專利名稱：使用木糖利用發酵單胞菌屬的木糖醇合成突變體的乙醇生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物學和基因工程領域。更具體而言，發現使用木糖利用發酵單胞 菌屬(Zymomonas)菌株的乙醇生產由于木糖醇極大減少的生產而得到改善，所述菌株具有 葡萄糖_果糖氧化還原酶基因的遺傳修飾，所述木糖醇是在發酵期間合成的木糖代謝的有 害副產物。
背景技術：
經由微生物的乙醇生產提供了關于礦物燃料的代用能源且因此是本研究的重要 領域。運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)是在葡萄糖、果糖和蔗糖上生長的細菌產乙醇 生物(ethanologen)，經由Entner-Douderoff途徑將這些糖代謝成CO2和乙醇。盡管野生 型菌株不能使用木糖作為碳源，但已人工改造了能夠在這種糖上生長的運動發酵單胞菌的 重組菌株(US 5514583，US 5712133, WO 95/28476，Feldmann 等人(1992) Appl Microbiol Biotechnol 38 354-361，Zhang 等人(1995) Science 267 :240_243)。木糖是在水解的木素 纖維素材料中的主要戊糖，并且因此可以提供大量可用的、低成本碳底物用于在發酵中使 用。運動發酵單胞菌已人工改造用于表達木糖代謝所需的4種酶1)木糖異構酶，其催化 木糖至木酮糖的轉化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸；3)轉酮醇 酶；和 4)轉醛醇酶(US 5514583，US 6566107 ；Zhang 等人(1995) Science 267 :240_243)。 通過這4種酶和細胞的正常代謝機器的組合作用，將3個木糖分子轉化成2個葡萄糖6-磷 酸分子和1個甘油醛3-磷酸分子，其隨后在該途徑的葡萄糖側轉化成乙醇和C02(參見圖 1)。盡管在人工改造運動發酵單胞菌菌株用于木糖代謝中已取得成功，但該菌株不 如在葡萄糖上一樣好地在木糖上生長且生產乙醇。引起在木糖上差的生長的一個因素是 作為木糖代謝的副產物的木糖醇生產(Feldmarm等人同上；Kim等人(2000) Applied and EnvironmentalMicrobiology 66:186-193)。木糖醇通過木酮糖激酶進行磷酸化以生產木 糖醇5-磷酸，其在細胞中積聚且抑制細菌生長。木糖醇合成還減少乙醇的產量，因為運動 發酵單胞菌的木糖利用重組菌株不能將木糖醇轉化成乙醇。此外，木糖醇是木糖異構酶的 有力抑制劑(Smith等人(1991)BiOChem J. 277 :255_261)，其催化人工改造的木糖代謝途 徑中的木糖利用的第一個步驟。關于顯示木糖醇合成和作用的圖解參見圖2。負責體內木糖醇合成的生理學途徑和酶仍未被確定。然而，已證實當來自野 生型運動發酵單胞菌的無細胞提取物補充有NADPH時，它們能夠使木糖還原成木糖醇(Feldmann等人，同上)，并且這個反應由NADPH依賴性醛糖還原酶催化。還已顯示無NADPH 補充的，運動發酵單胞菌的無細胞提取物能夠將少量木糖轉化成木糖醇，并且當也向反應 混合物中添加純化的木糖異構酶時，在這些條件下的木糖醇生產增加3-4倍(Danielson， 2001，University of Colorado Masters Thesis)。因為木糖異構酶能夠將木糖轉化成木 酮糖，所以后一實驗的明確暗示是運動發酵單胞菌酶葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)可 以使用木糖作為電子供體和木酮糖作為電子受體以產生木糖醇，如在下文將更詳細地討論 的。因此，基于體外實驗在運動發酵單胞菌中存在關于木糖醇生產的至少2種途徑，但它們 在生理條件下有助于木糖醇形成的程度有待確定。對于高水平的乙醇生產，運動發酵單胞菌在高濃度的可發酵的碳源中生長，這可 以導致滲透壓休克。當野生型菌株被轉移至包含> 200g/L葡萄糖或果糖或> 360g/L蔗 糖的液體培養基時，滲透壓休克自身表現為在生長開始前的長滯后期(Loos等人(1994)J Bacteriol 176 =7688-7693)。此外，當野生型菌株被轉移至高濃度的這些糖時，向生長培養 基添加山梨糖醇縮短滯后期(Wiegert等人(1996) Arch Microbiol 166 :32-41，Loos等人 同上)。還已顯示，當野生型運動發酵單胞菌在葡萄糖和果糖的濃縮混合物(Loos等人同 上)中或者蔗糖的濃縮溶液(Wiegert等人同上，Loos等人同上)中生長時，周質酶葡萄 糖-果糖氧化還原酶(GFOR)在滲透平衡中起重要作用。簡言之，如圖解I中所示，GFOR與 其緊密結合的輔因子在經典乒乓Bi (Ping Pong Bi)機制中催化葡萄糖至葡糖酸內酯的氧 化和果糖至山梨糖醇的后續還原。在周質間隙中產生的山梨糖醇被逆著濃度梯度轉運到細 胞內，在其中它積聚至高水平，因為它不被進一步代謝。細胞內高濃度的山梨糖醇消除了跨 越質膜的滲透壓力差且恢復滲透平衡。不能產生山梨糖醇的野生型運動發酵單胞菌的自發突變體顯示，當它在低濃度的 蔗糖上生長時(< 150g/L)，生產比野生細胞更高水平的乙醇，但這種菌株不能在高濃度的 蔗糖上生長(Kirk 和 Doelle (199 Biotechnol. Letters 15:985-990)。這種突變體隨后 顯示缺乏葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的表達，這解釋了它不能將任何蔗糖衍生的果糖 轉化成不希望有的副產物山梨糖醇(Wiegert等人同上)。還已顯示山梨糖醇缺陷突變體在 高濃度的蔗糖中的生長可以通過向生長培養基添加山梨糖醇得到恢復(Wiegert等人，同 上)。因此當運動發酵單胞菌在葡萄糖和果糖的濃縮混合物中或者高濃度的蔗糖中生長時， GFOR通過合成山梨糖醇在滲透平衡中起關鍵作用，所述蔗糖通過宿主細胞的轉化酶水解成 葡萄糖和果糖。
葡萄糖 + GFOR-NADP+ -^==It 葡糖酸內酯 + GFOR-NADPH GFOR-NADPH + 果糖 ^~ 山梨糖醇 + GF0R-NADP+
I圖解ICN1600850(A)公開了具有滅活的GFOR基因的運動發酵單胞菌的非木糖利用突變 株，以及使用這種菌株的乙醇生產。當葡萄糖、果糖或蔗糖是碳源時，使用這種菌株的山梨 糖醇生產的缺乏導致更高水平的乙醇。
減少或消除運動發酵單胞菌的人工改造的木糖利用菌株中葡萄糖_果糖氧化還 原酶活性的作用未知，所述菌株在木糖和葡萄糖的混合物上生長(在不存在任何添加的蔗 糖或果糖的情況下)。待解決的問題是使用在包含木糖的培養基上生長的木糖利用運動發酵單胞菌菌 株如何在發酵中生產增加量的乙醇。申請人已通過下述解決了該問題，確定關于在體內木 糖醇生產的本質途徑且通過基因失活消除負責其形成的酶活性，從而生成了可以用于改善 的乙醇生產的運動發酵單胞菌菌株。發明概述本發明涉及使用發酵單胞菌屬菌株用于乙醇生產的方法，當在木糖的存在下生長 時，所述菌株具有減少的木糖醇生產和增加的乙醇生產。申請人已發現在木糖代謝運動發 酵單胞菌中的木糖醇生產主要由葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)介導。構建不表達GFOR 的遺傳修飾菌株(GF0R敲除突變體)，且發現其當在包含木糖的糖混合物上生長時生產減 少量的木糖醇。當在山梨糖醇的存在下在高糖混合物中生長時，GFOR敲除突變體還比表達 GFOR的親本菌株消耗更多的木糖且生產更高濃度的乙醇。此外，乙醇產量(消耗的每克糖 生產的乙醇量)對于GFOR敲除菌株明顯更高。因此，本發明提供了用于生產乙醇的方法，其包括，a)提供能夠利用木糖以生產乙醇的重組發酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含減少葡 萄糖_果糖氧化還原酶活性的至少一種遺傳修飾，和b)在包含木糖的培養基中培養(a)的菌株，由此將木糖轉變成乙醇。上述方法提供了相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發酵單胞菌屬菌株，木糖至 乙醇改善的轉化，所述遺傳修飾減少葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發酵單胞菌屬菌株，該方法具體改善木糖轉 化成乙醇的參數比率、滴度或產量中的一種或多種，所述遺傳修飾減少葡萄糖-果糖氧化 還原酶活性。在本發明的一個方面，與不含至少一種遺傳修飾的發酵單胞菌屬菌株相比較，本 文描述的方法在上文(a)的菌株生產減少量的木糖醇或無木糖醇方面改善，所述遺傳修飾 減少葡萄糖_果糖氧化還原酶活性。附圖簡述、生物保藏和序列描述根據形成本申請的部分的下列詳細描述、圖和伴隨的序列描述，可以更充分地理 解本發明。
圖1顯示已用于人工改造運動發酵單胞菌用于木糖利用的4種酶(有方框的)和 使用木糖用于乙醇生產的生物化學途徑的圖解。圖2顯示人工改造的木糖途徑的前2個步驟(有方框的)、木糖醇合成、木糖醇 5_磷酸形成(有毒的死端式中間物)和經由木糖醇抑制木糖異構酶的圖解。圖3顯示關于轉酮醇酶(A)、轉醛醇酶(B)、木糖異構酶(C)和木酮糖激酶 (xyulokinase) (D)的酶測定的策略。圖 4 顯示 pMODPgaptaltktCm 的質粒圖。
圖 5 顯示 pMODPgapxyIABCm 的質粒圖。 圖6顯示在用PgapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C和T5C系中木糖異構酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的圖表。圖7顯示在用I^gapxylAB轉化的T2C、T3C、T4C和T5C系中轉醛醇酶 (transaldolse) (TAL)和轉酮醇酶(TKT)活性的圖表。圖8顯示所選擇的適應的木糖利用菌株菌落的理論乙醇產量％和木糖利用％的 圖表。圖9顯示在含5%葡萄糖的RM(RMG)中生長50代前和后適應的木糖利用菌株在含 5%木糖的RM(豐富培養基)(RMX5% )上在70小時時的生長圖表。圖10顯示與對照8b相比較，關于所選擇的菌株ZW658在冊+10%葡萄糖 (RMG10% ) (A,B)和RM+8%木糖(RMX8% ) (C，D)中的生長、葡萄糖或木糖利用、以及乙醇和 木糖醇生產的圖表。圖11顯示與對照8b相比較，關于所選擇的菌株ZW658在不含乙酸鹽(A，B)或含 0.6%乙酸鹽(C，D)的RM+10%葡萄糖和8%木糖中的生長、葡萄糖和木糖利用、以及乙醇和 木糖醇生產的圖表。圖12顯示在用于GFOR基因的插入失活的自殺構建體的構建期間制備的質粒的圖 和最終產物GF0RSp-9ffff。圖13顯示用于構建木糖異構酶表達質粒pZB188/Kan-XylA制備的質粒的圖，和用 于這種構建體的大腸桿菌(E.coli)木糖異構酶表達盒(有方框的)的圖解。圖14顯示在木糖異構酶表達的存在和不存在下，通過含和不含GFOR基因失活的 Zffl菌株的木糖醇和木糖生產的圖表。圖15顯示在97g/L總木糖+葡萄糖上生長的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活的 木糖利用運動發酵單胞菌菌株的生長、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生產的圖表。圖16顯示在188g/L總木糖+葡萄糖上生長的，不含(A)和含(B)GFOR基因失活 的木糖利用運動發酵單胞菌菌株的生長、葡萄糖和木糖利用以及乙醇生產的圖表。圖17顯示在不同濃度的山梨糖醇的存在下，含GFOR基因失活的木糖利用運動發 酵單胞菌菌株的生長圖表。圖18顯示在174g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下， 不含(A，C)和含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運動發酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生 產和木糖醇生產的圖表。圖19顯示在203g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下， 不含(A，C)和含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運動發酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生 產和木糖醇生產的圖表。圖20顯示在含另外的碳酸氫鉀(bicarbarbonate potassium)用于增加的緩沖能 力的203g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的不存在(A，B)和存在(C，D)下，不含(A，C)和 含(B，D) GFOR基因失活的木糖利用運動發酵單胞菌菌株的木糖利用、乙醇生產和木糖醇生 產的圖表。圖21顯示在pH受控的發酵運行中在189g/L總木糖+葡萄糖中在乙酸鹽的存在 下，含GFOR基因失活的木糖利用運動發酵單胞菌菌株的木糖和葡萄糖利用、乙醇生產和木 糖醇生產的圖表。圖22顯示可以在運動發酵單胞菌中復制的Cre表達載體，p^l88/Kan和pZB188/kan-Cre的質粒圖。圖23A顯示ZW801-4和ZW800在含乙酸鹽的高葡萄糖+木糖中在pH受控條件下 的生長的比較。圖23B顯示與ZW800相比較，關于ZW801-4的葡萄糖和木糖利用以及乙醇 生產的圖表。圖24顯示在ZW801-4中翻譯的突變序列與野生型GFOR蛋白質的比對。根據構成本申請的部分的下列詳細描述和伴隨的序列描述，可以更充分地理解本 發明。下述序列符合 37 C. F. R. 1. 821-1. 825 ("Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，且與 EPO 和 PCT 的世界知識產權組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO)標準 ST. 25 (1998)和序列表要求一致(Administrative Instructions的規則5. 2和49. 5(a_bis)以及部分208和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸 序列數據的符號和形式遵守37 C. F. R. § 1. 822中描述的規則。序列表在光盤上并此提供。包含序列表的光盤的內容遵照37 CFR1. 52(e)在此引 入作為參考。光盤一式兩份提交且彼此相同。盤標記為“Copy I-Sequence Listing”和 "Copy 2 Sequence listing，，。盤包含下述文件CL3662 seq list. ST25。SEQ ID NOs :1和2是用于擴增包含來自pZB4的甘油醛3_磷酸脫氫酶基因啟動 子(Pgap)的DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 3和4是用于擴增包含來自pZB4的tal編碼區的DNA片段的引物的 核苷酸序列。SEQ ID NOs 5和6是用于擴增包含來自Pgap和tal片段的Pgaptal的DNA片段的 引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 7和8是用于擴增包含來自pZB186的IoxP: :Cm的DNA片段的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO 9是關于pM0DPgaptaltktCm質粒的全核苷酸序列。SEQ ID NOs 10和11是用于擴增在接受pM0DPgaptaltktCm的轉化體中包含tal和 tkt編碼區的3kb DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 12是關于pM0DPgapxyIABCm質粒的全核苷酸序列。SEQ ID NOs 13 和 14 是用于擴增來自含 pM0DPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C 整合體的1.6kb PgapxylA DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 15 和 16 是用于擴增來自含 pM0DPgapxyIABCm 的 T2C、T3C、T4C 和 T5C 整合體的1.3kb xylB DNA片段的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 17和18是用于擴增來自運動發酵單胞菌Wl基因組DNA的2268bp DNA frag的引物的核苷酸序列，所述DNA frag包含pgm基因的3'末端的部分、Idh基因 和adhl基因的5'末端的部分。SEQ ID NOs 19和20是用于擴增來自pACYC184的四環素抗性盒的引物的核苷酸 序列。SEQ ID NOs 21和22是用于生成IoxP位點的寡核苷酸序列。SEQ ID NOs 23和24是用于生成IoxP位點的寡核苷酸序列。
SEQ ID NOs :25和沈是用于擴增來自pHP15578的Speclr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NOs 27和28是用于擴增來自ZWl基因組DNA的3，GFOR側翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NOs 29和30是用于擴增來自ZWl基因組DNA的5，GFOR側翼DNA的引物 的核苷酸序列。SEQ ID NO :31 是 pGF0RSp-9ffff 質粒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 32和33是用于擴增來自pET-24a的Kanr盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 34是衍生自pZB4的大腸桿菌xylA表達盒的核苷酸序列。SEQ ID NOs 35和36是用于擴增Cre表達盒的引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 37是ZW801-4中破壞的GFOR編碼區的全核苷酸序列(從原始起始密 碼子到原始終止密碼子)，SEQ ID NO :38是野生型GFOR編碼區的全核苷酸序列(從原始起 始密碼子到原始終止密碼子)。申請人:根據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicro-organisms for the Purposes of Patent Procedure)的條款在美國典型培養物保藏中心(ATCC) 10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209 進行下述生物保藏
保藏者認別參考符號國際保藏名稱_保藏曰期
ZW658ATCC # PTA-7858 2006 年 9 月 12 日詳述本發明描述了使用具有減少的GFOR酶活性的經遺傳修飾的木糖利用發酵單胞菌 屬菌株用于從發酵生產乙醇的方法。該方法中使用的木糖利用重組發酵單胞菌屬被用葡萄 糖-果糖氧化還原酶(GFOR)基因中的至少一種修飾進一步人工改造，從而使得活性酶的表 達得到減少或消除。申請人顯示GFOR酶活性的消除導致在木糖代謝期間減少的木糖醇生 產和增強的乙醇生產。由新發酵單胞菌屬菌株產生的乙醇可以用作關于礦物燃料的代用能 源。下述縮寫和定義將用于解釋說明書和權利要求書。“葡萄糖-果糖氧化還原酶”被縮寫為GF0R。RM是豐富培養基。RMG5 % 是 RM+5 % 葡萄糖。RMG10% 是 RM+10% 葡萄糖。RMX8 % 是 RM+8 % 木糖。RMX2 % 是 RM+2 % 木糖。RMX5 % 是 RM+5 % 木糖。RMGX10% 8%是 RM+10%葡萄糖和 8%木糖。RMGX5% 8%是冊+5%葡萄糖和8%木糖。“基因”指表達特定蛋白質的核酸片段，包括在編碼序列前(5'非編碼序列)和 后(3'非編碼序列)的調節序列。“天然基因”或“野生型基因”指如在自然界中與其自身的調節序列一起發現的基因。“嵌合基因”指并非天然基因的任何基因，包含在自然界中未 一起發現的調節和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含衍生自不同來源的調節序列和編碼 序列，或衍生自相同來源但以不同于自然界中發現的那種的方式排列的調節序列和編碼序 列。“內源基因”指在生物的基因組中處于其天然位置中的天然基因。“外來”基因指在宿 主生物中通常未發現但通過基因轉移引入宿主生物內的基因。外來基因可以包含插入非天 然生物內的天然基因或嵌合基因。術語“遺傳構建體”指編碼用于表達一種或多種特定蛋白質的核酸片段。在基因 構建體中，基因在性質中可以是天然的、嵌合的或外來的。一般地遺傳構建體將包含“編碼 序列”。“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“啟動子”或“起始控制區”指能夠控制編碼序列或功能RNA表達的DNA序列。一 般而言，編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子可以整體衍生自天然基因，或由衍生自在 自然界中發現的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA區段。本領域技術人員 理解不同啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段、或響應不同 環境條件的表達。引起基因在大多數細胞類型中在大多數時間表達的啟動子通常稱為“組 成型啟動子”。如本文所使用的，術語“表達”指衍生自基因的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和 穩定積聚。表達還可以指mRNA翻譯成多肽。“反義抑制”指能夠抑制靶蛋白的表達的反義 RNA轉錄物的生產。“超表達”指在轉基因生物中超過正常或非轉化生物的生產水平的基因 產物的生產。“共抑制”指能夠抑制相同或基本上相似的外來或內源基因表達的有義RNA轉 錄物的生產(U. S. 5，231，020)。如本文所使用的，術語“信使RNA (mRNA) ”指不含內含子且能夠由細胞翻譯成蛋白 質的RNA。如本文所使用的，術語“非功能性基因”指不像在其中基因是內源的野生型菌株一 樣正常表達所編碼的蛋白質的基因。非功能性基因的表達可以在任何水平上進行破壞，例 如轉錄、RNA加工或翻譯。非功能性基因通常具有所編碼的蛋白質的很少表達或無表達。然 而，它還可以編碼具有比野生型蛋白質低的酶活性的經修飾的蛋白質。如本文所使用的，術語“轉化”指核酸片段轉移到宿主生物內，從而導致遺傳上穩 定的遺傳。經轉移的核酸可以是維持在宿主細胞中的質粒的形式，或一些經轉移的核酸可 以整合到宿主細胞的基因組內。包含經轉化的核酸片段的宿主生物被稱為“轉基因”或“重 組”或“經轉化的”生物。如本文所使用的，術語“質粒”和“載體”指通常攜帶基因的染色體外元件，所述基 因并非細胞的中心代謝的部分，且通常為環狀雙鏈DNA分子的形式。此種元件可以是自主 復制序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環狀，單鏈或雙鏈DNA或RNA，衍 生自任何來源，其中許多核苷酸序列已連接或重組成獨特的構建體，其能夠將關于所選擇 的基因產物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3'非翻譯序列引入細胞內。術語“可操作地連接”指核酸序列在單個核酸片段上的結合，從而使得一種的功能 受另一種的影響。例如，當啟動子序列能夠影響編碼序列的表達時(即，編碼序列在啟動子 的轉錄控制下)，所述啟動子與那種編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義方 向與調節序列可操作地連接。
術語“選擇標記”意指鑒定因子，通常是抗生素或化學抗性基因，其能夠基于標記 基因的作用進行選擇，即對于抗生素的抗性，其中所述作用用于追蹤目的核酸的遺傳和/ 或鑒定已遺傳目的核酸的細胞或生物。術語“基本上消除的”木糖醇生產和“基本上無”副產物木糖醇指其中使用一般的 實驗室分析檢測出的木糖醇的量接近于零的情況。術語“高濃度的混合糖”指培養基中導致抑制GFOR突變木糖利用運動發酵單胞菌 的生長的總糖濃度。這一般超過約100g/L，盡管確切濃度可能依賴于培養基中的其他組分 而變。術語“可發酵糖”指在發酵過程中可以由微生物用作碳源的寡糖和單糖。術語“木素纖維素的”指包含木素和纖維素的組合物。木素纖維素材料還可以包 含半纖維素。術語“纖維素的”指包含纖維素和另外組分包括半纖維素的組合物。術語“糖化作用，，指來自多糖的可發酵糖的生產。術語“預處理的生物質”意指在糖化作用前已實施預處理的生物質。“生物質”指任何纖維素或木素纖維素材料且包括這樣的材料，其包含纖維素且任 選進一步包含半纖維素、木素、淀粉、寡糖和/或單糖。生物質還可以包含另外組分，例如 蛋白質和/或脂質。生物質可以衍生自單一來源，或生物質可以包含衍生自超過一種來源 的混合物；例如，生物質可以包含玉米穗軸和玉米秸稈的混合物，或草和葉的混合物。生物 質包括但不限于生物能農作物、農業廢物、城市固體廢物、工業固體廢物、來自紙制造的淤 渣、院子廢物、木材和林業廢物。生物質的例子包括但不限于玉米粒，玉米穗軸，農作物殘渣 例如玉米殼，玉米秸稈，草，小麥，小麥秸稈，大麥，大麥秸稈，干草，稻草，柳枝稷，廢紙，甘蔗 渣，高粱，大豆，得自谷粒、樹、枝、根、葉、木片、鋸屑、灌木和矮樹叢的碾磨的組分，蔬菜，水 果，花和牲畜糞。“生物質水解產物”指起因于生物質的糖化作用的產物。生物質還可以在糖化作用 前進行預處理。本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的且由下述參 考文獻進行描述Sambrook, J.，Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual，第 2 片反；Cold Spring HarborLaboratory :Cold Spring Harbor， New York，1989(下文為 “Maniatis”)；以及 Silhavy，T. J.，Bennan，M. L 和 Enquist， L. W. Experiments with GeneFusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor，New York，1984 ；禾口 Ausubel，F. Μ.等人，In Current Protocols in Molecular Biology，由 Greene Publishing and Wiley-Interscience，1987 出片反。本發明涉及使用木糖利用發酵單胞菌屬的GFOR突變體用于從包含木糖的培養基 生產乙醇的方法。具有減少的GFOR酶活性的木糖利用發酵單胞菌屬的人工改造菌株具有 增強的乙醇生產。關于經由木糖利用運動發酵單胞菌改善乙醇生產的挑戰是減少或消除 木糖醇的合成，其(a)代表無價值添加的碳槽(sink) ； (b)抑制木糖利用的第一個步驟；和 (c)磷酸化為抑制細菌生長的有毒的死端式中間物。申請人已發現內源酶GFOR主要負責體 內木糖醇合成，并且通過減少或消除GFOR酶活性，改善來自木糖的乙醇生產(比率、產量和 滴度)。
木糖利用發酵單胞菌屬宿主菌株能夠利用木糖作為碳源的發酵單胞菌屬的任何菌株都可以用作用于制備在本方 法中使用的菌株的宿主。已人工改造用于木糖發酵成乙醇的運動發酵單胞菌的菌株是特別 有用的。內源基因可以提供代謝途徑的部分，或可以通過任何已知的基因操作技術加以改 變，以提供具有對于木糖代謝有用的酶活性的蛋白質。例如，內源轉酮醇酶可以補充在生 成木糖利用途徑中其他引入的酶活性。一般地4種基因已引入運動發酵單胞菌內用于表 達涉及木糖代謝的4種酶(圖1)，如US 5514583中描述的，所述專利在本文中引入作為參 考。這些包括編碼木糖異構酶(其催化木糖至木酮糖的轉化)和木酮糖激酶(其使木酮 糖磷酸化以形成木酮糖5-磷酸)的基因。此外，轉酮醇酶和轉醛醇酶，戊糖磷酸途徑的2 種酶，將木酮糖5-磷酸轉化成中間物，所述中間物使戊糖代謝與糖酵解Entner-Douderoff 途徑偶聯，從而允許木糖至乙醇的代謝。編碼這些酶的DNA序列可以得自能夠代謝木糖 的眾多微生物中的任何一種，例如腸細菌，以及一些酵母和真菌。關于編碼區的來源包括 黃單胞菌屬(Xanthomonas)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、埃希氏菌屬(Escherichia)^l 細菌屬(Rhodobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter) >^fHff lif 屬(Gluconobacter) > IH^g ^M (Rhizobium)、木干胃M (Agrobacterium) > fp Π K^M (Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonads)和發酵單胞菌屬(Zymomonas)。特別有用的是 大腸桿菌的編碼區。編碼DNA序列與在運動發酵單胞菌細胞中表達的啟動子可操作地連接，所述啟動 子例如運動發酵單胞菌甘油醛3-磷酸脫氫酶的啟動子(GAP啟動子)，和運動發酵單胞菌烯 醇化酶的啟動子(ENO啟動子)。編碼區可以單獨由啟動子進行表達，或者2個或更多編碼 區可以在操縱子中進行連接由相同啟動子表達。所得到的嵌合基因可以引入發酵單胞菌屬 內且在質粒上維持，或使用例如同源重組、位點定向整合或隨機整合而整合到基因組內。特 別有用的木糖利用菌株包括 CP4 (pZB5) (US5514583)，ATCC31821/pZB5 (US 6566107)，8b (US 20030162271 ；Mohagheghi 等人，(2004) Biotechnol. Lett. 25 ；321-325)和 ZW658 (本文描 述的；保藏的，ATTCC#PTA-7858)。另外人工改造以利用并非其天然使用的除木糖外的糖的發酵單胞菌屬菌株可以 在本方法中使用。例子是如US 5843760中描述的經人工改造用于阿拉伯糖利用的運動發 酵單胞菌的菌株，所述專利引入本文作為參考。經由GFOR的木糖醇合成的發現經由運動發酵單胞菌的木糖利用菌株的不希望有的副產物木糖醇的合成減少了 乙醇的產量，且導致木糖醇5-磷酸的形成，所述木糖醇5-磷酸是抑制細菌生長的有毒的化 合物(參見圖2)。此外，木糖醇是木糖異構酶的有力抑制劑，所述木糖異構酶是用于木糖利 用的人工改造途徑中的第一種酶，并且所述木糖醇的合成減少了細胞代謝木糖的能力。盡 管體外實驗已確定存在關于運動發酵單胞菌中的木糖醇形成的至少2種途徑(Feldmarm等 人同上，Danielson等人同上)，但申請人已發現生理學產生的大多數木糖醇是GFOR酶活 性的結果。申請人已發現由在包含木糖的培養基上生長的利用木糖的運動發酵單胞菌菌株 (或野生型運動發酵單胞菌的木酮糖合成衍生物)合成的木糖醇的量在不存在GFOR酶活性 的情況下極大地減少。申請人還發現木糖至木酮糖的轉化是關于體內GFOR介導的木糖醇 生產的必要條件，并且這種反應僅可在表達木糖異構酶的運動發酵單胞菌菌株中發生。因此提出經人工改造以在木糖上生長的運動發酵單胞菌菌株中木糖醇的主要生理學來源經 由反應之一或兩者由GFOR合成，所述反應在圖解II和III中描述。
權利要求
1.一種用于生產乙醇的方法，其包括，a)提供能夠利用木糖以生產乙醇的重組發酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含減少葡萄 糖-果糖氧化還原酶活性的至少一種遺傳修飾，和b)在包含木糖的培養基中培養(a)的菌株，由此將所述木糖轉化成乙醇。
2.根據權利要求1的方法，其中相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發酵單胞菌屬菌 株，所述(a)的菌株改善木糖至乙醇的轉化，所述遺傳修飾減少葡萄糖-果糖氧化還原酶活 性。
3.權利要求2的方法，其中相對于不含至少一種遺傳修飾的重組發酵單胞菌屬菌株， 所述(a)的菌株改善木糖轉化成乙醇的比率、滴度或產量中的一種或多種，所述遺傳修飾 減少葡萄糖-果糖氧化還原酶活性。
4.根據權利要求1的方法，其中與不含至少一種遺傳修飾的發酵單胞菌屬菌株相比 較，當將木糖代謝成乙醇時，所述(a)的菌株生產減少量的木糖醇，所述遺傳修飾減少葡萄 糖-果糖氧化還原酶活性。
5.根據權利要求4的方法，其中當將木糖代謝成乙醇時，所述(a)的菌株基本上不生產 木糖醇。
6.根據權利要求1的方法，其中所述(a)的重組發酵單胞菌屬菌株選自ZW800、 ZW801-4 和 ZW801-6。
7.權利要求1的方法，其中所述培養基包含糖的混合物和糖醇，所述糖包括木糖，所述 糖醇選自山梨糖醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇及其混合物，其中所述糖的混合物的濃度 是至少約120g/L，并且其中所述糖醇的終濃度是約2mM-約100mM。
8.權利要求7的方法，其中所述糖醇的濃度是約5mM-約20mM。
全文摘要
本發現使用具有葡萄糖-果糖氧化還原酶基因的遺傳修飾的木糖利用發酵單胞菌屬菌株的乙醇生產由于極大減少的木糖醇生產而得到改善，所述木糖醇是在發酵期間合成的木糖代謝的有害副產物。
文檔編號C12N1/22GK102124117SQ200780035804
公開日2011年7月13日 申請日期2007年9月28日 優先權日2006年9月28日
發明者C·M·麥卡欽, M·安普塔奇, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·-C·仇 申請人:可持續能源聯盟有限責任公司, 納幕爾杜邦公司