專利名稱：一株產較高熱穩定性重組β-葡聚糖酶的基因工程菌及其構建的制作方法
一株產較高熱穩定性重組P -葡聚糖酶的基因工程菌及其構建技術領域一株產較高熱穩定性重組P -葡聚糖酶的基因工程菌及其構建，本發明涉及淀粉液化芽胞桿菌P-l,3-l,4-葡聚糖酶基因的定向進化，屬于基因工程技術領域。 技術背景P-葡聚糖是構成禾本科植物細胞壁的一種非淀粉性多糖，在大麥、黑麥、 高梁、大米和小麥的胚乳細胞壁中含量尤其高。(3-葡聚糖可以很大的分子量溶 解于水中，其濃度越大，溶液的粘度也就越大，這在以大麥為主要原料的啤酒 工業中會造成過濾速度和原料利用率降低，成品啤酒的非生物穩定性下降，在 畜牧業中用麥類飼料喂養禽畜的時候會造成消化液粘度增大，養分的吸收效率 降低，甚至會造成某些消化道疾病。通過添加可降解(3-葡聚糖的P-l，3-l,4-葡聚 糖酶，便可以有效消除這個不良因子。自然界高產卩-葡聚糖酶的微生物主要來自芽胞桿菌屬，但其酶屬于中溫酶， 耐熱性一般較差，這限制了其在釀酒和飼料工業中的應用，需要對其進行改造 提高其耐溫性。近些年興起的易錯PCR技術為定向改造|3-葡聚糖酶提高其耐溫 性提供了新的途徑，國內外目前尚無對淀粉液化芽胞桿菌(3-葡聚糖酶基因定向 進化的報道。
發明內容
本發明的目的構建一株可表達耐溫性相比原菌株好的(3-l,3-l,4-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，并提出構建的方法。本發明的技術方案通過易錯PCR技術，定向改造高產P-葡聚糖酶的芽胞 桿菌菌株(萬a"7/w amy/o//^e/ac/era ) SYB-001的卩-l，3-l,4-葡聚糖酶基因，將 其整合到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中,轉化^^/zeWc/7/a co/z'BL21(DE3)得到重 組子，構建重組子文庫，經篩選，最終得到一株可以產較高熱穩定性重組酶的 突變株。淀粉液化芽孢桿菌(萬ac/〃ws amy/o/z々we/ac/e"s) SYB-001 巳在ZL. 200510038488.8公開，
公開日2005年10月19日。一株產較高熱穩定性重組e-葡聚糖酶的基因工程菌，其分類命名為大腸埃 希氏菌(￡. co//BL21(DE3)-pET28a(+)-6gW)，已保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏編碼為CGMCCNo.2741。CGMCC No.2741基因工程菌的構建，從淀粉液化芽孢桿菌^"7/m awy/o/^we/a"'msSYB-001提取染色體DNA作模板，進行易錯PCR擴增，引物PAG1畫F: 5，畫ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3，PAG1畫R: 5，-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3 ，易錯PCR體系0.5mLPCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩沖液5 (iL; 100 MgCl2 2 jiL; 1.0 mol/L MnCl2 2 (iL; 2.5 mmol/L dATP和dGTP各0.1 (oL; 2.5 mmol/L dTTP和dCTP各0.4 |xL; 25 pmol/L上下游引物各1 ^L;模板DNA2 ^L; Taq酶0.6jiL;加雙蒸水至總體系50 ^L;易錯PCR擴增條件94 'C預變性3 min; 94變性50 s、 56 °。退火45 s、 72°C 延伸1 min， 30個循環；將其用S"wH I和^7zo I酶切后連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，得到重 組載體pET28a(+)-6g/，用CaCl2法轉^U. co//BL21(DE3)得到重組大腸埃希氏菌 (￡. co/亂21(DE3)-pET28a(+)-妙l) CGMCC No.2471。(3-葡聚糖酶活力測定方法精確吸取待測稀釋酶液0.5 mL，及pH6.5磷酸 二氫鈉一磷酸氫二鈉緩沖液1.0 mL，置于40 。C水浴預熱5 min，加入經預熱的 1.0。/。卩—葡聚糖溶液0.5mL，立即開始計時，于40。C水浴精確反應10min，立 即加入3.0mLDNS液終止反應，然后置于沸水浴中7 min，取出迅速冷卻后加 入10mL去離子水，搖勻后，測定550nm下的反應液的吸光值。同時進行空白 對照測定，其步驟為吸取待測稀釋酶液0.5mL，加入1.0mLpH5.0磷酸氫二鈉 一檸檬酸緩沖液，然后先加入3.0mLDNS液使酶失活，40'C水浴預熱，再加入 同樣經預熱的1.0。/。p—葡聚糖溶液0.5mL， 40。C水浴10min，然后置于沸水浴 中7min，以后步驟同于樣品測定。本發明的有益效果本發明采用易錯PCR技術擴增高產3 -葡聚糖酶的淀粉 液化芽胞桿菌(丑a"7/w am少/o/z々we/ac/era) SYB畫001(ZL.200510038488.8)專利 菌株(3-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列，向其中隨機引入突變，將改造 后的基因插入到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，轉化^sc/2^/c/^ co// BL21 (DE3): 構建重組子文庫，經篩選，最終得到一株可以產較高熱穩定性重組酶的大腸埃 希氏菌(￡. co//BL21(DE3)-pET28a(+)-6g/n) CGMCCNo.2741 。結果顯示，經 篩選獲得的CGMCC No.2741在LB培養基中用異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG) 誘導表達，經酶學性質分析，CGMCCNo.2741最適溫度為55。C，在50-55。C下 較穩定，各比出發菌SYB-001提高5'C。 生物材料樣品保藏一株高產P-葡聚糖酶的重組大腸桿菌，該菌株為大腸埃希氏菌，命名為E co//BL21(DE3)-pET28a(+H^/n，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.2471，保藏日期為2008年4月29日。
具體實施方式
以下實施例更為詳細地解釋了本發明的技術關鍵點，為更好地理解本發明提供了依據。 實施例l1) 從淀粉液化芽孢桿菌5a"7/w "wy/o/z々we/""'e/M SYB-001提取染色體DNA 作模板，進行易錯PCR擴增，引物-正向引物PAG1-F: 5,-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3，反向引物PAG1國R: 5，-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3' 0.5 mL PCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩沖液5 ^L; 100 mol/L MgCl2 2 1.0 mol/L MnCl2 2 2.5 mmol/L dATP和dGTP各0.1 pL; 2,5 mmol/L dTTP和dCTP各0.4 jiL; 25 ^mol/L上下游引物各1 jxL;模板DNA2 (oL; Taq酶0.6pL;加雙蒸水至總體系50 pL。按下列程序進行易錯PCR擴增94 °C 預變性3min; 94""C變性50s、 56T:退火45s、 72 。C延伸1 min， 30個循環。2) PCR產物經1%瓊脂糖電泳分離，回收700 bp左右的片段，用BamH I 和WoI酶切，連接表達載體pET28a(+)，轉化co//BL21(DE3)，涂布抗性平 板，構建重組子文庫。3) 對獲得的重組子進行篩選，選出表達的重組酶耐溫性較好的菌株 結果顯示，經篩選獲得一株產耐溫性較好的重組(3~1，3-1,4-葡聚糖酶的菌株，在LB培養基中用異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達，對獲得的重組酶的 酶學性質研究表明其最適溫度為55t:,在50-55 'C下較穩定，比原出發菌各提高 5 。C。
權利要求
1. 一株產較高熱穩定性重組β-葡聚糖酶的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt1)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編碼為CGMCC No.2741。
2. 權利要求1所述CGMCC >10.2741基因工程菌的構建，其特征是，從淀粉 液化芽孢桿菌^a"7/ws am_y/o/z々we/ac/ms SYB-001提取染色體DNA作模板，進行 易錯PCR擴增，引物PAG1-F: 5,-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3， PAG1 -R: 5 ，-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG陽3' 易錯PCR體系0.5mLPCR管中按順序加入以下試劑10xPCR緩沖液5)iL; 100 MgCl2 2 1.0 mol/L MnCl2 2 |iL; 2.5 mmol/L dATP和dGTP各0.1 |liL;2.5 mmol/L dTTP和dCTP各0.4 pL; 25 (xmol/L上下游引物各1 pL;模板DNA2pL; Taq酶0.6iiL;加雙蒸水至總體系50 ^L;易錯PCR擴增條件94 。C預變性3 min; 94變性50 s、 56 。C退火45 s、 72°C延伸1 min， 30個循環；將其用SamH I和Jt7zo I酶切后連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，得到重組載體pET28a(+)-6g/，用CaCl2法轉化五.co" BL21(DE3)得到重組大腸埃希氏菌 (￡. co//BL21(DE3)-pET28a(+)-Zj^l) CGMCC No.2471 。
全文摘要
一株產較高熱穩定性重組β-葡聚糖酶的基因工程菌及其構建，屬于基因工程技術領域。本發明采用易錯PCR技術擴增高產β-葡聚糖酶的淀粉液化芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001(ZL.200510038488.8)專利菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的開放閱讀框序列，向其中隨機引入突變，將改造后的基因插入到大腸桿菌表達載體pET28a(+)中，轉化Escherichia coli BL21(DE3)，構建重組子文庫，經篩選，最終得到一株可以產較高熱穩定性重組酶的突變株大腸埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1)CGMCC No.2741。經酶學性質分析，CGMCC No.2741最適溫度為55℃，在50-55℃下較穩定，各比出發菌SYB-001提高5℃。
文檔編號C12N15/56GK101280290SQ20081010804
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月13日 優先權日2008年5月13日
發明者劉春鳳, 崎 李, 李永仙, 鄭飛云, 顧國賢 申請人:江南大學