了"M/G",即，使用麥芽糖(M)作為底物與葡萄糖(G)作為底物的s-GDH的交叉反應性。將用1.9mM葡萄糖獲得的值與30mM葡萄糖值相比較，并以百分比相對活性來計算((dE/min1.9mM葡萄糖/30mM葡萄糖)*100)。這給出了％-值，這是所分析變體的Km-值的直接表示。根據該計算，越高的％-值表示越低(=越好)的Km-值。表1:突變體T348G和T348S與野生型(WT)s-GDH相比較的基礎特征<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>實施例4突變體s-GDH的測序對s-GDHT348G舉例說明該方法。以下詳述的測序也可以用于其他s-GDH突變體的測序。將一些的引物用于s-GDH突變體的測序正義鏈5'-TTAACGTGCTGAACAGCCGG-3'(=SEQIDNO:6)反義鏈5、畫ATATGGGTAAAGTACTACGC-3'(=SEQIDNO:7)各自分離含有突變體s-GDHT348G和s-GDHT348S基因的質粒，s-GDHT348G突變體具有約22%的麥芽糖/葡萄糖交叉反應性，而s-GDHT348S突變體具有50%麥芽糖/葡萄糖交叉反應性(高純質粒分離試劑盒，RocheDiagnosticsGmbH,No.1754785),并使用ABIPrismDyeTerminatorS叫uencing試劑盒以及ABI3/73和3/77測序儀(AmershamPharmaciaBiotech)來測序。測序證實了對于兩個突變體已經獲得了DNA和氨基酸水平上的定點誘變。這導致了位置348從T分別變成G或變成S。在兩個基因上沒有發現其他突變。實施例5以T348G(突變體A)和T348S(突變體A，)為基礎通過飽和誘變獲得更多的s-GDH突變體。發明人從之前自己進行的研究中知道了候選的氨基酸位置。懷疑或已知這些候選氨基酸位置能影響s-GDH的相關特征，如熱穩定性、對葡萄糖的底物特異性或親和性，基于T348G(突變體A)或基于T348S(突變體A，)單獨分析這些特征。為了評價單個氨基酸置換中哪個分別對突變體T348G或T348S有作用，對于單個氨基酸位置進行了飽和誘變。使用QuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene,Cat200518)來依次分別置換野生型s-GDH-蛋白的位置87、110、122、124、145、146、169、171、187、246、294、298、300、313、323、333、339、341、349、378、428和436上的野生型氨基酸。選擇用于誘變的5，-和3，-引物是彼此互補的，并在重要位置中含有NNN(N=A、C、G或T)。三個隨機引入的核苷酸N，其在所需的位置并編碼所研究的氨基酸位置，這些N兩側每端為12至16個核普酸，其與模板的正義和反義DNA-鏈相同。替代野生型密碼子，因此引物含有的NNN寡核苷酸編碼每個可能的密碼子。對于所研究的每個位置，進行一個PCR反應。根據QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene,Cat.200518)提供的手冊進行PCR反應和Dpnl-限制內切酶消化。對于每個PCR反應，使用lpl用于XLlF-細胞的電穿孔。使細胞生長并如上所述的測定克隆的s-GDH活性。為了提高統計可能性，本發明中涵蓋所有20個可能的氨基酸置換，按照實施例3中所述的對每個位置的200個克隆進行篩選。根據實施例4中給出的方法對感興趣的克隆進行測序。表2:其他氨基酸置換對突變體A(=T348G)的基礎特征的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表3:其他氨基酸置換對突變體A，(=T348s)的基礎特征的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>從表2和3可以得到各自對突變體A或突變體A，的底物特異性、對葡萄糖的親和性和/或熱穩定性具有積極作用的氨基酸變換。實施例6具有提高的熱穩定性的突變體的鑒定已經將實驗擴展至對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有相當好的底物特異性的突變體，但是是以如太低的熱穩定性或太低的對葡萄糖的親和性這樣的缺陷為代價的。所謂的突變體6對麥芽糖具有非常有利的低交叉反應性，只是對葡萄糖測量的活性的約1.5%。突變體6的特征在于氨基酸置換Y171G、E245D、M341V和T348G,并且在位置428和429之間具有脯氨酸插入(ins429P)。使用以下引物來引入這些所需的氨基酸置換正義鏈5'-CCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG畫3'(SEQIDNO:8)反義鏈5'-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGG-3'(SEQID:NO:9)D87R:正義鏈5'-TTCCATCCTCGAGAGATTGTCAAT國3'(SEQIDNO:10)反義鏈5'-ATTGACAATCTCTCTGAGGATGGAA畫3'(SEQID:NO:N122K和S124K:正義鏈5'-CGTTATACCTATAAGAAAAAGACAGATACGCTCG-3'(SEQIDNO:12)反義鏈5'-CGAGCGTATCTGTCTTTTTCTTATAGGTATAACG-3'(SEQIDNO:13)S146G:正義鏈5-AAAAGACCATCAGGGTGGTCTCGAGAAG-3'(SEQIDNO:14)反義鏈5-CTTCTCGAGACCACCCTGATGGTCTTTT-3'(SEQID:NO:15)V298L:正義鏈5'-GCTCAAAATGGATTAAAAGTAGCCGCA國3'(SEQIDNO:16)反義鏈5'-TGCGGCTACTTTATTTCCATTTTGAGC-3'(SEQID:NO:17)L386F:正義鏈5'-CCGTATTAAGTTCGATCCAACTTATAGC-3'(SEQIDNO:18)反義鏈5'-GCTATAAGTTGGATCGAACTTAATACGG-3'(SEQID:NO:19)表4:對已經包括其他例如用于提高葡萄糖特異性的突變的s-GDH突變體的熱穩定性具有正面影響的突變<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>以上的結果顯示了氨基酸變換D87R、N122K、S124K、S146A或G,優選G,S146G、L187F或M;N267Y、V298L、T313D和L386F提高了基礎突變體6的熱穩定性。置換D87R;N122K;S124K;S146G;V298L和L386F對熱穩定性的提高具有非常強烈的作用。實施例7產生與麥芽糖相比對葡萄糖具有高底物特異性和對葡萄糖提高的親和性的突變體在WO02/34919中，已經鑒定了在s-GDH不同位置的七個氨基酸變換，并顯示出提高了對葡萄糖的底物特異性，與例如麥芽糖相比較。此外，氨基酸變換T348G與其他位置的氨基酸置換例如位置169、171、245、341和/或349的結合提高了底物特異性。選擇了七個對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有提高的特異性但對底物葡萄糖具有相當低的親和性的不同S-GDH突變體，進行嘗試來提高它們對葡萄糖的親和性。如從表2和3中概括的實驗中可知的，氨基酸置換L110H或Y;N229A、G或S;Q246H、M或N;Y333A;G339T;M341V;V349A或G和V436P顯示出能合適地提高s-GDH突變體對葡萄糖的親和性。使用突變體L110H、Q246H;G339T;M341V;V349G和V436P看到對親和性最強烈的作用。使用氨基酸變換A246H、M341V;V349G和V436P發現更強烈的親和性提高。接照實施例6中舉例il明的通過相同的策略將點突變引入現有的突變體中，因此在此只給出了用于置換Q246H的特異性引物。正義鏈5'-GGTAAATTATTGCAGTCTGATCATGGCCC誦3'(SEQIDNO:20)反義鏈5'-GGGCCATGATCAGACTGCAATAATTTACC誦3'(SEQID:NO:21)進行了如實施例3中所述的通過篩選Km-值測量來測定對葡萄糖的親和性。從不同底物濃度對酶活性的曲線計算明顯的Km-值。按照實施例8中所述的計算出比活性。已經將鑒定為適于提高底物特異性、親和性和/或穩定性的變換組合引入對葡萄糖(與麥芽糖相比較)具有顯著提高的特異性的突變體s-GDH中。表5:與麥芽糖相比對葡萄糖具有提高的底物特異性的s-GDH突變體中各種氨基酸置換的組合<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>可以清楚地看到對所有突變類型，附加的氨基酸變換Q246H產生了對葡萄糖提高的親和性并提高了比活性。突變體6與突變體13—樣在位置T348G、N122K、L169F、Y171G、E245D、M341V具有氨基酸變換和在位置429具有脯氨酸插入，以及另外的Q246H。突變體J與突變體G—樣在位置T348G、Y171G、E245D、M431V、N428P具有氨基酸變換，以及另外的Q246H。突變體22在位置T348G、N122K、S124K、L169F、Y171G、E245D、Q246H、M341V、L386F具有氨基酸變換和位置429的脯氨酸插入。突變體29具有突變體22的所有變換，除了T348G,其變換成T348S,并且導致速度的提高。通過另外變換G339T和V436P,突變體30和31對于葡萄糖獲得更高的Km-值。實施例8野生型或變體s-GDH的純化以及各自的酶活性和比活性的分析使包括合適的s-GDH表達載體的大腸桿菌生長(4x酵母-Amp.37°C),收集并重懸浮于pH7.0的磷酸鉀緩沖液中。通過FrenchPresspassage(700-900巴)進行細胞破裂。離心后，將上清液施加于用pH7.0的10mM磷酸鉀緩沖液平^f的S-Sepharose(AmershamPharmaciaBiotec)柱上。洗涂后，使用0-lMNaCl鹽梯度洗脫s-GDH。集合顯示出s-GDH活性的級分，對pH7.0的磷酸鉀緩沖液進行滲析并且在再次平衡的S-sepharose柱上再次進行色譜分離。集合活性級分并接受凝膠過濾，使用Superdex200柱(Amersham)。集合活性級分，并在加入CaCl2(3mM終濃度)后，存儲于-20。C。使用來自Pierce的蛋白質測試試劑no.23225進行蛋白測定(用BSA校準曲線，30mm,37°C)。為了測量酶活性，用0.0556mM吡咯并喹啉醌(PQQ);50mMHepes;15mMCaCl2pH7.0將s-GDH樣品稀釋至lmg蛋白/ml,并在25。C孵育30分鐘，用于重建或激活。激活后，用50mMHepes;15mMCaCl2pH7.0將樣品稀釋至大約0.02U/ml,并將50^1每個稀釋的樣品加入lOOO^il0.2M檸檬酸緩沖溶液中(pH5.8;25°C),該緩沖溶液含有0.315mg(4-(二曱基磷酰基甲基)-2-曱基-吡唑并-[1.5a]-咪唑-3-基)-(4-亞硝基苯基)-胺(參見，專利US5,484,708)/ml作為介質,和30mM糖。在25°C頭5分鐘的過程中監控620nm處的消光。一單位酶活性對應于上述條件下lmMol介質/min的轉化。計算體積活性(U/ml)=(總體積*(1￡/1^11[1;/1111]):(￡*樣品體積*1)(^消光系數；s620nn^30[l承mmol—"cm國1])。比活性(U/mg)=體積活性U/ml除以蛋白濃度mg/ml得到U/mg。分別使用葡萄糖和麥芽糖(Merck,德國)進行測試。已經將關于酶活性以及比活性的結果包括于之前實施例中給出的表中。權利要求1.與麥芽糖相比對葡萄糖具有提高的特異性的PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH；EC1.1.5.2)的突變體，其在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換蘇氨酸，其中所述突變體另外包括a)至少一個用于提高突變體穩定性的突變，b)至少一個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變，和任選c)一個或多個用于與麥芽糖相比進一步提高突變體對葡萄糖的特異性的突變，和其中這些位置對應于從醋酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQIDNO2)已知的氨基酸位置。2.根據權利要求1的s-GDH突變體，其中用于提高穩定性的所述突變是選自L110H、Q246H;G339T;M341V;V349G和V436P的氨基酸置換。3.根據權利要求1的s-GDH突變體，其中用于提高對葡萄糖的親和性的所述突變選自L110H或Y;N229A、G或S;Q246H、M或N;Y333A;G339T;M341V;V349A或G和V436P。4.根據權利要求1的s-GDH突變體，其中用于與麥芽糖相比提高突變體對葡萄糖的特異性的所述突變是選自Q145P;D163G或N;Q164F;L169F;Y171G;I208L或V;T224I;E245D;G276S;A294D或E;V300A、S、N、Y或I;T307G;T323V;A354Y、E或L;R378I、M、A或D;N428P的氨基酸置換和插入429P。5.根據權利要求2的s-GDH突變體，其中用于提高穩定性的所述突變選自D87R;N122K;S124K;S146G;V298L和L386F。6.根據權利要求3的s-GDH突變體，其中用于提高對葡萄糖的親和性的所述突變選自L110H、Q246H;G339T;M341V;V349G和V436P。7.根據權利要求4的s-GDH突變體，其中用于與麥芽糖相比提高突變體對葡萄糖的特異性的所述突變選自L169F;Y171G;E245D;N428P和插入429P。8.編碼根據權利要求1至7任一項的s-GDH突變體蛋白的分離多核香酸。9.表達載體，其包括權利要求8中限定的分離多核苷酸，該分離多核苷酸可操作連接能夠促進所述多核苷酸在宿主細胞中表達的啟動子序列。10.包括權利要求9的表達載體的宿主細胞。11.用于產生s-GDH突變體的方法，所述方法包括在適于酶突變體產生的條件下培養權利要求10的宿主細胞。12.表達載體，其包括權利要求ll中限定的分離多核苷酸，該分離多核苷酸可操作連接能夠促進其在無細胞肽合成系統中表達的啟動子序列。13.在適于產生所述酶突變體的條件下在無細胞肽合成系統中使用權利要求12的構建體產生s-GDH突變體的方法。14.使用根據權利要求1至7中任一項的s-GDH突變體檢測、測定或測量樣品中葡萄糖的方法，所述改進包括將樣品接觸所述突變體。15.權利要求14的方法，進一步的特征在于使用傳感器或試條裝置進行所述葡萄糖的檢測、測定或測量。16.用于檢測或測量樣品中葡萄糖的裝置，其包括根據權利要求l至7中任一項的s-GDH突變體和所述測量需要的其他試劑。全文摘要本發明公開了與麥芽糖相比對葡萄糖具有提高的特異性的PQQ依賴性可溶性葡萄糖脫氫酶(s-GDH；EC1.1.5.2)突變體，其在位置348具有由甘氨酸、丙氨酸或絲氨酸置換蘇氨酸，其中所述突變體另外包括至少一個用于提高突變體穩定性的突變，一個或多個用于提高突變體對葡萄糖的親和性的突變和/或一個或多個用于與麥芽糖相比進一步提高突變體對葡萄糖的特異性的突變，并且其中位置348對應于從醋酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)s-GDH野生型序列(SEQIDNO2)已知的氨基酸位置。還公開了編碼該突變體s-GDH的基因，以及這些s-GDH的不同應用，特別是用于測定樣品中的葡萄糖濃度。文檔編號C12N9/04GK101421396SQ200780013259公開日2009年4月29日申請日期2007年4月11日優先權日2006年4月13日發明者D·貝克,H·馮德埃爾茨,M·博尼茨-多萊特,P·克拉茨什,R·施穆克申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司