專利名稱：：來源于小金海棠的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物啟動子及其應用，特別是涉及一種來源于小金海棠的啟動子及其應用。
背景技術：
：啟動子是基因表達調控因子中最重要的因子，它基本決定一個基因是否表達、何時表達和何處表達。按作用方式和功能，啟動子大體可以分為組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型啟動子三大類[王關林，方宏筠，2002，植物基因工程原理與技術(第二版)，北京，科學技術出版社]。這種分類方式基本上反映了不同類型啟動子各自的功能特點，但在某些情況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性。誘導型啟動子(induciblepromoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化學和生物信號(統稱為"誘導子"或"誘導因子")的刺激下，可以大幅度地增加轉錄水平。其特征為，該類型啟動子控制的基因在沒有誘導因子存在的條件下不表達或者只有非常低的表達(也稱為"本底表達")，但一旦受到誘導因子的誘導，基因的表達量迅速并且大幅度增加。誘導型啟動子常常根據其誘導信號來分類和命名，例如激素誘導啟動子[XuD等，1993，PlantMolBiol，22(4):573-588;TaylorJE等，1995,PlantJ,7(1):129-134]、化學誘導啟動子(WilliamsS等，1992，Biol/Technol,10:540—543;綜述見PadidamM，2003，CurrOpinioninPlantBiol,6169-177)、光誘導啟動子[SheenJY等，1987，PlantMolBiol,8(3):227-238;MatsuokaM等，1994，PlantJ，6(3):311-319]、熱誘導啟動子[Schoff1F等，1989，MolGenGenet，217(2-3):246-53]、創傷誘導啟動子[FarmerEE等，1992,PlantCell,4:129-134;CarreraE等，1998，PlantJ，15(6):765-771]、真菌誘導啟動子(FukudaY等，1994，PlantMolBiol,24(3):485-493)和共生細菌誘導啟動子(MiaoGH等，1993，PlantCell,5:781-786)等。誘導型啟動子往往也多少具有器官和/或組織特異性，例如煙草水楊酸誘導啟動子PR-la主要驅動基因在葉片中表達(UknesS等，1993，PlantCell,5:159-169)。三價鐵還原酶(FerricReductase,FRO)是雙子葉植物和非禾本科單子葉植物應答鐵脅迫的關鍵酶之一，其主要作用是將根表皮細胞質膜上的Fe、螯合物還原成Fe2+，并通過二價鐵轉運蛋白跨膜轉運到細胞質中(Bienfait，1985，JournalofBioenergeticsandBiomembranes,17:73-83)。目前已從玉米(PaoloBandPaoloP,1995，JournalofExperimentalBotany,46:1497-1503)、豌豆(Watersetal.,2002，PlantPhysiol.，129:85-94)、番茄(Lietal"2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)、擬南芥(Wuetal.,2005，PlantCellPhysiology,46(9):1505-14)、水稻(Ishimaruetal.，2006，PlantJournal,45(3):335-346)、黃瓜(Watersetal"2007,PlantphysiolBiochem.,45(5):293-301)等物種中克隆得到了基因。在擬南芥基因組中，三價鐵還原酶FRO是一個多基因家族，由八個基因編碼。盡管各FRO基因在序列上具有很高的同源性，但由于上游調控序列的差異使得各成員具有特異的時空表達模式(Wuetal"2005，PlantCellPhysiol"46(9):1505-14;Mukherjeeetal"2006，Planta,223(6):1178-90)。在對FRO同源基因的時空表達研究中發現，在不同植物中其表達模式有所不同。番茄Zei^(97在根、葉、花、子葉和幼果中均有表達；但丄eFi(9/在根部隨缺鐵處理時間的增加表達加強，而在葉片中穩定表達、不受缺鐵脅迫的誘導(Lietal.,2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)。豌豆i^F70/基因在根和葉片中均受缺鐵脅迫誘導表達(Waterseta1.,2004)。擬南芥中j^702和」^T05在根中表達，AFi05主要在新梢表達，v4^7(96和^Wi07則主要在綠色組織里表達(Mukherjeeetal.，2006,Planta,223(6):1178-卯)。這些差異不僅反映了植物各組織器官在鐵的吸收、分配和利用過程中的分工與合作關系，也反映了植物在長期的進化過程中為了適應不同的環境而產生的啟動子序列的差異。
發明內容本發明的目的是提供一種來源于小金海棠的啟動子。本發明所提供的啟動子，是至少含有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和3'端延長，長度為259至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為281至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為387至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為442至1174bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為641至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為768至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子為至少含有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長，長度為999至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動子，它的核苷酸序列優選為下述序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列；3)自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列；4)自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列；5)自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列；6)自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列；7)自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列；8)自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列；9)與1)-8)中任意所述的核苷酸序列具有90%或90%以上同源性并且具有啟動子功能的核苷酸序列；7)與具有l)-8)中任意所述的序列的核苷酸在嚴格雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。序列表中序列l，由1738個核苷酸組成；自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸為光響應元件G-Box，自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸為生長素應答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428一1431位核苷酸為銅元素響應元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸為TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸為CAAT-Box。含有上述啟動子的表達盒、重組表達載體、工程菌和轉基因細胞系均屬于本發明的保護范圍。本發明的啟動子可以利用現有分子生物學的方法構建控制功能基因表達的表達載體，如瞬時表達載體pFul(圖譜如圖2所示)。本發明的啟動子可以在缺鐵誘導下表達，通過構建的表達，載體轉入植物中可在植物中控制目的基因，如三價鐵還原酶基因的表達，從而提高植物應答鐵脅迫的能力等。圖1為啟動子全長的PCR擴增結果圖2為瞬時表達載體pFul的物理圖譜圖3為pFul構建示意圖圖4為pFul及Ful的5'端缺失突變啟動子表達載體(pDl-7)的瞬時表達結果圖5為植物表達載體pFul-zh的物理圖譜圖6從pFul上游缺失序列的植物表達載體構建示意圖圖7為Ful啟動子的在正常供鐵和缺鐵條件下的表達檢測結果具體實施例方式實施例l、小金海棠月W基因啟動子的獲得蘋果屬小金海棠是一種鐵高效基因型(Hanetal.，1995,ActaHorticulturaeSinica,22(4):313-317)，本發明的發明人已經從小金海棠上克隆到1個三價鐵還原酶基因即小金海棠月W基因。該小金海棠月W基因在根及葉片中均受缺鐵脅迫誘導而加強表達。根據其序列克隆其上游的啟動子序列。具體方法如下一、基因組DNA酶切產物與接頭序列的連接采用CTAB法，以lg小金海棠葉片為材料，提取小金海棠的總DNA，用BamHI酶切基因組DNA(100-200ul體系)，參照TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit回收酶切產物并與相應Saw3AI接頭連接16-20h。用lOul蒸餾水溶解連接產物，置-2(TC冰箱保存備用。二、染色體步移法擴增小金海棠FiW基因啟動子(Ful)1、第一次巢式PCR根據小金海棠/^W基因組序列設計第一對巢式引物SI-1和S2-l。引物Sl-1:5'-AGCAGAGCAACTTCTCCTGCCACATTCG-3';引物S2-1:5，-TGATTAGTGCTCCCCCAATAGACTACG-3'。(1)第一輪擴增以步驟一獲得的連接產物為模板，引物SI-1和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接頭引物CI為引物，進行第一輪擴增。引物Cl:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA。擴增體系為以步驟一獲得的連接產物8.75ul(lug)，10XLABufferII(Mg2+Plus)1.25ul，M腦L47^0.5ul，dNTPMixture(10mM)0.5ul，引物CI0.25ul(10-15ng),引物S1-10.25ul(10-15ng)，加水至12.5ul。PCR程序為94。C熱啟動3min;94。C預變性3min;94。C變性30s，66。C退火2min;72。C延伸4rain，5個循環；94。C變性30s，55。C退火2min;72。C延伸4min，30個循環；72。C延伸10min。(2)第二輪擴增將步驟(1)的PCR產物稀釋100倍，以此作為模板。以S2-1和C2為引物，進行第二輪擴增。引物C2:CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA。擴增體系為步驟(1)的PCR產物稀釋液，肌，10XLABufferII(Mg2+Plus)2.5叱，7^*araWA《1PL，dNTPMixture(lOmM)1HL，引物C20.5化(25-30ng)，引物S2-10.5叱(25-30ng)，加水至12.5ul。PCR程序為:94。C預變性3min;94。C變性30s，69。C退火2min;72。C延伸4min，5個循環；94。C變性30s，59。C退火2min;72。C延伸4min，30個循環；72。C延伸10min。2、第二次巢式PCR步驟l的產物克隆測序后，根據其靠近5'端的序列設計第二對巢式引物Sl-2和S2-2。引物S1-2:5，-AATGCAAAAGTGAACTGGTAATGTGAAGGC-3';引物S2-2:5'-AAACCAAATAGAGGTCATTGGAGATGCCGA-3';以步驟一獲得的連接產物為模板，進行第二次巢式PCR。(1)第一輪擴增以步驟一獲得的連接產物為模板，引物S1-2和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接頭引物Cl為引物，進行第一輪擴增。其中擴增體系和擴增程序同步驟l的步驟(1)。(2)第二輪擴增將步驟(1)的PCR產物稀釋100倍，以此作為模板。以S2-2和C2為引物，進行第二輪擴增。其中擴增體系和擴增程序同步驟2的步驟(2)。3、擴增啟動子全長序列步驟2的步驟(2)的產物測序、比對、拼接后，通過染色體步移的方法獲得總長約3.2kb的小金海棠FiW基因啟動子序列。設計一對特異性引物ps4和引物prl，擴增啟動子全長序列，即其中1738bp的片段。引物ps4:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC—3，；引物prl:5，—CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC—3，。反應體系為小金海棠總DNA，肌(0.05-0.lug)，10XPyrobestBuffer(Mg2+Plus)2.5叱，7aAaraPyrobest0.6叱，dNTPMixture(10mM)0.5叱，引物ps4(50-60ng)，引物prll叱(50-60ng)，加水至25叱。PCR程序為:94。C預變性3min;94。C變性30s，56。C退火30s;72。C延伸3min30s，IO個循環;94。C變性30s，54。C退火30s;72。C延伸3min30s，20個循環;72。C延伸7min。然后在上述反應液中加入dATPlul，Taq酶O.5ul，72。C延伸30min。上述擴增得到1738bp左右的產物，將其進行T-A克隆測序，結果表明，該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，即小金海棠尸yW基因的啟動子，將其命名為Ful。擴增產物的電泳圖如圖1所示，泳道1為DL2000Marker,泳道2為D1，泳道3為Ful。將小金海棠尸V^基因的啟動子(Ful)的轉錄起始位點用McPromoter軟件進行預測。擬南芥FRO家族8個成員(除AtFR06以外)和Ful中潛在的順式元用PLACE軟件和PlantCARE軟件進行分析。網址如下McPromoterhttp:〃tools.genome,duke.edu/generegulation/McPromoter厶PLACEhttp://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html;PlantCAREhttp://bioinfonnatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/;通過McPromoter在線預測了小金海棠尸^基因的轉錄起始位點，表明其可能位于自序列表中序列1的5'端第1563位的堿基T。通過PLACE和PlantCARE預測得出自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸為光響應元件G-Box,自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸為生長素應答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428—1431位核苷酸為銅元素響應元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸為TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸為CAAT-Box。實施例2、小金海棠FRO基因啟動子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動子的功能驗證根據實施例l獲得的Ful啟動子全長序列，設計引物構建5'端缺失突變啟動子，并驗證它們的啟動子功能。1、以Ful啟動子全長序列或5'端缺失突變啟動子啟動GFP表達的重組表達載體的構建1)Ful啟動子全長序列啟動GFP表達的重組表達載體的構建將實施例1中的步驟二的步驟3獲得啟動子(Ful)pMD19-T載體連接，測序鑒定，將鑒定表明含有Ful啟動子片段的重組載體命名為pT-Ful。用Sphl和BamHI酶切pT-Ful，回收含有Ful啟動子片段的酶切片段，連接到經Sphl和BamHI消化去除了35s啟動子和NFS2片段的pBI221載體片段(原pBI221載體含有35s啟動子和一個NFS2基因片段，并帶有一個GFP基因位于BamHI位點一側)上，測序鑒定，將鑒定表明含有Ful啟動子片段和其下游連接的GFP基因的重組表達載體命名為pFul(pFul的構建流程圖如圖2所示)，pFul中GFP基因只能在Ful啟動子的驅動下表達。2)Ful5'端缺失突變啟動子啟動GFP表達的重組表達載體的構建設計擴增Ful5'端缺失突變啟動子的上游引物，分別與引物prl-5'-CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC-3'組成引物對，分別擴增Ful5'端缺失突變啟動子。引物序列如下所述Psl:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列(即序列8)的片段的引物對，)；Ps3:5'-CTAGAATGTTAATAGGGTCAACT-3，(與prl組成擴增具有自序列表中序列l的5'端第967—1734位核苷酸序列(即序列7)的片段的引物對，)；prol:5'-CATTGGAAGGAACACTGAGA-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列(即序列6)的片段的引物對，)；pro2:5'-TCACCCGGCCTTCACATTAC-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列(即序列5)的片段的引物對)；pro3:5'-ATAAGGGCGACCTCAAGTC-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列(即序列4)的片段的引物對)；Pro4:5'-AAAAGGCTATTTCCACGACT-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列(即序列3)的片段的引物對)；pro5:5'-ACCTCACAATAGAGCAACCG-3'(與prl組成擴增具有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列(即序列2)的片段的引物對)。分別將以上述引物Psl、Ps3、prol、pro3、Pro4或pro5與prl組成的引物對為引物，以pT-Ful為模板，進行PCR擴增，擴增Ful5'端缺失突變啟動子，并對擴增的片段與pMD19-T連接，組成重組表達載體，并進行測序，將測序鑒定表明含有自序列表中序列8的核苷酸序列的重組表達載體命名為pT-Dl，將該自序列表中序列8的核苷酸序列所示的啟動子命名為Dl;將測序鑒定表明含有自序列表中序列7的核苷酸序列重組表達載體命名為pT-D2，將該自序列表中序列7的核苷酸序列所示的啟動子命名為D2;將測序鑒定表明含有自序列表中序列6的核苷酸序列重組表達載體命名為pT-D3，將該自序列表中序列6的核苷酸序列所示的啟動子命名為D3;將測序鑒定表明含有自序列表中序列5的核苷酸序列重組表達載體命名為pT-D4，將該自序列表中序列5的核苷酸序列所示的啟動子命名為D4;將測序鑒定表明含有自序列表中序列4的核苷酸序列重組表達載體命名為pT-D5，將該自序列表中序列4的核苷酸序列所示的啟動子命名為D5;將測序鑒定表明含有自序列表中序列3的核苷酸序列的重組表達載體命名為pT-D6，將該自序列表中序列3的核苷酸序列所示的啟動子命名為D6;將測序鑒定表明含有自序列表中序列2的核苷酸序列的重組表達載體命名為pT-D7，將該自序列表中序列2的核苷酸序列所示的啟動子命名為D7。將上述測序表明正確的含有上述引物擴增的Ful的5'端缺失突變啟動子的重組表達載體pT-Dl、pT-D2、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6或pT-D7分別經印/zI和5函HI酶切，回收擴增的Ful5'端缺失突變啟動子片段(Dl、D2、D3、D4、D5、D6或D7)，分別與Sp/zl和BamHI消化后去除了35s啟動子和NFS2片段的pBI221載體片段連接，篩選得到重組表達載體，將重組表達載體分別進行測序鑒定。將測序鑒定表明含有D1和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pDl(pDl中GFP基因只能在D1的驅動下表達，如圖3中pDl所示)；將測序鑒定表明含有D2和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD2(pD2中GFP基因只能在D2的驅動下表達，如圖3中pD2所示)；將測序鑒定表明含有D3和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD3(pD3中GFP基因只能在D3的驅動下表達，如圖3中pD3所示)；將測序鑒定表明含有D4和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD4(pD4中GFP基因只能在D4的驅動下表達，如圖3中pD4所示)；將測序鑒定表明含有D5和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD5(pD5中GFP基因只能在D5的驅動下表達，如圖3中pD5所示)；將測序鑒定表明含有D6和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD6(pD6中GFP基因只能在D6的驅動下表達，如圖3中pD6所示)；將測序鑒定表明含有D7和連接于其下游的GFP基因的重組表達載體命名為pD7(pD7中GFP基因只能在D7的驅動下表達，如圖3中pD7所示)。pBI221載體用J力aI和^MH消化后，回收大片段，用Klenow(DNA聚合酶I大片段，補平DNA片段)37度處理半小時，然后用T4連接酶連接。轉化即可得到去除了NFS2片段的對照質粒，將其命名為pD0，pD0中GFP基因的上游去除了NFS2片段并且沒有插入Ful或者它的5'端缺失突變啟動子。2、Ful啟動子及它的5'端缺失突變啟動子控制GFP基因在擬南芥原生質體里的瞬時表達驗證1)擬南芥原生質體的提取和轉化①取4周后抽苔前的擬南芥Co1-0葉片，切成lmm寬的長條，置于甘露醇溶液(稱1.82克D—甘露醇于20ml雙蒸水)中，共切葉片約90片。葉片切條撈出，置于酶解液(含有質量百分濃度為15。/。的cellulaseRIO，質量百分含量為0.30%的MacerozymeRIO，1.09g/L甘露醇(Mannitol)，0.3MKC1，0.3MMES，0.15MCaCl"0.75mM(3-巰基乙醇(p-merc即toethanol)的溶液)中，避光，23°C，40-50rpm搖床上酶解3小時。②將步驟①獲得的擬南芥葉片酶解液用100-200目孔徑的過濾器過濾，收集濾液，置于15ml離心管(直徑約lcm)中，均分為兩管。于4。C，60g，離心15min收集沉淀，即為擬南芥葉片原生質體。③原生質體用冰冷的W5溶液(含有154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKC1，5mMglucose,質量百分含量為0.03%的MES，pH為5.8的溶液)輕柔洗滌，每管4ml，然后在4。C，100g離心lmin。棄上清液，沉淀用冰冷的W5溶液輕柔懸浮，每管4ral，冰上放置30min。然后，于23。C，100g離心lmin，離心強度(brake)設為4-5，棄上清液，每管沉淀用0.5mlMaMg溶液(取lMMgCl2l.5ml，MES0.1g，甘露醇(mannitol)7.3g溶于水中，用KOH調pH二5.6，用水定容至100ml，高壓滅菌)重懸得到原生質體溶液。④分別取約10-20ugpBI221、pDO(對照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質粒于1.5mlEP管中，分別加100ul步驟③中的原生質體溶液。用剪去前端的200ul槍頭輕柔混勻。加入110ulPEG/Ca溶液，輕柔混勻，放置20-30min。⑤加入0.44mlW5溶液，來回顛倒混勻。23°C，lOOg，lmin，brake設為4-5。棄上清，加100ulW5溶液，混勻。再加入900ulW5溶液，混勻。⑥上述混合液體置于六孔板內，23°C，弱光，孵育6-18小時。2)共聚焦顯微鏡觀察和圖像處理將步驟l)得到的轉pDO(對照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質粒的擬南芥原生質體在ZeissLSM510META型共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。用488nmargon-ion激光激發，545nm分光境過濾，505-530nm檢測GFP綠色熒光信號，560nm以上檢測葉綠素自發熒光信號。圖像先經LSM5ImageBrowser(Zeiss)處理，后用AdobePhotoshope8.0軟件系統處理。上述實驗進行了兩次重復實驗，結果如圖4所示，對照pDO轉化的原生質體(圖4中pD0)中的GFP熒光充滿整個細胞質。pBI221中的擬南芥y^。基因是一個位于葉綠體基質的半胱氨酸脫硫酶(L6on等，2002，BiochemicalJournal,366:557-564)，因此對照pBI221中GFP的熒光僅充滿整個葉綠體(圖4中pBI221)。除轉pD3原生質體(圖4中pD3)未出現發出綠色熒光現象外，所有的缺失體轉化原生質體(轉pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質粒的原生質體)GFP均發生細胞質發光現象(圖4中pDl、pD2、pD4、pD5、pD6、pD7)，轉pFul原生質體在細胞膜出現熒光現象(圖4中pFul)，因此推測自序列表中序列1的5'端第967一1093位之間含有潛在的負調控元件。同時，pD7具備轉錄活性，說明自序列表中序列1的5'端第1476—1734位的區域為具備啟動子功能的基本元件，與預測的結果一致。圖4中pFul、pDO、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6、pD7和pBI221中自上而下的四個原生質體圖分別為轉pFul原生質體、轉pDO原生質體、轉pDl原生質體、轉pD2原生質體、轉pD3原生質體、轉pD4原生質體、轉pD5原生質體、轉pD6原生質體、轉pD7原生質體和轉pBI221原生質體的488nmargon-ion激光激發照片，545mn分光境過濾照片，505-530ran檢測GFP綠色熒光信號照片以及560nm以上檢測葉綠素自發熒光信號的照片。實施例2、小金海棠FRO基因啟動子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動子的在轉基因植物中啟動GUS基因的組織特異性檢測1、含有小金海棠FRO基因啟動子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動子與位于其控制之下的下游GUS基因的植物表達載體的構建將實施例l的步驟l獲得的重組表達載體pT-Ful、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6、pT-D7分別用HindIII和BaraHI消化，回收含有小金海棠FRO基因啟動子(Ful)或其5'端缺失突變獲得的啟動子的序列(D3、D4、D5、D6或D7)，插入到pZHOl載體(載體圖譜如圖5所示，其BamHI酶切位點下游有一個GUS基因；Hua-LinZhou，Si-J"ieHe，Yang-RongCao，TaoChen,Bao-XingDu，Cheng-CaiChu,Jin-SongZhangandShou-YiChen.OsGUJl，aputativemembrane-boundendo-1，4-P-D-glucanasefromrice，affectsplantinternodeelongation.PlantMolecularBiology(2006)60:137-151;中國農業大學)的A'/7dlII和ia/fiHI酶切位點之間，進行酶切和測序鑒定。將測序鑒定表明含有自序列表中序列1的核苷酸序列和連接與其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZFul(pZFul中GUS基因只能在具有自序列表中序列1的核苷酸序列的啟動子的驅動下表達，如圖6中pZFul所示)；將測序鑒定表明含有D3和連接于其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZD3(pZD3中GUS基因只能在D3的驅動下表達，如圖6中pZD3所示)；將測序鑒定表明含有D4和連接于其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZD4(pZD4中GUS基因只能在D4的驅動下表達，如圖6中pZD4所示)；將測序鑒定表明含有D5和連接于其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZD5(pZD5中GUS基因只能在D5的驅動下表達，如圖6中pZD5所示)；將測序鑒定表明含有D6和連接于其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZD6(pZD6中GUS基因只能在D6的驅動下表達，如圖6中pZD6所示)；將測序鑒定表明含有D7和連接于其下游的GUS基因的重組表達載體命名為pZD7(pZD7中GUS基因只能在D7的驅動下表達，如圖6中pZD7所示)。2農桿菌轉化及陽性克隆鑒定按照《分子克隆實驗指南》(第三版)所述的方法制備農桿菌感受態細胞。采用凍融法用步驟1制備的質粒pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6或pZD7轉化根癌農桿菌GV3皿。轉化子在含有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEB固體培養基上篩選。挑取平板上的單克隆，接種于YEB液體培養基中，28。C振蕩培養過夜，提取質粒，進行PCR鑒定，將PCR鑒定含有pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6和pZD7的根癌農桿菌GV3101分別命名為GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7。3農桿菌轉化擬南芥1)種植野生型擬南芥Co1-0，到植株長至莖高3cm時，去除其頂生花序，以刺激葉生花序的生長。去除其頂生花序5-7d后可用于轉化，此時葉生花序已長出，其下部的花已經有授粉的出現。轉化前一天要澆透水，剪掉角果和已開的花。2)準備GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7菌液。將GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7分別接種于5mlYEB(含lmg/L卡那霉素和lmg/L利福平)液體培養基中，28'C培養24-36h，以1:50的比例轉接到200mlYEB培養基，搖至OD,為1.2-1.6。然后于6000rpm，15min集菌，沉淀用適量滲透培養基(含有質量百分含量為5%的蔗糖和質量百分含量為0.02%的SilwetL-77)充分懸浮至OD,為0.6-0.8。3)將步驟2)獲得的GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7懸浮液分別倒在一個小燒杯中，分別將取擬南芥植株，將擬南芥植株的花浸入懸浮液中3-5min，保證蓮座葉以上部分浸沒于液體中，浸泡5rain，可見植株上有一層薄膜。將植株橫放避光浸泡16-24h。取出植株，將其放正，綁住松散花芽。培育至結實，收獲成熟種子(T。代)，即得到轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株。4.轉基因純合體的篩選(1)將轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株收獲后的種子分別播種于含50Pg/ml卡那霉素的1/2Ms培養基上。4°。春化2-3天，22'C培養。將抗性植株移至土中生長，成熟后分單株收獲種子(T,代)即得到轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的1\代擬南芥植株。(2)收取的轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株種子分單株同樣在含卡那霉素的選擇培養基上生長，看分離比，挑取接近3:1的轉基因株系分單株收獲種子(T2代)。在T2代觀察轉基因植株的分離情況，挑取接近3:1的轉基因株系繼續種到T3代。分單株將T3種子播種于含卡那霉素選擇培養基上，從T3代的分離情況來推測T2代哪些單株為純合體植株。即得到單拷貝插入的轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的擬南芥純合體株系。將這些純和株系用正向引物pro5和反向引物pr1進行PCR鑒定。篩選得到PCR鑒定陽性的轉GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的擬南芥純合體株系。5、小金海棠i^O基因啟動子的組織檢測1)GUS組織化學染色檢測按照上述方法將pZHOl轉入擬南芥Col-0野生植株獲得PCR鑒定陽性的轉pZHOl擬南芥。將PCR鑒定陽性的轉GV-pZFul擬南芥純合體株系、轉pZHOl擬南芥以及擬南芥Col-0野生植株的種子分別置于MS培養基上萌發生長一周。然后將培養后各取一部分植株按照下述方法進行GUS染色檢測GUS活性，另一部分植株轉移到缺鐵的培養基(不含有鐵素的MS培養基(MS培養基配制時不加鐵成分))上繼續生長，3天后再次檢測GUS活性。上述檢測GUS活性的方法為將植株放入1.5ml離心管中，加入GUS緩沖特異性液(含有50mol/L的磷酸氫鈉緩沖液(pH7.0)，10mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100，2mmol/L鐵氰化鉀，2mmo1/L亞鐵氰化鉀的溶液)浸沒，再加入5%(體積百分比)的GUS染色液，混勻后于37'C溫育過夜，用70%的乙醇脫色后在體視鏡下觀察照相。結果如圖7所示，結果表明，在正常供鐵的培養基(MS培養基)中生長一周(圖7A)及繼續生長3天后(圖7D)的轉GV-pZFul擬南芥植株，GUS染色均不顯藍色，GUS報告基因不表達，此結果與擬南芥Col-0野生植株以及轉pZHOl擬南芥GUS染色的結果相同。將轉GV-pZFul擬南芥同一株系的其他植株轉移到缺鐵的MS培養基上繼續生長3天后再次檢測GUS活性的結果表明，■GUS基因能在根部和地上部表達(GUS染色顯藍色)，而轉pZHOl擬南芥和擬南芥Col-0野生植株在缺鐵培養基上生長后沒有GUS活性(GUS染色不顯藍色)。這一結果表明該Ful啟動子在缺鐵條件的誘導下，啟動GUS基因的表達。圖7中A為MS培養基上萌發生長一周的轉GV-pZFul擬南芥，B為MS培養基上萌發生長一周的轉pZH01擬南芥，C為MS培養基上萌發生長一周的擬南芥Col-0野生植株，D為MS培養基上生長一周后繼續生長3天的轉GV-pZFul擬南芥，E為MS培養基上生長一周后轉移至缺鐵MS培養基中生長3天的轉GV-pZFul擬南。序列表〈160〉8〈210〉1〈211>1738〈212>DNA〈213〉蘋果屬小金海棠(Afa/t^x/aq/!'朋m/s)〈400>1tatgtagccatcatcatcagccatggcacttgatcatttgctgaaa^caatgaggtatat60aatattcatatatttgcatgcaccttcttaattacttactgaaaatcggt120acaccaaatgtcataataataca已gtggttgaat已cttaaaagaaattcaaccttgtatt180atgacatttggtatagcggactgttttgcgcactgaaaatttctccgctcacacatcaca240taatccctctaaactgtaatgtt3tttatgtactatttttggccggagtggccggacgag300ctttcattgtatcaagttgtctttcggtttgaagaaccgtcgttaatcacatgagctctt360agtt肌gttaaaagctatggtaattaactggaatgtttta420ctattgcttactgagtgaagttatgcattagagaattcaataatctatcgcatgtggtccaMaacct已gttegtagatatagggtgttggatttatatccatccgttcctggttcgaaei540ctcttctttcttaa^ttattctaatagttttgaaccctctcctccccttaatgttataaa600tgagatatgaa^tgggcatg660tgcctcctaatcaatgtagttcctagttttacattttgttacggattcacaacctccctc720attttceigtELcccttgttccacaccaatgtgacgttattta^ccgtataa780acttcacaatcag3a^tcgttttttttttatcatcatctaaa&atcat11tttaaagtgc840atattcatttgatgtg8.ctatttagtcattcatatgtgtcga^csa^tcaataattc■tgataacgagtaactacctcatgatgatccatttatgaattctcttgattaagagt33tt960taagatctagaatgttaMaattcagaagtaaagagattaaatacttgga1020tcataaaaga^caaacatatatgtatgcaaatg^ttgggg^tgggC犯3catgtetttta1080tgcc犯ag3CctgcattggaaggaacactgeigertceLgtattcggcatctc1140caatgacctctatttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcactt1200ttgcattcacaatttgtacatcgaaattattcatttatctttatgatttg1260gcttcatatttataatatttataacgtcgtgttttcatta1320gaacgtatctttata^tata^gggcgacctcaagtcaaaaagactctct1380actttgcgcgagtcggggga鄧ggg犯gggggggggg組gtttattgtacacagcttta1440ttcttactttgcasaaaggctatttccacgactcgaacctcaca^tagagcaaccgttcc1500gttacgcc3agactcgaacccatgaatctttatatataaatagcaaatattgtctttttt1560tttctattcaatttacacgtgaattcactgaagatttgacta^gtttatgtttttcattg1620gacaaaMttgta^tsttttcatttcccaaaatcagataaaagttcgtg168017<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>gggggggggga^cgactcg38ctgaagatttcca犯aagttaatgtttattgtacacagctttattcttaccctcacaatagagcaaccgttccgttacgcaaatagcaaatattgtctttttttttctatgactaagtttatgtttttcattggacaaaa3^aa^tca^ga^a^agttcgtgct3aaa^tttgcaaaaacaagactcgatcaMttaca"tttgtaasta^attgcaagctggctatttcccgtgaattcattttcatttc120180240300360<210>5〈211〉442〈212〉腿〈213〉蘋果屬小金海棠(Ma/w;a'"q/7we"^)〈400〉5aa^tgsaataacgtcgtgttttcattaaa3tt犯ga^gaacgtatctttata^tatataa60gggcgacctc犯gtcaaaaagactctctactttgcgcgagtcgggggaaggggaaggggg120ggggg犯tgttt3ttgt:acacagctttattcttactttgca^a^aggctatttccacgac180tcgaacctcacaatagagcaaccgttccgttacgccaagactcgaacccatgaatcttta240tatataaatagcaaatattgtctttttttttctattcaatttacacgtgaattcactgaa300gatttgactaagtttatgtttttcattggacaaaatttgtaaatattttxatttcccaaa360aagttaaaaaatcagataaaagttcgtgctaaaaaMtgcaagctatataaagatatcaa420gcaaacctcttttctatagcag442〈210〉6〈211〉641〈212〉DNA〈213〉蘋果屬小金海棠(M"/w)〈400〉6ttgacaactgcattggaaggaacactgagatcagtattcggcatctccaatgacctctat60ttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcacttttgcattcacaat120ttgtaca犯tgctatattcgaaattatteatttatctttatgatttgtagaataaaggct180tcatatttataatatttgtaacgtcgtgtt11cattaaaatta^g￡Ltg^240cg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