專利名稱：慶大霉素b的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種慶大霉素B的產生菌，本發明涉及一種慶大霉素B的生 產工藝。
技術背景在美國專利No. 3091572 1975. 10. 28中所述的慶大霉素B是從抗生素 副產物中分離出來，通過絳紅色小單孢菌和棘刺小單孢菌發酵得到了的整個抗 生素混合物。采取一種柱層析分離方法，即采取一個溶劑系統的下層，該溶劑 系統由甲醇、氯仿、氫氧化銨組成，作為洗提溶劑，進行分離。在色譜法之前， 等體積的這些溶劑進行混合并放置，使層分離出。慶大霉素C (由3種組份構 成，d、 Q和C2)是首先洗提出來，然后依次為慶大霉素B:、慶大霉素X、慶 大霉素B，最后為慶大霉素A。從專利中可以看出慶大霉素B是作為慶大霉素 的副產物(小組份)之一被提取出來，因組份多，含量低，所以分離難度大， 純度低，成本高。 發明內容本發明的目的在于對小諾霉素的產生菌(棘孢小單孢菌)進行選育，采 用細胞原生質體融合技術，選出一個慶大霉素B為主要組份的新菌株，并提供 其生產工藝。本發明通過以下方案實現將活化好的小諾霉素菌種201-9#和201-65#接種 在菌絲生長培養基中，201-9#和201-65#由小諾霉素菌種經自然選育而得，其重 量配比為麩皮1.5-2Q/。，可溶性淀粉(C.P) 1.0% ，MgS04(C.P) 0.05%，跳(C.P) 0.1，天冬素0.002%， K2HP04(C. P)O. 03%， NaCl (C. P)0. 05%， CaC03(C. P) 0.1%， 瓊脂2.0%， pH調至7.5，蒸餾水配制；培養基制備用不銹鋼鍋裝好要配體積 的蒸餾水，留出一部分拌料用，先將麩皮煮開，再把稱好的瓊脂放入鍋內溶解； 把原料按上述比例稱好，放入小燒杯內，CaC03單獨后放，用留下的一部分水 把原料溶解到入鍋內，邊倒邊攪拌；用6N的NaOH調pH至7.5后，加入CaCO:, 攪拌均勻后分裝；裝量50ml-60ml/250ml茄子瓶(或20ml/28 X 200mm大試管)， 加棉塞，包好后用lkg/cm2 120°C 30分鐘消毒(壓力要求穩定)。消毒結束后， 稍冷幾分鐘，即可擺斜面，待凝固后，于35-37'C恒溫箱過夜后備用接種；斜 面制備用無菌接種棒取一定量的砂土孢子，用劃線法接種于已消毒制備好的 斜面培養基中，涂勻后，塞好棉塞，用紗布牛皮紙包瓶口后，于37"C培養10 天，取出放入冰箱(4-5。C)保存備用；搖瓶配比為淀粉1%，黃豆餅粉1.0%，葡萄糖(C. P)O. 1%， CaC030. 5%，蛋白胨0. 2%，跳(C. P)O. 05%，氯化鈷10 y /ml， 玉米粉1.5%，過濾水配制，pH7.7將上述培養基配制好后，裝入500ml三角瓶 中，裝量50ml左右/瓶，在1.05kg/cm2 121"下滅菌30分鐘，冷卻備用；在 無菌室超靜工作臺(IOO級)內用無菌接種針挖取斜面孢子約0.5，2于三角瓶 中，在搖瓶機上(旋轉式240-250轉/分)35°C±0. 5。C培養130 144小時， 放瓶，測效價、組分。其中菌種201-9#小諾霉素組分50%,搖瓶效價1085 " /ml， 201-65#小諾霉素組分55%，搖瓶效價1130 u /ml.)培養基的配方按重量百分比 為淀粉3. 5%-4% ，黃豆餅粉3. 00/『3. 5%，葡萄糖0. 3%_0. 5%，玉米粉1. 5%-2. 0%， 蛋白胨0. 15%-0.2%，魚粉0.2%_0.4%，硫酸銨0.01%-0.05%，硝酸鉀 0. 005%-0. 01%，碳酸轉0. 4%-0. 5%，氯化鈷8mg/ml-10mg/ml，其PH7. 5-7. 8; 振蕩培養60 65小時，離心收集菌體，用10%-12%蔗糖溶液洗滌后，加濃度 14mg/ml-16mg/ml溶菌酶37°C±0. 5C下水浴酶解，鏡檢至大量原生質體形成； 1、 2融合將201-9#和201-65#原生質體懸液按等量混合，再加入適量 聚乙二醇，25'C士rC室溫下振搖1-2分鐘，再放置1. 5 2小時，取0. 1-0. 2ml/皿涂布在再生平皿，35。c士rc倒置培養至長出菌落，其中一菌落為紅色，對該菌株進行組份和搖瓶效價測定，該菌株含有慶大霉素B組份，再對這一菌株 進行自然選育，獲得慶大霉素B含量高的優質菌株，并做穩定性實驗，傳5代 證明其穩定性良好，將此菌株JYGB-01; 1、 3慶大霉素B的制備37。C士0.5。C下慶大霉素B沙土孢子培養10天得母斜(Fl)，再在37°C± 0.5。C下進行孢子培養9天得子斜(F2)，在35。C士rC左右一級種子罐培養 50hr，得一級種子培養液，34。C士rC二級種子罐培養24hr得二級種子培養 液，34。C土rC下發酵80 85hr，發酵液中加入6N濃度H2S04調整pH至2. 0 左右，在酸化液中再加入2麗aOH中和至pH6.8左右，得中和液，用732NH,+ (Na+)型樹脂攪拌下靜態吸附5 6hr進行離子交換，飽和樹脂離心分離以除 去異物，對飽和樹脂裝柱7細C1及NH4C1、去離子水洗至無Cl—，再用0. 5N氨 水解吸后解吸液711-0H—型脫色，對脫色液薄膜濃縮，所得濃縮液，繼續用活 性碳脫色過濾，吸附型大孔樹脂分離、濃縮，采用溶媒剃度解析，先后得到 GMB、 GMC,a和GMC2b (小諾霉素)民，816#精制后即可得到組份含量>90%，可供合成異帕米星用。本發明篩選得到的慶大霉素B的產生菌的優點在于其組份比高，效價高。 慶大霉素B的組份比由原來的10%提高到現在的40%，搖瓶效價由原來的 4001Vml提高到現在的lOOOlVml。慶大霉素B的生產工藝的優點在于縮短了 整個生產周期；提高了慶大霉素B的純度，生產出的慶大霉素B的純度由原來 的85%提高到現在的90%。降低了生產成本，極大地提高了慶大霉素B的生產 能力。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明進行詳細說明。 實施例1:首先對小諾霉素的產生菌(棘孢小單孢菌)進行選育，然后再制備慶大霉 素B，具體步驟如下1. 1原生質體的制備將活化好的自然選育出的小諾霉素菌種201-9# (小諾霉素組分50%，搖瓶 效價1085ix/ml)和201-65# (小諾霉素組分55%，搖瓶效價1130y/ml)接種 在菌絲生長培養基中，培養基的配方按重量百分比為淀粉4. 0%，黃豆餅粉3. 5%， 葡萄糖O. 5%，玉米粉2.0%，蛋白胨0.2%，魚粉0.2%，硫酸銨0.05%，硝酸鉀 0.01%，碳酸1丐0.4%，氯化鈷8mg/ml，其PH7. 7。振蕩培養60 65小時，離心 收集菌體，用10%蔗糖溶液洗滌后，加濃度15mg/ml溶菌酶37。C士0.5。C下水 浴酶解，鏡檢至大量原生質體形成。1.2融合將201-9#和201-65#原生質體懸液按等量混合，再加入適量聚乙 二醇(PEG)室溫(25。C士rC)下振搖1分鐘，再放置1.5 2小時，取0. lml/皿涂布在再生平皿，35'c士rc倒置培養至長出菌落，其中一菌落為紅色(其它為土黃色)，對該菌株進行組份和搖瓶效價測定，該菌株含有慶大霉素B組 份，再對這一菌株進行自然選育，獲得慶大霉素B含量高的優質菌株，并做穩 定性實驗，傳5代證明其穩定性良好，此菌株為棘孢小單孢菌突變株 (M"/crawo/7c^/7ora ec/z/ms^ora mutant)將此菌株暫命名為JYGB—01 。 1.3、慶大霉素B的制備37"士0.5。C下慶大霉素B沙土孢子培養10天得母斜(Fl)，再在37。C士0. 5'C下進行孢子培養9天得子斜(F2)，在35°C ± rC左右一級種子罐培養48 54hr，得一級種子培養液，34。C士rC二級種子罐培養22 26hr得二級種子培 養液，34。C土rC下發酵液80 85hr，加入6NH2S04調整pH至2. 0左右酸化液， 再加入2NNaOH中和至p朋.8左右，得中和液，用732NH4+ (Na+)型樹脂攪拌下 靜態吸附5 6hr進行離子交換，飽和樹脂離心分離以除去異物，對飽和樹脂 裝柱7%HC1及NHX1、去離子水洗至無Cr，再用0. 5N氨水解吸后解吸液711-0H— 型脫色，對脫色液薄膜濃縮，所得濃縮液，繼續用活性碳脫色過濾，吸附型大 孔樹脂分離、濃縮，采用溶媒剃度解析，先后得到GMB、 GMCl￡JnGMC2b (小諾 霉素)，GMB經816"精制后即可得到組份含量》9CE，可供合成異帕米星用。 一、 菌種部分(201-9#和201-65#)1. 斜面孢子制備 1. l培養基配比麩皮1.5-2%，可溶性淀粉(C.P) 1.0% ， MgS04(C.P) 0.05%， KN03(C.P) 0.1， 天冬素0.002%， K2HP04(C. P)O. 03%， NaCl (C. P) 0. 05%， CaC03(C. P) 0.1%,瓊脂(或瓊脂粉)1.8-2.0%， pH消前調至7.5，蒸餾水配制。其中麩皮規格選當 年顆粒飽滿無蟲蛀及無農藥小麥，用自來水洗凈浸泡三小時，晾干表皮水分， 磨成碎片約20目過篩，篩去游離淀粉，晾干后再篩一次。1.2培養基制備用不銹鋼鍋裝好要配體積的蒸餾水，留出一部分拌料用，先 將麩皮煮開，再把稱好的瓊脂放入鍋內溶解；把原料按上述比例稱好，放入小 燒杯內[CaC03單獨后放]，用留下的一部分水把原料溶解到入鍋內，邊倒邊攪 拌。用6N的NaOH調pH至7. 5后，加入CaC03攪拌均勻后分裝。裝量 50ml-60ml/250ml茄子瓶(或20ml/28X20(hnm大試管)，加棉塞，包好后用 lkg/cm2 120°C 30分鐘消毒(壓力要求穩定)。消好后，梢冷幾分鐘，即可擺 斜面，待凝固后，于35-37"C恒溫箱過夜后備用接種。1.3母斜制備用無菌接種棒取一定量的砂土孢子，用劃線法接種于已消毒制 備好的斜面培養基中，涂勻后，塞好棉塞，用紗布牛皮紙包瓶口后，于37t:培 養10天，取出放入冰箱(4-5°C)保存備用。1.4子斜制備把生長好(冰箱存放一星期以上)的母斜，用接種棒輕輕刮下， 接種于茄子瓶斜面上，劃線涂布，加棉塞包好后培養。1.5培養與保存接好后的斜面包扎后放37。C土0.5'C恒溫架上培養；第一天 接種面朝上，第二天反轉瓶將接種面朝下。母瓶培養10天，子瓶9天，培養 2-3天內須逐瓶檢査無菌情況。培養過程須觀察孢子生長情況。(指營養菌絲， 孢子生長，顏色變化，產生色素等)。培養好的孢子斜面保存在4-5t:冰箱內， 并要進行質量檢驗備用。生產用孢子斜面應保存絕對純種，無雜菌。 2、搖瓶種子制備 2.1搖瓶種子培養基配比淀粉1%， KN03(C.P)0.05%，玉米粉2.0%，黃豆餅粉1.5%，魚粉0.5%，葡萄糖 (C.P)O. 1%， CaC030.4，過濾水配制，pH7. 22.2制備將上述培養基配制好后，裝入500ml三角瓶中，裝量50ml左右/瓶， 在1.05kg/cm2 12rC下滅菌30分鐘，冷卻備用。2. 3接瓶:在無菌室火焰下，用無菌接種針挖取斜面孢子約0. 5cm2于三角瓶中， 在搖瓶機上(旋轉式240-250轉/分)35。C士0.5。C培養130 144小時，放瓶， 測效價、組分。 二、發酵部分1. 一級種子罐培養基配比淀粉1.0%，黃豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖0.5%，碳酸鈣0.4%，魚粉 0.1%，蛋白胨0.2%，硝酸鉀0.05V淀粉酶碳源量O. 15%,消沫油450ml/120L (豆油)2. 二級種子罐培養基配比淀粉2.0%，黃豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖O. 5%，碳酸鈣0.4%，玉米粉0. 2%，蛋白胨0. 2%，硝酸鉀0. 02%,淀粉酶碳源量0. 15%，氯化鈷2mg/ml， 泡敵0. 2%3.發酵罐培養基配比淀粉4.0%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖0.2%，碳酸鈣0.5%，魚粉 0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸鉀0.0P/。，硫酸銨0.05%，淀粉酶碳源量0.2%，氯化 鈷8mg/ml，泡敵O. 3%。 三、組份分離采用樹脂柱層析分離，樹脂為816#離子交換樹脂，獲得高純度慶大霉素B，經 濃縮、凍干，得到慶大霉素B粉。 實施例2:按實施例1相同方法制得小諾霉素菌種201-9#和201-65#，其原生質制備 中的培養基的配方按重量百分比為淀粉3.5%，黃豆餅粉3.0%，葡萄糖0.4%， 玉米粉1.5%，蛋白胨O. 18%，魚粉O. 3%，硫酸銨0.04%，硝酸鉀0.01%，碳酸 鈣0.5%，氯化鈷8mg/ml-10mg/ml，其PH7. 5-7.8;其它工藝過程及原料配比 均與實施例l相同。 實施例3:本實施例在菌種斜面孢子制備中的培養基的重量配比為麩皮2%，可溶性 淀粉(C. P) 1.0% ， MgSO"C. P) 0.05%， 跳(C. P) 0.1，天冬素0.002%， K2HP04(C. P)O. 03%， NaCl(C. P)O. 05%， CaC03(C. P) 0.1%，瓊脂2.0%， pH調至 7.5。原生質制備中的培養基的配方按重量百分比為淀粉4%，黃豆餅粉3.2%， 葡萄糖0.5%，玉米粉2%,蛋白胨O. 18%，魚粉0.4%，硫酸銨0.05%，硝酸鉀 0.008%，碳酸f丐O. 35%，氯化鈷8mg/ml _10mg/ml，其PH7. 5-7. 8;其它工藝 過程及原料配比均與實施例1相同。
權利要求
1. 一種慶大霉素B的生產工藝，其特征在于包括以下步驟1、1原生質體的制備將活化好的小諾霉素菌種201-9#和201-65#接種在菌絲生長培養基中，201-9#和201-65#由小諾霉素菌種經自然選育而得，其重量配比為麩皮1.5-2％，可溶性淀粉(C.P)1.0％，MgSO4(C.P)0.05％，KNO3(C.P)0.1，天冬素0.002％，K2HPO4(C.P)0.03％，NaCl(C.P)0.05％，CaCO3(C.P)0.1％，瓊脂2.0％，pH調至7.5，蒸餾水配制；培養基制備用不銹鋼鍋裝好要配體積的蒸餾水，留出一部分拌料用，先將麩皮煮開，再把稱好的瓊脂放入鍋內溶解；把原料按上述比例稱好，放入小燒杯內，CaCO3單獨后放，用留下的一部分水把原料溶解到入鍋內，邊倒邊攪拌；用6N的NaOH調pH至7.5后，加入CaCO3攪拌均勻后分裝；裝量50ml-60ml/250ml茄子瓶或20ml/28×200mm大試管，加棉塞，包好后消毒；消毒后，冷卻，即可擺斜面，待凝固后，于35-37℃恒溫箱過夜后備用接種；斜面制備用無菌接種棒取砂土孢子，用劃線法接種于已消毒制備好的斜面培養基中，涂勻后，塞好棉塞，用紗布牛皮紙包瓶口后，于37℃培養10天，取出放入冰箱4-5℃下保存備用；搖瓶配比為淀粉1％，黃豆餅粉1.0％，葡萄糖(C.P)0.1％，CaCO30.5％，蛋白胨0.2％，KNO3(C.P)0.05％，氯化鈷10γ/ml，玉米粉1.5％，過濾水配制，pH7.7將上述培養基配制好后，裝入500ml三角瓶中，裝量50ml左右/瓶，在1.05kg/cm2121℃下滅菌30分鐘，冷卻備用；在無菌室超靜工作臺內用無菌接種針挖取斜面孢子約0.5cm2于三角瓶中，在旋轉式240-250轉/分搖瓶機上35℃±0.5℃培養130～144小時，放瓶，測效價、組分；其中菌種201-9#小諾霉素組分50％，搖瓶效價1085μ/ml，201-65#小諾霉素組分55％，搖瓶效價1130μ/ml；培養基的配方按重量百分比為淀粉3.5％-4％，黃豆餅粉3.0％-3.5％，葡萄糖0.3％-0.5％，玉米粉1.5％-2.0％，蛋白胨0.15％-0.2％，魚粉0.2％-0.4％，硫酸銨0.01％-0.05％，硝酸鉀0.005％-0.01％，碳酸鈣0.4％-0.5％，氯化鈷8mg/ml-10mg/ml，其PH7.5-7.8；振蕩培養60～65小時，離心收集菌體，用10％-12％蔗糖溶液洗滌后，加濃度14mg/ml-16mg/ml溶菌酶37℃±0.5℃下水浴酶解，鏡檢至大量原生質體形成；1、2融合將201-9#和201-65#原生質體懸液按等量混合，再加入聚乙二醇，25℃±1℃室溫下振搖1-2分鐘，再放置1.5～2小時，取0.1-0.2ml/皿涂布在再生平皿，35℃±1℃倒置培養至長出菌落，其中一菌落為紅色，對該菌株進行組份和搖瓶效價測定，該菌株含有慶大霉素B組份，再對這一菌株進行自然選育，獲得慶大霉素B含量高的優質菌株，并做穩定性實驗，傳5代證明其穩定性良好，將此菌株命為JYGB-01；1、3慶大霉素B的制備37℃±0.5℃下慶大霉素B沙土孢子培養10天得母斜F1，再在37℃±0.5℃下進行孢子培養9天得子斜F2，在35℃±1℃左右一級種子罐培養50hr，得一級種子培養液，34℃±1℃二級種子罐培養24hr得二級種子培養液，34℃±1℃下發酵80～85hr，發酵液中加入6N濃度H2SO4調整pH至2.0左右，在酸化液中再加入2NNaOH中和至pH6.8左右，得中和液，用732NH4+(Na+)型樹脂攪拌下靜態吸附5～6hr進行離子交換，飽和樹脂離心分離以除去異物，對飽和樹脂裝柱7％HCl及NH4Cl、去離子水洗至無Cl-，再用0.5N氨水解吸后解吸液711-OH-型脫色，對脫色液薄膜濃縮，所得濃縮液，繼續用活性碳脫色過濾，吸附型大孔樹脂分離、濃縮，采用溶媒剃度解析，先后得到GMB、GMC1a和GMC2b，精制后即可得到組份含量≥90％，可供合成異帕米星用。
2、根據權利要求1所述的慶大霉素B的生產工藝，其特征在于 一級種子罐 培養基按重量配比為淀粉1.0%，黃豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖0.5%， 碳酸鈣0.4%，魚粉O. 1%，蛋白胨0.2%，硝酸鉀0.05%，淀粉酶碳源量O. 15%， 消沫油450ml/120L。
3、 根據權利要求1或2所述的慶大霉素B的生產工藝，其特征在于二級種 子罐培養基配比為淀粉2.0%，黃豆餅粉1.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖0.5%， 碳酸鈣0.4%，魚粉0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸鉀0.02%，淀粉酶碳源量O. 15%， 氯化鈷2mg/ml，泡敵O. 2%。
4、 根據權利要求1或2所述的慶大霉素B的生產工藝，其特征在于發酵罐 培養基配比為淀粉4.0%，黃豆餅粉3.5%，玉米粉1.5%，葡萄糖0.2%，碳酸 轉0.5%，魚粉0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸鉀0.01%，硫酸銨0.05%，淀粉酶碳 源量O. 2%，氯化鈷8mg/ml，泡敵0. 3%。
全文摘要
本發明公開了一種慶大霉素B的生產工藝，通過對小諾霉素的產生菌(棘孢小單孢菌)進行選育，采用細胞原生質體融合技術，選出一個慶大霉素B為主要組份的新菌株。本發明公開的慶大霉素B的生產工藝的優點在于縮短了整個生產周期；提高了慶大霉素B的純度，生產出的慶大霉素B的純度由原來的85％提高到現在的90％。降低了生產成本，極大地提高了慶大霉素B的生產能力。
文檔編號C12P19/48GK101250571SQ20081007084
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月27日 優先權日2008年3月27日
發明者付志綱, 吳龍江, 威 張, 張良棟, 熊興生, 青 王, 趙鷹英, 俊 黎 申請人:江西制藥有限責任公司