專利名稱：一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子sptl5-10 及其編碼基因與應用。
技術背景木質纖維素是世界上最為豐富的生物質資源，量最大、價最廉，每年的總產量約占 所有生物質資源的50%，目前大多數此類的物質沒有得到很好的利用。利用木質纖維素 為主的可再生生物質資源，生產可再生能源具有重要的經濟與社會意義。以生物質為原 料制取的工業乙醇，作為一種清潔的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趨勢。 傳統的生物乙醇生產主要以糧食發酵為主，世界糧食緊缺現象嚴重限制了原料來源，原 料成本居高不下，低成本的新原料路線是降低生物乙醇生產成本的關鍵。在傳統的生物 乙醇生產中，以葡萄糖為主的六碳糖易于被微生物發酵生成乙醇，然而占總糖量約40% 的木糖卻不易于被其利用。充分利用木質纖維素生產乙醇原料中的木糖發酵生產乙醇， 能使乙醇的產量在原有基礎上增加25%。木糖的有效利用是提高乙醇經濟指標的重要內 容，是生物質資源成功工業化轉化的關鍵因素。釀酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，細胞壁厚、固醇含量高，對乙醇及木質纖 維素水解物中毒性因子的耐受性較高；能在低pH、嚴格厭氧條件下快速發酵葡萄糖生 產乙醇，副產物少；不易被細菌和病毒污染，且相關工業技術成熟， 一直是乙醇發酵的 研究重點和首選目標微生物。但缺乏有效利用木糖的能力。以木質纖維素為原料生產乙 醇，其關鍵之一就是產生乙醇的微生物能有效利用各種糖作為碳源。在國外，早在上世 紀八十年代初期，國際上許多實驗室就已經開始從事其高效生產乙醇的研究。但是天然 的釀酒酵母菌只能非常緩慢的代謝木糖，卻不能有效發酵木糖。由于天然微生物的木糖 發酵性能難以達到工業生產的要求，所以人們利用傳統的菌種篩選方法通常經過大量的 微生物培養、酶活測定及菌種馴化培養來選育所需菌種，由于工作量大、耗時長、效率 低，近年來已轉向利用代謝工程原理，通過分子遺傳改造相關代謝途徑來獲得能在厭氧 條件下高效代謝發酵葡萄糖、木糖及其他各種戊糖的工程菌。但以前的研究大部分沒有 得到十分理想的目標表型。我們認為這些單基因或幾個基因的改造，某種的基因缺失或 者擴增，只是改變了細胞的局部元件，或是重新設計調節了細胞網絡代謝產物的平衡系 統，并沒有解決木糖代謝途徑中的復雜問題。基因表達調控是也成為生物學目前應用手段熱點。全局轉錄機制調控工程(globe transcriptional mechanism engineering, gTME)是用分子生物學方法，如易錯PCR、 DNA改組等方法，建立通用轉錄因子的突變庫，針對目的產品或目標表型，通過定向篩選， 獲得目的代謝流增強或特定表型增強的菌種，是按人們的設計獲得目標表型的一種方 法。
釀酒酵母具有木糖代謝的完整途徑，但是卻不能有效的發酵木糖產乙醇。我們解決 這些問題模擬微生物適應外界環境的改變，在酵母菌木糖代謝途徑的基因組層面上定向 進化或同時改變多個相關基因群，使細胞在整體水平上適應木糖的代謝或利用，我們利 用gTME技術通過基因工程方法改造全局轉錄調控因子使整個轉錄調控過程發生變化 從而改變或提高基因組的轉錄及表達。從而獲得了能夠高效利用木糖并能夠同時轉運木 糖和葡萄糖產乙醇的釀酒酵母。全局轉錄調控工程(gTME)是一種基因轉錄重排來優化細胞表型的主要技術。正 是通過基因工程方法改造全局轉錄調控因子SPT15，利用易錯PCR技術構建該因子突變 庫，實現多基因的同時改變來調節整個的代謝網絡。現在應用于提—高釀酒酵母的乙醇耐 受性和產量。基因表達過程是從DNA—mRNA—蛋白質。基因表達調控可以發生在遺傳 信息傳遞過程的各個水平上。已證明轉錄水平調控是基因表達調控中效率最高的一個環 節。轉錄是由RNA聚合酶執行的，在原核細胞中只有一種RNA聚合酶，在真核生物有三 種RNA聚合酶，其中RNA聚合酶II負責轉錄產生大部分功能基因(圖l)的mRNA， RNA 聚合酶II轉錄效率是由轉錄起始因子和啟動子結合能力決定的(圖2)。釀酒酵母中轉錄 起始因子之一的SPT15，是一種TATA結合蛋白，參與轉錄起始復合物的形成，控制基因 表達效率。它與相關基因啟動子區域TATA結合能力的改變，影響相關基因表達效率， 將引起菌種的表型變化，所以用分子生物學方法建立SPT15基因突變菌種庫，在突變庫 中含有眾多菌種表型，通過定向篩選SPT15基因突變菌種庫，可獲得具有目標表型的釀 酒酵母菌種。本課題組在2007年成功地建立了該項技術，構建釀酒酵母轉錄因子spt15 突變庫，經篩選，獲得了共發酵戊糖和己糖的釀酒酵母菌，得到了重組菌中sptl5的突變 序列。為進一步改造菌種有效利用纖維素水解液發酵高產乙醇研究奠定了基礎。
利用全局調控技術對釀酒酵母菌進行轉錄機制工程改造，獲得提高木糖利用后的突 變sptl5基因。并配合目標菌株具體分析，深入研究利用木糖的代謝調控網絡及機制， 找出全局調控對釀酒酵母木糖代謝的影響，希望通過全局調控的手段優化釀酒酵母木糖 代謝網絡，以實現最大效率的木糖利用，并為釀酒酵母高效利用木糖產乙醇奠定基礎。 從根本上降低生物乙醇的原料成本，這將對基因工程和代謝工程技術理論的發展帶來重 大的革新，實現重組菌株的工業應用也將有著不可估量的巨大推動作用和更廣闊的應用 前景
發明內容
本發明的目的是提供一種突變型的釀酒酵母起始轉錄因子^,"-70及其基因序列。該 突變的基因的重組菌株能夠利用木糖，并提高木糖利用率和木糖葡萄糖共利用率。 本發明的另一目的是提供上述釀酒酵母轉錄因子在發酵木糖生產乙醇中的應用。 本發明的目的可以通過下列技術方案來實現一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子sptl5-10，其氨基酸序列為SEQIDNO: 2所示。 該序列表示原釀酒酵母^〃5氨基酸序列(即Sflcc/zmw^c^ ce v/Wae YPH499 s/ "5基 因所表達的氨基酸序列)的224位的蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代。一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。 該序列與原釀酒酵母Sacc/ aTOmyces ce"vWae YPH499 ^ 〃5的核苷酸序列相比，第224 位由c突變為t，第465位的由c突變為t,且末尾缺了15個堿基。含權利要求2所述的基因的表達載體。常用載體如質粒、噬菌體等。其中，所述表 達載體優選重組質粒pYX212-SPT15 。一種宿主細胞，含有權利要求3所述的表達載體。宿主可選用細菌(如大腸桿菌) 或釀酒酵母菌。其中，所述宿主細胞優選含有重組質粒pYX212-SPT15的釀酒酵母菌。上述突變的釀酒酵母起始轉錄因子在木糖發酵生產乙醇中的應用。有益效果本發明提供的突變釀酒酵母起始轉錄因子轉化入酵母菌中可以 提高酵母的木糖利用和葡萄糖、木糖共利用的效率。本發明還提供了該突變型釀酒酵母 起始轉錄因子^^5-M基因序列，這些序列可用于構建利用木糖的重組載體。本發明所 提供的突變釀酒酵母起始轉錄因子^^5-70轉化入酵母菌可用于酵母利用木糖產乙醇的 生產。
圖1為陽性克隆酶PCR電泳圖。圖2為sptl5-10轉化釀酒酵母在木糖培養基上生長情況(5%木糖)。圖3為sptl5-10轉化釀酒酵母對木糖和葡萄糖的共利用曲線圖，其中1為2.5%(混合糖中的木糖)；2為5% (混合糖中的木糖)；3為7.5% (混合糖中的木糖)；4為2.5% (混合糖中的葡萄糖)；5為5% (混合糖中的葡萄糖)；6為7.5% (混合糖中的葡萄糖)。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述，但不限制本發明。 實施例1: Sacc/^ra附ycM cewv/w'ae YPH499-3突變sptl5基因重組質粒的構建、篩選與 鑒定。釀酒酵母(Sacc/wow^cMcerev/^fe YPH499-3)為本實驗室獲得，目前該釀酒酵母 保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，登記入冊的 編號是CGMCCNo.2255，保藏日期是2007年11月13日。為亮氨酸、組氨酸、尿嘧 啶缺陷型。載體pYX212受贈于江南大學。酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖50g/L，將pH調至7.0，高壓蒸氣滅菌121'C， 15min。將S. cem^!'ae YPH499-3接種于上述培養基中，置30。C搖床，200rpm,培養12-16 小時。8000卬m,離心15min，收集菌體。運用基因組提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，提取S. cerew^"e YPH499-3 基因組。以S. cewv/w'ae YPH499-3總DNA為模板，使用如下PCR引物(上海博亞公 司合成)引物SPT15_Sense:TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG (SEQ ID No.2)和SPT15—Anti:CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGC ACA(SEQIDNo.3)。PCR擴增釀酒酵母起始轉錄因子。PCR循環參數為94°C， 5min ; 94°C， lmin; 56°C， lmin; 72°C， 2min，共進行35個循環。用DNA回收試劑盒(Takara公司)對擴增出的基因進行回收純化。回收后突變基 因sptl5及PMD18-T (Takara公司)載體連接，運用常規基因工程技術將連接液轉化到 大腸桿菌DH5a感受態細胞，提取質粒。運用Sail和BamHI雙酶切鑒定突變基因^"5 確定連接到表達載體pMD18-T上。經鑒定過的重組質粒為pMD18-SPT15。金思特測序 得到突變的sptl5-10基因。實施例2:突變的sptl5基因轉化入釀酒酵母的驗證引物同上，以實施例1中的pMD18-SPT15質粒為模板進行PCR，將氨基酸殘基 Thr224突變為Asn224。制備pYX212-T載體，與sptl5-10連接利用醋酸鋰法轉化入釀 酒酵母。運用常規基因工程技術對轉化后的感受態細胞YPX培養基進行培養，得到含 有突變基因的重組釀酒酵母。得到的重組酵母菌株可以在YPX上很好的生長，而對照菌株不能生長。實施例3:帶有sptl5-10的重組釀酒酵母木糖利用種子培養基酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去離子水定容至1L。 發酵培養基酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去離子水定容至1L。 從新鮮斜面上接一環由實施例2得到的重組釀酒酵母接入裝有種子培養基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床(太倉市實驗設備廠)中培養24h后，以1%接種量(v/v) 接入裝有發酵培養基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床中培養，發酵72h，所得木 糖的利用率為91%，葡萄糖的利用率為85%，乙醇產率為10%。實施例4:帶有sptl5-10的釀酒酵母對木糖和葡萄糖的共利用種子培養基酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，去離子水定容至1L。 發酵培養基酵母粉10g，蛋白胨20g，木糖25g，葡萄糖25g，去離子水定容至1L。 從新鮮斜面上接一環由實施例1得到的釀酒酵母YPH499-3， CGMCCNo.2255接入裝有 種子培養基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床(太倉市實驗設備廠)中培養24h后， 以1%接種量(v/v)接入裝有發酵培養基的錐形瓶中，在30。C， 200rpm的搖床中培養， 發酵72h，所得木糖的利用率為91%，葡萄糖的利用率為85%，乙醇產率為10%。序列表<110>南京工業大學<120> —種突變的釀酒酵母起始轉錄因子及其編碼基因與應用<130> nju扁423<160> 2< 170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 708<212> DNA<213>釀酒酵母(S.cerevisiaeYPH499-3)<220><221> CDS <222> (1)..(708)<400> 1atg gcc gat gag gaa cgt tta aag gag ttt aaa gag gca aac aag ata 48 Met Ala Asp Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Lys Glu Ala Asn Lys lie 15 10 15gtg ttt gat cca aat acc aga caa gta tgg gaa aac cag aat cga gat % Val Phe Asp Pro Asn Thr Arg Gin Val Trp Glu Asn Gin Asn Arg Asp 20 25 30ggt aca aaa cca gca act act ttc cag agt gaa gag gac ata aaa aga 144 Gly Thr Lys Pro Ala Thr Thr Phe Gin Ser Glu Glu Asp lie Lys Arg 35 40 45get gcc cca gaa tct gaa aaa gac acc tec gcc aca tea ggt att gtt 192 Ala Ala Pro Glu Ser Glu Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ser Gly lie Val 50 55 60cca aca eta caa aac att gtg gca act gtg att ttg ggg tgc agg tta 240 Pro Thr Leu Gin Asn lie Val Ala Thr Val lie Leu Gly Cys Arg Leu 65 70 75 80<image>image see original document page 9</image><212> PRT<213>釀酒酵母(S.cerevisiaeYPH499-3) <400> 2Met Ala Asp Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Lys Glu Ala Asn Lys lie 15 10 15Val Phe Asp Pro Asn Thr Arg Gin Val Trp Glu Asn Gin Asn Arg Asp 20 25 30Gly Thr Lys Pro Ala Thr Thr Phe Gin Ser Glu Glu Asp lie Lys Arg 35 40 45Ala Ala Pro Glu Ser Glu Lys Asp Thr Ser Ala Thr Ser Gly lie Val 50 55 60Pro Thr Leu Gin Asn lie Val Ala Thr Val lie Leu Gly Cys Arg Uu 65 70 75 80Asp Leu Lys Thr Val Ala Leu His Ala Arg Asn Ala Glu Tyr Asn Pro 85 90 95Lys Arg Phe Ala Ala Val lie Met Arg lie Arg Glu Pro Lys Thr Thr 100 105 110Ala Leu lie Phe Ala Ser Gly Lys Met Val Val Thr Gly Ala Lys Ser 115 120 125Glu Asp Asp Ser Lys Leu Ala Ser Arg Lys Tyr Ala Arg lie. lie Gin 130 135 140Lys lie Gly Phe Ala Ala Lys Phe Thr Asp Phe Lys lie Gin Asn lie 145 150 155 160Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro lie Arg Leu Glu Gly Leu Ala 165 170 175Phe Ser His Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe Pro Gly 180 185 190Leu lie Tyr Arg Met Val Lys Pro Lys lie Val Leu Leu lie Phe Val 195 200 205Ser Gly Lys lie Val Leu Thr Gly Ala Lys Gin Arg Glu Glu lie Tyr 210 215 220Gin Ala Phe Glu Ala lie Tyr Pro Val Leu Ser Glu 225 230 23權利要求
1. 一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子，其氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2、 一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO: 1所示。
3、 含權利要求2所述的基因的表達載體。
4、 根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述表達載體為重組質粒 pYX212陽SPT15。
5、 一種宿主細胞，其特征在于含有權利要求3所述的表達載體。
6、 根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞為含有重組質粒 pYX212-SPT15的釀酒酵母菌。
7、 權利要求1所述的釀酒酵母起始轉錄因子在木糖發酵生產乙醇中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子及其編碼基因和應用。本發明公開的突變釀酒酵母起始轉錄因子的氨基酸序列為SEQ ID NO2所示，其轉化入酵母菌中可以提高酵母的木糖利用和葡萄糖、木糖共利用的效率。本發明還公開了該突變型釀酒酵母起始轉錄因子的基因序列，這些序列可用于構建利用木糖的重組載體。本發明所提供的突變釀酒酵母起始轉錄因子轉化入酵母菌可用于酵母利用木糖產乙醇的生產。
文檔編號C12R1/865GK101270156SQ20081002403
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者明 嚴, 劉紅梅, 來燦鋼, 歐陽平凱, 琳 許, 寧 郝 申請人:南京工業大學