專利名稱：：利用高保真dna聚合酶介導的替換性引物延伸反應進行序列分析的方法
技術領域：
：本發明涉及一種DNA序列分析方法，特別是涉及一種利用高保真DNA聚合酶介導的替換性引物延伸反應進行序列分析的方法。
背景技術：
：基因組測序是當今生命科學領域中的一項非常重要的工作。自1990年人類基因組計劃(HGP)啟動至2001年基本完成，基因組研究有了飛速地發展。為揭示基因功能，開發個性化藥物和明確生物物種間的進化關系以及不同生物體生命活動的異同，需要對更多的基因組進行測序。從這個意義上說，基因組測序僅僅是后基因組時代的開始。基因組研究的發展需要新一代測序技術的出現。最近，美國國家衛生研究院(NIH)提供"革命性基因組測序技術"(RevolutionaryGenomeSequencingTechnologies)項目的基金，向生物科技發起了新的挑戰計劃到2009年，達到每測定一個人的全基因組序列只花費10萬美元的目標，而到2014年，費用將降為1000美元。"1000美元基因組"所含的意思是，承諾DNA測序將便宜到個人足以負擔得起，并使人們認為這種能把自己的基因組序列存盤供醫生參考的一生一次的支出是值得的。此外，廉價測序技術能擴大基因組的研究者隊伍，供給研究人員更多的基因組以便于對照了解病人和健康者之間的個體差異，從而使基因序列信息更有價值。目前，所有這些應用的障礙在于基因圖高昂的制作成本及有效的準確度。有關技術進展Sanger測序方法的衍生這類方法通過熒光標記雙脫氧核苷酸，延用雙脫氧的鏈末端中止法原理，聯合毛細管電泳分離技術獲得基因組信息。該方法自發明以來，一直具有準確可靠的優點。盡管這種方法對完善人類基因組測序做出了貢獻，但由于其所用材料昂貴、檢測費時，限制了將其運用在1000美元測序的計劃中(1,2)。雜交測序(Sequencingbyhybridization):以雜交原理為基礎的代表技術即為基因芯片技術，基因芯片同樣具有潛在的突變檢測能力。該項技術依賴于大量的特定探針與標記樣品進行雜交，通過檢測配對與否的雜交信號強弱進而判斷樣品中耙分子的數量。正是由于這種單點陣的識別，阻礙了其在高通量基因測序中的運用。歸結原因，其一，對于完成人類長達30億對堿基的基因組測序來說，基因芯片需要大量天文數量的探針；其二，基因芯片對于具有高度重復序列的樣品是難以測定的(3,4)。DNA合成法測序(Sequencingbysynthesis):通過模仿DNA分子復制過程，用帶標記的dNTP代替ddNTP加入到新互補鏈中，來完成信號的檢測。近來有報道，一種基于合成法，運用顯微鏡分離檢測不同標記的dNTPs的技術平臺被應用于芯片中(5)。而聚合酶克隆已成功運用在細菌基因組的再測序中(6)。另外有新的嘗試將聚合酶克隆交聯于浸沒在乳液狀中的株狀微粒上，在擴增反應結束后，每一個微粒都會攜帶目的DNA分子的許多拷貝進而同時進行測序(7,8)。若能有機的結合這些技術，將能使基因測序費用大幅度降低成為可能。物理化學化方法目前，一種新的被稱作納米測序的方法正在興起，以4種堿基間的物理性質差別為基礎，將這種差別轉變成為可以檢測的信號，從而進行測序。理論上是可以根據每一種堿基的化學質量、大小、化學鍵和所帶電荷來識別單堿基的類型。但該方法可能存在的弊端是，相對于全基因組來說，其目的單鏈DNA的制備會比較困難(9，10)。從醫學角度看，我們也許不需要測定出全部基因組中的30億對堿基的序列，而只需集中在占人類基因組中10%的編碼區域，即可獲得足夠的生物醫學相關信息。基于這種考慮，在不久的將來，人們即能在出生時即獲得個人的基因組編碼信息而受益一生。就技術可行性而言，我們認為生物芯片的推廣將會使1000美金測序計劃變成現實。根據制造集成芯片中的墨菲定律，芯片的密度必將增加到一定水平。當一塊基片可以制備為包含了10萬到30萬陣列，而每個位點能識別IOOO個核苷酸，屆時，IOOO美元測出全基因序列的計劃將不會是夢想。當然，目前有關IOOO美金測序計劃的研究并沒有觸及到核心問題或者說還沒有找到合適的相關方法。即便在芯片這個平臺中，單堿基延伸法可以完成木部分基因組序列的測定，但離1000美金測序的目標還很遠，且無法測定簡單重復序列。據認為測序技術上的瓶頸在于使用了"基因擴增"的方式來進行"讀取DNA"序列，若能繞開"基因擴增"的方式讀取"DNA序列"的方法，即可使縮短時間和減少成本成為可能(ll)。為了加速1000美金測序計劃的研究進展，2006年10月4日美國X獎勵基因會設立了總額為1000萬美金的獎項，以獎勵最終完成此目標的研究團隊(12)。1000美金測序計劃的研究將推動相關領域技術的快速發展和個體化醫學的全面推行。1000美金測序計劃的關鍵技術，包括高通量與每一被測序列的長度達到上百個甚至上千個堿基，基于目前芯片制造技術已達到每芯片含100萬個短序列的密度。因此，如何使單一被測定序列得到更多的信息，是1000美金測序計劃中有待解決的最為現實的難題。目前，我們正在嘗試on/off分子開關與芯片失活/激活技術相結合，以期達到每位點識別100個堿基的目標。如果目標可以實現，那么1000美金測全基因組序列計劃將在未來十年內完成，毫無疑問，這將不僅為個體化治療提供強有力的保證，而且為提高人類生存質量提供依據。而我們提出的基于納米級分子開關的測序方案，除了能對突變位點進行基因分型外，每一延伸引物尚可一次性識別幾個至十個核苷酸(13,14)。這種堿基步行法用于測序，與探針雜交法和連接酶介導的測序方法在效果上相似，均只能得到較短的序列集合，在應用于基因組測序時將會無可避免地存在多個未知序列。因此，若以on/off分子開關為基礎，偶聯兩種不同的引物延伸反應即部分性鏈終止和替換延伸反應于一個反應體系，將使芯片上的一個延伸弓I物解碼數百甚至更長的堿基序列。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中的不足，'提供一種利用高保真DNA聚合酶介導的替換性引物延伸反應進行序列分析的方法。本發明的技術方案概述如下一種利用高保真DNA聚合酶介導的替換性引物延伸反應進行序列分析的方法，包括如下步驟(1)準備耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對這些引物可實際參與反應的三末端自由羥基進行定量測定；(2)以單一種類的熒光標記的ddNTP與非熒光標記的同一種類dNTP為混合底物，在不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶催化下，進行部分性鏈終止引物延伸反應；(3)人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP在具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進行的替換性引物延伸反應；(4)偶聯部分性鏈終止引物延伸反應和替換性引物延伸反應并重復使用這一偶聯過程。所述引物為三末端修飾的引物或三末端未修飾的引物。所述三末端修飾的引物為耐3，-5，核酸外切酶消化的修飾。所述具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶為Vent高保真DNA聚合酶、DeepVent高保真DNA聚合酶、Pfu高保真DNA聚合酶、Sso7d-PfU高保真DNA聚合酶或Kapa高保真DNA聚合酶。所述不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶為TaqDNA聚,酶、T7測序酶、Vent—DNA聚合酶、DeepVenfDNA聚合酶。所述人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP為硫化修飾的PS-dNTP、環化修飾的acy-NTP或鎖核酸。所述熒光標記的ddNTP與非熒光標記的dNTP的濃度比例在待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于10個時為1/3至1/30。所述熒光標記的ddNTP與非熒光標記的dNTP濃度比例在待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于100個時為1/31至1/300。所述熒光標記的ddNTP與非熒光標記的dNTP濃度比例在待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于1000個時為1/301至1/3000。本發明的優點是1.本發明為世界上第一個偶聯部分性鏈終止延伸反應與替換性引物延伸反應用于測序的，這一設計是本發明可行性和具有高通量的基礎。2.熒光標記的ddNTP只被用于中間反應過程，當信號(堿基識別)獲取后，利用高保真DNA聚合酶的3'-5'校正功能清除了新合成鏈中不能延伸的堿基，使其3'端得以活化，可繼續另一反應過程。3.此外，耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP與具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶結合所進行的替換性引物延伸反應，能清除熒光ddNTP，減少背景噪音，并使反應同步化。4.該方法采用熒光ddNTP成熟技術替換目前合成法測序中使用的熒光dNTP非成熟技術，結合替換性引物延伸反應使經典的鏈終止測序法與合成測序法兩種看似不相容的技術偶聯到一個反應體系中。5.該方法與多種技術平臺相容，特別適宜于基于芯片的序列分析。5圖1為本發明的方法工作原理示意圖。圖2為本發明與芯片技術相容示意圖。具體實施例方式本發明方法的關鍵為對需要延伸的耐3'-5'核酸外切酶消化的引物進行部分失活與重新激活的循環反應。如圖1所示。準備耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對這些引物可實際參與反應的三末端自由羥基進行定量測定；(對三末端自由羥基進行定量測定是指運用不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶介導以熒光標記的ddNTP為底物進行單堿基延伸反應和隨后利用3'-5'核酸外切酶切除引物三末端新加上的帶熒光的堿基。)通過對待延伸引物(耐3'-5'核酸外切酶消化的引物)以單一種類的熒光標記的ddNTP與非熒光標記的同一種類dNTP為混合底物，在不具有3'-5'核酸外切酶活性DNA聚合酶催化下，進行部分性鏈終止引物延伸反應，通過ddNTP與dNTP混合底物中的ddNTP連接到新生DNA鏈的3'末端使延伸反應終止。(ddNTP為雙脫氧核糖核苷酸)(熒光標記的ddNTP與非熒光標記的dNTP混合物為ddATP/dATP或ddTTP/dTTP或ddCTP/dCTP或ddGTP/dGTP)該反應由測序酶如T7測序酶所介導(也可以采用無校正作用的TaqDNA聚合酶或Vent—DNA聚合酶或DeepVenfDNA聚合酶所介導)。由于ddNTP與dNTP混合底物中的dNTP并不導致延伸反應的終止，因此，根據待測序列中單一堿基的連續重復程度可調整ddNTP/dNTP的比例，通常為1/10至1/1000之間當待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于10個時，這一比例為1/3至1/30;當待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于IOO個時，這一比例為1/31至1/300;當待測序列中單一堿基的最大連續重復程度小于1000個時，這一比例為1/301至1/3000。但是，當待測序列中特定區域的單一堿基的連續重復程度大于1000個時，本發明的測序結果會出現誤差。在部分性鏈終止引物延伸反應之后，通過多次洗滌去除殘留在反應體系中的ddNTP熒光信號，當使用芯片測序時，可向芯片加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應緩沖液，孵育30秒至一分鐘。重復清洗2-5次。然后通過熒光掃描裝置檢測待延伸引物上的熒光信號強度。當一種堿基的反應完成，清洗完成和檢測完成之后，新生DNA分子的3'末端處于兩種狀態，其中一部分三末端含有ddNTP殘基而無可延伸的3'末端自由羥基;另一部分則含有dNTP殘基而擁有可延伸的3'末端羥基。因此，為使新生鏈在使用另一種ddNTP/dNTP混合底物時具有足夠的數量且數量基本恒定的待延伸羥基，并清除和減少另一新堿基檢測時的背景熒光信號，本方法通過引入替換性引物延伸反應達到上述目的。替換性引物延伸反應由具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進行。具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶可以選用Vent高保真DNA聚合酶(也可以選用DeepVent高保真DNA聚合酶、Pfo高保真DNA聚合酶、Sso7d-Pfii高保真DNA聚合酶或Kapa高保真DNA聚合酶)。在替換性引物延伸反應中，不耐3'-5'核酸外切酶消化的ddNTP和dNTP殘基被清除，而耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP則被整合進新合成的DNA分子中，這一反應的結果是耐3，-5，核酸外切酶消化的dNTP替換了新生DNA分子三末端不耐3，-5，核酸外切酶消化的ddNTP和dNTP殘基，從而使反應體系同步化，激活了那些因ddNTP摻入而失活的三末端。隨著熒光標記的ddNTP被消化，反應體系中的原有熒光信號便可用物理的漂洗方式予以清除，漂洗仍使用不含熒光ddNTP的一倍濃度PCR反應緩沖液，一般漂洗2-5次，每次30秒至一分鐘。然后，依次進行另一種堿基的反應。四種堿基的反應順序是固定的，可選用其16種排列中的特定一種排列作為程序。上述部分性鏈終止引物延伸反應和替換性引物延伸反應的不斷循環，和依次分別對構成DNA的四種組分A、T、C、G進行反應，通過引物的失活過程獲得待測定堿基的性質和數量；通過替換性引物延伸反應使失活的部分引物得以重新激活，從而使該反應能得以循環進行。從信號獲取的角度，部分性鏈終止為直接解碼或測序的反應過程。這一步與Sanger's測序原理一致，均可能出現延伸產物所帶熒光顏色的區別和同一種引物中延伸產物長度不一。在Sanger's酶法測序中，不同長度產物通過電泳進行辨認，但在芯片測序反應時，由于延伸反應在固相面進行，反應產物不可能電泳。在這里，延伸產物的長度由所檢測到的熒光信號的強度所反映。例如，當ddNTP/dNTP的比例為1/1000時，單一種堿基的不同長度重復序列的延伸產物的熒光信號強度在重復數小于32時基本上以1/1000為量子化單位變化(表二)。對芯片測序反應而言，信號的標準化可通過兩方面所達到。首先，如圖2所示，通過對芯片進行以100%熒光標記的ddNTP為底物的單堿基延伸反應，以獲取飽和或最大熒光強度，作為100%參考值。另外，可通過選取信號強度相近且頻率出現最高的低信號作為一個堿基延伸反應的基本量子化信號的平均值，當使用ddNTP/dNTP為1/1000時，這一基本量子化信號的平均值接近于飽和式最大熒光強度即100%參考值的1/1000。Sanger's酶法測序由于要求電泳，無法直接應用于芯片測序。另外，Sanger's酶法測序可讀長度一般僅為400-800堿基，后一點是由于末端終止法測序反應過程中可用于延伸反應的含3'末端羥基不斷消耗的原因。與Sanger's酶法測序相比，雖然目前的循環合成法測序在理論上具有一定的優點，但因引入多種新的化合物，新生鏈的延長長度受到極大限制，僅為10-100堿基之間，其實際應用受到限制。有鑒于此，本發明結合Sanger's聚合酶介導的末端終止法，使用了ddNTP/dNTP混合底物，應用于部分性鏈終止引物延伸反應中。同時，本發明結合了鏈合成測序法對待測序列每一種堿基分步進行反應的原理，通過發明由耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP與具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶所介導的替換性引物延伸反應，使Sanger's酶法末端終止測序和鏈合成循環反應測序這兩種偶聯為一個反應體系。部分性鏈終止引物延伸反應與替換性引物延伸反應的不斷循環，和依次分別對構成DNA的四種組分A、T、C、G進行反應及循環，可使新生鏈的長度達到及超過Sanger's酶法末端終止測序。如圖2所顯示，熒光信號強度的標準化之一為通過單堿基延伸反應所得到測序微芯片在含四種混合的熒光標記ddNTP和待測模板反應液中孵育，使得芯片上每一個與相應模板結合的引物都延伸一個堿基，檢測其信號強度作為參考當量100%。然后，芯片移入含有3'-5'核酸外切酶的反應液中孵育，讓芯片回歸初始狀態，并檢測信號強度是否接近于零。這一步用于實驗儀器的校準，并檢測了高保真DNA聚合酶的工作效率。單堿基延伸芯片技術已得到廣泛應用。與普通測序所用引物不同的是，本發明應用于芯片技術平臺時，其芯片上的引物3'末端須經過修飾而具有耐3'-5'核酸外切酶消化的特性。如圖2所舉例，在選定的特定引物點，向芯片加入含ddATP/dATP的混合反應液進行孵育時，其中ddATP為綠色熒光標記而dATP為非熒光標記，若待測模板在此處序列含兩個T堿基，新合成的DNA序列則可相應延伸兩個A堿基。部分性鏈終止引物延伸反應完成后，向芯片上加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應緩沖液，重復清洗2-5次，通過多次洗滌去除殘留在反應體系中的背景熒光信號及多余模板。然后檢測其信號強度，以判斷序列當前位置腺嘌呤的個數。假定芯片該點含有約10000個引物，需要延伸2個腺嘌呤，而ddATP/dATP的濃度比為1/100，當引物延伸第一個A堿基時，大約有9900個dATP進入新合成的DNA分子(10000x99/100)，同時約有100個引物3'末端被引入綠色熒光標記的ddATP(10000x1/100)。由于ddATP的3'末端不含自由羥基而反應終止，因此當延伸第二個A堿基時只有剩余的9卯0個引物可以繼續延伸，其中又有99個引物被引入綠色熒光標記的ddATP(9900x1/100)，此時模板序列的T堿基己完成復制過程但反應液中缺乏其它三種堿基導致該點的反應無法繼續進行，其綠色熒光強度與該步反應過程中整合進新生DNA鏈中的熒光ddATP直接相關，根據檢測所得到的綠色熒光的強度，即可判斷A堿基延伸數目為2。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異腺嘌呤的緩沖液及待測模板進行孵育，綠色熒光標記的ddATP與非熒光標記的dATP被消化，引物3'端末端位置被引入耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾腺嘌呤，完成修飾的特異腺嘌呤替換延伸反應。至此，綠色熒光標記ddATP以及普通dATP被消化，并與多余模板一同被物理漂洗除去，而引物3'末端位置只存在被引入的耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾腺嘌呤。漂洗后熒光檢測信號強度降至背景噪音水平，至此A堿基延伸反應結束，該點成功引物延伸了2個A堿基，同時該點所有引物重新回復到具有3'末端自由羥基和進入可延伸狀態。A堿基的延伸反應結束后，向芯片加入含ddTTP/dTTP的混合反應液及待測模板進行孵育，其中ddTTP為紅色熒光標記而dTTP為非熒光標記，圖2例中待測模板在此處序列僅含一個A堿基，新合成的DNA序列則可相應延伸一個T堿基，并因反應液中缺乏引物繼續延伸所需的其它三種堿基導致反應終止。向芯片上加入漂洗液，去除背景熒光信號后，檢測其信號強度，判斷序列當前位置dTTP的個數。同樣當芯片該點含有10000個引物，需要延伸一個T堿基，而ddTTP/dTTP的濃度比為1/100，在當引物延伸時，則大約有9900個dTTP進入新合成的DNA分子(10000x99/100)，和同時約有100個引物3'末端被引入紅色熒光標記的ddTTP(10000x1/100)。此時由于引物3，末端無法從反應液中獲取延伸所需其它三種堿基導致該點的反應結束。其紅色熒光強度約為單堿基延伸反應過程中所得到的飽和熒光強度的1%，通過檢測紅色熒光的強度，可判斷T堿基延伸數目為1。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dTTP緩沖液及待測模板進行孵育，紅色熒光標記的ddTTP與非熒光標記的dTTP被消化，耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dTTP替換延伸，引物3'端末端位置被引入耐3'-5'外切酶消化的修飾dTTP，這時引物3'末端位置只存在被引入的耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾dTTP，漂洗后使紅色熒光檢測信號強度降至背景噪音水平。至此T堿基反應結束。T堿基延伸反應結束后，向芯片加入含ddCTP/dCTP的混合反應液和待測模板進行孵育，其中ddCTP為藍熒光標記而dCTP為非熒光標記，圖2例中待測模板在此處序列不含堿基G，新合成的DNA序列則無C堿基延伸。通過相應漂洗之后檢測熒光信號強度，其熒光強度表現為背景噪音而無特定峰值，可判斷此引物點在此次反應中無C堿基延伸。雖然芯片中該引物點在上一步含ddCTP/dCTP混合反應液中不存在引物延伸，但仍需向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dCTP的緩沖液進行孵育以使芯片上其它有延伸反應的引物點進行替換延伸，并完成相應漂洗過程。C堿基延伸反應結束后，向芯片加入含ddGTP/dGTP的混合反應液和待測模板進行孵育，其中ddGTP為熒光標記而dGTP為非熒光標記，當待測模板在此處序列含1個C堿基，新合成的DNA序列則可相應延伸1個G堿基，并因反應液中缺乏引物繼續延伸所需的其它三種堿基導致反應終止。部分性鏈終止反應完成后，通過漂洗去除背景熒光信號，檢測其信號強度，判斷序列當前位置dGTP的個數。然后，向芯片加入含3'-5'核酸外切酶活性高保真DNA聚合酶與耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dGTP的緩沖液進行孵育，熒光標記的ddGTP與非熒光標記的dGTP被消化，耐3'-5'核酸外切酶消化修飾的特異dGTP替換延伸，引物3，端末端位置被引入耐3'-5'核酸外切酶消化的修飾dGTP,，并完成相應漂洗過程。至此G堿基延伸反應結束。綜上所述，通過分析熒光信號的種類和強度，可得到引物3'末端引入堿基的種類和數目在反應中參與延伸的部分ddNTP，其熒光種類解碼新加入堿基種類，熒光強度解碼新加入堿基的數量。就例圖2中的代表性引物點而言，經過連續四步反應即一個測序循環，引物3，末端被引入AATG，巧妙的完成一段序列的測序任務。該方法通過不斷針對每一種堿基分別進行反應且連續循環，使引物不斷延伸，待測模板上的序列隨之不斷被解碼，因此，本發明可以為長序列模板測序。下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1遺傳性乳腺癌相關基因(Brca-1)部分測序引物設計與信號分析Brca-l為一種與遺傳性乳腺癌發生相關的基因，其fe基因庫中的編號為(NM—065379.3)，含有8個外顯子。本應用例以Brca-l的外顯子1，2和3為例，說明本發明在實際序列測定中的應用步驟。(1)準備相應的耐3'-5'核酸外切酶消化的引物并對這些引物可實際參與反應的三末端自由羥基進行定量測定。目標基因的測序可分為基因組序列測定和編碼序列測定。本例以芯片平臺對目標序列Brca-l的前三個外顯子編碼序列進行測序設計。從Genbank中的表格輸出選項可直接得到相應的外顯子和外顯子兩端的內含子序列，先合成三末端硫化修飾與五末端氨基修飾的測序引物(見表l)。測序引物(濃度在80nM到50pM之間)通過其五末端的氨基基團與環氧化處理的芯片玻璃涂層形成共價結合，以含有150mM磷酸鈉的緩沖液(pH=8.0)點樣。室溫下空氣干燥過夜，65。C烘干30分鐘，在含有0.1%SDS，5%乙醇和雙蒸水的熱混合液中沖洗約1分鐘即可應用。利用可進行原位PCR的PCR儀對芯片進行單堿基延伸與延伸堿基的切除反應應用100^1含四種熒光標記的ddNTP與待測序模板對待延伸引物進行單堿基延伸，以所得到的熒光強度定量待延伸引物三末端可實際參與反應的9三末端自由羥基數，之后通過將芯片與含3'-5'核酸外切活性的核酸酶共孵育而達到切除帶熒光的單堿基。(2)以不具有3'-5，核酸外切酶活性DNA聚合酶介導，以單一種類的熒光標記的ddNTP與非熒光標記的同一種類dNTP為混合底物及待測模板的反應混合液中進行部分性鏈終止引物延伸反應。在本例的反應中，所用ddNTP/dNTP混合底物為ddATP/dATP混合底物，其比例采用1/100，引物延伸由T7測序酶介導，反應溫度和時間分別控制52攝氏度至64攝氏度之間和在30秒鐘至90秒鐘之間。這一歩在原理上與Sanger's末端終止法測序相似，區別在于本實驗不采用含有四種ddNTP和四種dNTP的公共混合底物，而是分別采用ddATP/dATP;ddTTP/dTTP;ddCTP/dCTP和ddGTP/dGTP四類不同的混合底物。Sanger's末端終止法測序目前已廣泛應用于分子生物學、遺傳學和基因組測序等眾多領域。部分性鏈終止引物延伸反應完成后，向芯片上加入不含ddNTP和dNTP的一倍濃度PCR反應緩沖液，重復清洗2-5次，通過多次洗滌去除殘留在反應體系中的背景熒光信號及多余模板。然后檢測其信號強度，以判斷序列當前位置腺嘌呤的個數。(3)人工合成的耐3'-5'核酸外切酶消化的dNTP在具有3'-5'核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶催化下進行的替換性引物延伸反應。在本例中的替換性引物延伸反應中，采用硫化修飾的PS-dATP底物，其使用濃度為20(HiMdATP，反應由具有3'-5'核酸外切酶活性Pfu高保真DNA聚合酶所介導，引物延伸反應溫度和時間分別控制52攝氏度至64攝氏度之間和在30秒鐘至90秒鐘之間。(4)偶聯部分性鏈終止引物延伸反應和替換性引物延伸反應并重復使用這一偶聯過程。如表1所示，本例顯示了每一循環都分別針對每一特定種類的堿基A，T，C，G進行部分性鏈終止引物延伸反應和替換性引物延伸反應。通過不斷重復這種循環過程，以解碼更長序列。此循環過程為本發明用于序列分析的基礎，由部分性鏈終止引物延伸反應和替換性引物延伸反應兩個偶聯反應不斷循環來完成測序任務。在部分性鏈終止引物延伸反應完成后，替換性引物延伸則相對應的分別使用濃度為200pMdATP，200pMdTTP，200pMdCTP,200nMdGTP以完成替換性引物延伸反應。通過上述四個步驟，本例在表1的最后一行中給出了野生型序列。表l、朋CA/外顯子模板制備引物測序引物12ATGGCAGATGTTGCACTGAGGAAAATAAATTACCAAATTTTCAGCTGTTCAACATACAAAAGCATACCACTGGCCAGCGCCGAAAGCGACCGAGGACCAACCTCGGAGGGTAPl:ATGGCAGATGTTGCACT^P2:CAAATTCCACATTTCAGIP3:CTGTTCAACATACAAAG4P4:TCTGGAGCGCATCGTIP5:CGCCGAAAGCGACCGAGT￡P6:CTCGGAGGGTATTTATGI10測序反應<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>說明測序引物中的黑體加下劃線標記的堿基為硫化修飾者。此表中所列熒光強度來源于部分性鏈終止反應使用ddNTP/dNTP比例為1:100。不同ddNTP/dNTP的比例濃度其意義不同，例如1:IO所得信號強度較強，對單一堿基的成串長序列衰減較快，而l:100或l:1000所得信號強度相應變弱，但對單一堿基的成串長序列衰減較慢。事實上，當這一比例為l:0(即僅使用四種混合的ddNTP)時，只能延伸一個堿基；而當這一比例為0:1(即僅使用四種混合的dNTP)時，則延伸反應可連續進行。表2、ddNTP/dNTP不同比例測定成串堿基時針對單一堿基的每一步中摻入新生DNA鏈中的熒光ddNTP的總熒光強度(以純ddNTP為底物的單堿基延伸熒光強度為1)成串長度(堿基個純ddNTP1/101/1001/1000純dNTP數)1l細0.1000.0100.001O扁20.1900.0200.002O細30.2710.0300.003O扁40.3440.0390.0040.00050.4100.0490.0050.00060.4690.0590.006o扁70.5220.0680.0070.00080.5700.0770.0080.00090.6130.0860.009o扁100.6510.0960.0100.000110.6860.1050.0110.000120.7180.1140.012o扁130.7460.1220.013o扁140.7710.1310.0140.000150.7940.1400.015o細160.8150.1490.016o扁170.8330.1570.017o扁180.8500.1650.0180.000190.8650.1740.019o扁200.8780.1820.0200.000210.8910.1900.021o細220.9020.1980.0220.000230.9110.2060.023o扁240.9200.2140.024o扁250.9280.2220.0250.000260.9350.2300.0260.000270.9420.2380.0270.00028O駕0.2450.028o扁290.9530.2530.029o細300.9580.2600.030o細310.9620.2680.031o扁320.9660.2750.0320.000330.9690.2820.0320.000340.9720.2890.0330.000350.9750,2970.0340.00014表1中測序引物中的黑體加下劃線標記的堿基為硫化修飾堿基。此表中所列熒光強度來源于部分性鏈終止引物延伸反應使用ddNTf/dNTP比例為1:100。不同ddNTP/dNTP的比例濃度其意爻不同，例如l:IO所得信號強'度較強，對單一堿基的成串長序列衰減較快，而1:100或h1000所得信號強度相應變弱，但對單一堿基的成串長序列衰減較慢。事實上，當這一比例為h0(即僅使用四種混合的ddNTP)時，只能延伸一個堿基；而當這一比例為0:1(即僅使用四種混合的dNTP)時，則延伸反應可連續進行。這一根據ddNTP/dNTP的比例濃度獲取不同強度熒光信號和熒光信號強度在測序過程中隨單一堿基的成串長序列衰減的情況在表2中有詳細反映。參考文獻(1)LanderES,LintonLM,BirrenB,etal.人類基因組的測序與序列分析(Initialsequencingandanalysisof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