專利名稱：：在轉基因單子葉植物中產生重組胰島素樣生長因子-ⅰ(igf-ⅰ)和胰島素樣生長因子結...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及在單子葉植物中產生哺乳動物，特別是人的蛋白質。通過在轉基因稻中成功產生IGF-I和IGFBP-3加以說明。
背景技術：
：胰島素樣生長因子-I(IGF-I)和胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)是調節細胞和組織的存活、生長和分化的重要蛋白質。人IGF-I是70個氨基酸殘基的單鏈多肽，它由染色體12上的一個基因編碼。它與胰島素原和胰島素具有48%氨基酸序列相同性。IGF-I含有三個鏈內二硫橋鍵，位于A20-B18、A6-A11和A7-B6，但沒有糖基化位點。大部分循環IGF-I在肝臟中合成，并且受生長激素(GH)、胰島素和營養攝取的調節。循環IGF-I水平相對穩定，主要由于其組成型的分泌模式和IGF-I與高親和結合4蛋白的結合。然而，IGF-I調節異常可能在胰島素耐受和其它代謝異常的發生中起到一定作用。IGF-I在糖代謝調節中的確切作用尚不清楚，但在調節代謝中非常重要。在健康志愿者中，重組的人IGF-I(rMGF-I)可行使急性低血糖作用，但rhIGF-I比相同劑量的胰島素的強度低10倍。相反，與胰島素相比IGF-I對蛋白質代謝的作用更明顯，與相同的葡萄糖劑量的胰島素相比，它能降低整體凈氨基酸流。而且，IGF-I是胰腺釋放胰島素的強效抑制劑。在1型糖尿病患者中，使用rhIGF-I導致循環IGF-I水平上升、GH分泌過多的逆轉、胰島素需求下降和血糖控制的改善。在2型糖尿病患者中，需要較高劑量的rhIGF-I來降低禁食后的血漿葡萄糖、胰島素和C-肽水平。此外，rhIGF-I治療與脂肪質量降低相關聯，這可部分解釋上述對胰島素敏感性的有益影響。已鑒定到六種人IGF-結合蛋白。在這六種結合蛋白中，IGFBP-3結合血漿中95%以上的IGF-I。它含有264個氨基酸殘基，計算分子量約為29kD。有三個可能的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)，分別位于IGFBP-3中心區的Asn89、Asn譜和Asnm上，但糖單位似乎對IGF結合并不重要。IGF-I/IGFBP-3二聚體與"酸不穩定性亞基"形成三元絡合物，這能延長IGF-I的半衰期并滴定IGF-I對其受體的供應。IGFBP-3是許多組織中局部產生的40-45kDa的糖蛋白，在這些地方其用作調節細胞生長和凋亡的自分泌和旁分泌調節物。IGFBP-3通過結合IGF抑制細胞增殖和存活，防止它們激活靶細胞上的IGF-I受體。還發現，IGFBP-3能以IGF依賴方式負向調節細胞增殖并誘導凋亡。不存在IGF-I時，IGFBP-3能夠與多種生長抑制性蛋白質和物質如p53、視黃酸、腫瘤壞死因子-a和轉化生長因子-卩相互作用。IGFBP-3的過度表達會抑制細胞增殖并減少腫瘤形成，但對正常器官的生長抑制作用很小。近年來的研究表明，IGFBP-3會抑制乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和結直腸癌，因此IGFBP-3能用作有效的抗癌劑。因此，人IGF-I和人IGFBP-3均有藥用價值。使用IGF-I和IGFBP-3的主要障礙是其生產成本。這些蛋白質主要由微生物，如大腸桿菌(五^/zeWc/n'aco//)重組產生；或者由肉瘤細胞系或紅細胞樣細胞提取和/或在轉基因小鼠中產生。這些系統不適合大規模生產，因為設備和生產成本很高并且可能被病原體污染。IGF-I和IGFBP-3也出現在其他哺乳動物中，起到類似功能。可工程改造植物細胞以接受和表達來自各種生物體的遺傳信息，包括來自原核和真核來源的基因。因為植物細胞是真核細胞，所以它們能夠產生哺乳動物蛋白質，對于合適的蛋白質或酶功能而言常常需要適當的翻譯后修飾(如糖基化、異戊烯化和形成二硫橋)。此外，許多植物的種子是可以食用的，并且可能在種子中富集重組蛋白質。在一些情況下，重組蛋白質可能不需要進一步加工和純化就能口服遞送，只要控制劑量水平和頻率，因為每種蛋白質具有特征性的酸和蛋白酶抗性。可利用遞送運載體如生物包囊和植物組織來防止蛋白質在胃和內臟中降解(Daniell，H.等，7>e"A尸/a""c/.(2001)6:219-226)。已經開發基于種子的平臺，用于藥用蛋白質的生物組裝和生產(Sardana，R.K.，等，rrawg^/c/^.(2002)11:521-531)。他們的結果提示，使用植物種子作運載體通過"種子藥丸(seedaspill)"產生和遞送生物藥品是一種可行的選擇。已經在轉基因煙草中產生重組人IGF-I和重組人IGFBP-3，第五屆香港糖尿病和心血管風險因素東西方交流大會，2003年10月上的三個海報演講中報道了這些結果("在轉基因煙草中表達人胰島素樣生長因子I(IGF-I)和胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)"(ExpressionofHumanInsulin-likeGrowthFactorI(IGFI)andInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3)inTransgenicTobacco));第64屆美國糖尿病協會科學會議，2004年6月("植物作為表達人胰島素樣生長因子I(IGF-I)和胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)的生物反應器，，(PlantsasBioreactorsforExpressingHumanInsulin-likeGrowthFactorI(IGFI)andInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3));和2004年美國植物生物學家協會年會，2004年7月("人胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)在煙草中的轉基因表達"(TransgenicExpressionofHumanInsulin-likeGrowthFactorBindingProtein3(IGFBP3)inTobaccoSeeds))。在煙草植物中產生這些蛋白質無法提供在諸如玉米、稻、小麥和大麥等可食用單子葉植物中產生的優點。單子葉植物也包括諸如甘蔗、菠蘿、椰棗和香蕉等重要的食用作物。這些單子葉植物代表可食用物質的多產來源。每天超過40%的世界人口消耗的稻是世界上農業生產實踐中良好鑒定的，被認為是產生藥用和市售的重要蛋白質和疫苗的模式生物反應器(Fischer，R.6等，rramgem'ciw.(2000)9:279-299)。它不含有害的化學物質，如煙草所含的煙堿和毒性生物堿，并且具有較低的變應原性。稻中重組蛋白質可以占到粒重的1%。使用特異性啟動子和信號序列靶向重組蛋白質在稻胚乳區(至多占全部種粒的9％)中的生產和儲存，蛋白質累積可以提高至粒重的2.7。/。(Liu，Q.Q.，T7zew;sDe/aWme"fo/Ao/ogy(2002)中國揚州大學(YangzhouUniversity)和香港的香港中文大學(theChineseUniversityofHongKong)。一個稻植株可以具有高達IOO個分蘗，產生超過10,000個谷粒，能夠快速生產大量種子和重組蛋白質。此外，快速生長(每年3-4輪)的稻日本亞種可用作生產的生物反應器植物。干燥種子的儲存和銷售很簡單，在室溫下儲存5個月以上后，谷粒中的產率和重組蛋白質活性沒有明顯降低(Stoger,E.，等，尸/a"/Mo/.所o/.(2000)42:583-590)。在水分含量低的條件下，谷粒可儲存3-5年而不損失活性(Huang，N.，所oiVoce^/"fema〃o"a/(2002)1月54-59)。如果蛋白質設計用于家畜，那么在其他谷物，如燕麥中生產可能更合適。以前的研究證明，密碼子使用偏見與基因表達水平強烈相關。高表達的基因優選使用一小組稱為"優化"密碼子的密碼子(Moriyama，E.N.，等，J.Mo/￡vo/(1997)45:514-523)。而且，這些優化密碼子對應于最豐富的tRNA，導致翻譯的準確率和效率提高(Marais，G.，等'JMo/￡vo/:275-280)。在以下實施例中，根據兩種種子貯藏蛋白質所用的植物優選密碼子修飾人IGF-I和IGFBP-3的DNA序列，以便提高這些蛋白質在稻中的產量。選擇來自四菱豆的富含賴氨酸的蛋白質(LRP)和來自捉猴果堅果(Pamdisenut)的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密碼子用法作為修飾基礎，因為在先前的研究中觀察到它們在轉基因擬南芥G4ra&Wo;w的中高表達和穩定累積(LRP和PN2S分別占可提取種子蛋白總量的3-10%和3-15%)。另一種提高以下實施例所用的靶蛋白產率的方案是將重組蛋白質導向特定部位，以防止被細胞的蛋白質水解系統降解。已報道，連接信號肽序列導致內質網(ER)分泌，通常需要作為外來基因的N-和C-末端的ER保留信號的四肽KDEL以便高水平地累積產物(Wandelt，C丄等，尸/a""(1992)2:181-192;和Herman,E.M.等，尸/她(1990)182:305-312)。KDEL四肽通過與高爾基復合物和ER之間循環的受體相互作用，進行蛋白質定位。KDEL信號對于可溶性7蛋白質在植物ER中的累積而言是足夠的(Wandelt，C丄等，同上；Frigerio，L.等，尸/fl^Ce〃(2001)13:1109-1126;禾卩Napier，J.等，尸/awto(1997)203:488-494)。已發現，相對于不含KDEL的構建物，含有KDEL的構建物轉化的細胞中scFv水平為6-14倍(Conrad，U.等，尸/a"ZMo/.5/o/.(1998)38:101-109)。
發明內容本發明提供了兩種重要的哺乳動物蛋白質-IGF-I和IGFBP-3的經濟實用的來源。優選產生人形式。通過在單子葉植物中產生這些蛋白質，本發明第一次提供能夠產生足量的適合人類治療應用或獸醫應用的形式的有用來源。因此，在一個方面，本發明涉及經修飾產生人IGF-I和/或人IGFBP-3的單子葉植物細胞。在另一方面，本發明涉及含有這類細胞的植物或植物部分。附圖簡要說明圖1顯示編碼人IGF-I的核苷酸序列(SEQIDNO:l)，如Jansen，M.等，Atowre(1983)306:609-611所述。圖2顯示編碼人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQIDNO:2)，如Wood，W丄等，Mo/.五"^cn'朋/.(1988)2:1176-1185所述。圖3顯示根據植物中的密碼子優選性修飾的編碼人IGF-I的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。圖4顯示根據植物中的密碼子優選性修飾的人IGFBP-3的核苷酸序列(SEQIDNO:4)。圖5顯示人IGF-I的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。圖6顯示人IGFBP-3的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖7是顯示稻中產生的人IGF-I在L6細胞中造成邊緣波動的能力和這種作用對市售人IGFBP-3的易感性的實驗結果。圖8顯示稻中產生的人IGFBP-3抑制MCF-7細胞生長的有效性。本發明實施方式如下所述，第一次在單子葉植物中產生了兩種重要的人蛋白質IGF-I和IGFBP-3。因為單子葉植物包括主要營養來源且不含有害化合物，所以非常適合產生用于人類治療的蛋白質。它們也非常適合產生用于治療食草性或雜食性哺乳動物的相應蛋白質。通過適當設計包含表達系統的DNA構建物來提高這些蛋白質的產量，所述表達系統具有操作性連接于合適控制序列以便表達的編碼這些蛋白質的核苷酸序列。對植物細胞進行遺傳修飾和重建完整植株的技術已經為本領域熟知一段時間。參見例如，Gelvin等，《植物分子生物學手冊》(TlantMolecularBiologyManual),(1990));Dashek，《植物生物化學和分子生物學中的方法》(MMll^inPlantBiochemistryandMolecularBiology)(CRC出版社，1997)。本領域在這個方面的發展狀態的有用小結可參見2004年1月14日公開的美國專利公開2004/0009476，將該文獻中有關植物遺傳操作的技術內容通過引用納入本文。一旦獲得含有重組構建物的轉化的植物細胞，則可由其重新產生轉基因植物，評價所需蛋白質的產量水平。可利用幾種技術優化非天然核苷酸序列在植物中的表達。如以下實施例的進一步描述，可按照植物細胞中表達的密碼子優選性修飾編碼的核苷酸序列。這種修飾基于描述植物密碼子優選性的公開數據。其次，可延伸編碼核苷酸序列以加入信號和保留序列，并將編碼蛋白質導向內質網并實現保留。這也對產率產生有益的影響。通常，在所需蛋白質的N末端產生信號傳導肽，在其C末端產生保留信號。使用這些技術能顯著提高所需的IGF-I和IGFBP-3的產率。使用合適啟動子實現表達也是有用的。例如，合適啟動子包括35SCaMV、稻肌動蛋白啟動子、泛素啟動子或胭脂堿合酶(NOS)啟動子。提高種子中的產量的組織特異性啟動子包括種子特異性谷蛋白啟動子(GWpr。)，但也可采用其他種子特異性啟動子。也可使用終止信號，例如胭脂堿合酶終止信號。如下所述設計兩組構建物，以驅動植物優化的編碼序列并通過土壤桿菌C4gra^cteWwm)介導的轉化引入稻中。一組構建物僅含有谷蛋白信號肽(SP)，而另一組含有SP以及靶向的四肽KDEL信號。合成這些構建物以提高蛋白質表達并使蛋白質靶向儲存部位，以及提高蛋白質穩定性。利用種子特異性谷蛋白啟動子(G^/pJ驅動IGF-I和IGFBP-3在轉基因稻中的表達，分析轉基因的表達。由轉基因稻谷粒產生的rhIGF-I和rhlGFBP-3有生物活性。也可修飾該構建物以包含純化輔助物，如組氨酸標簽或FLAG序列，和/或包含標記物，如熒光蛋白質，以便隨后進行純化。也可在編碼蛋白質和純化標簽和/或標記物之間工程設計切割位點。如果需要可采用標準的純化技術，或者在某些情況下，可口服給予植物組織，以利用植物的營養價值和其低毒的優點。在1型或2型糖尿病患者中，利用重組產生的IGF-I降低胰島素需求和提高血糖控制水平。IGFBP-3能實施凋亡，并可用于治療惡性腫瘤。因此，加果需要，可將重組產生的蛋白質配制到給予需要用這些蛋白質治療的對象的組合物中。配制蛋白質和其他藥物的通用方法可參見《雷明頓藥物科學》(Remington'sPharmaceuticalSciences),最親jf版，馬克出版公司(MackPublishingCo.),賓夕法尼亞州伊斯頓(Easton，PA)，通過參考納入本文。該蛋白通常通過注射或透皮或跨粘膜遞送途徑以胃腸道外的方式全身給藥，或者在某些情況下可以口服給藥。可使用根據特定給藥方式設計的不同劑型，包括脂質體制劑和含有脂質或聚合物基納米顆粒的制劑等。提供以下實施例是為了說明而非限制本發明。實施例1用IGF-I和IGFBP-3構建物轉化土壤細菌根據兩種種子貯藏蛋白質所用的優選密碼子修飾人IGF-I(圖l)和IGFBP-3(圖2)的DNA序列。選擇來自四菱豆的富含賴氨酸的蛋白質(LRP)和來自捉猴果堅果的富含甲硫氨酸的2S清蛋白(PN2S)的密碼子用法(表1)作為修飾基礎，因為在先前的研究中觀察到它們在轉基因擬南芥C4m&Wo戸W中高表達和穩定累積(LRP和PN2S分別占可提取種子蛋白總量的3-10%和3-15%)。與初始對應物編碼相同氨基酸序列(圖5和6)的經修飾的IGF-I(圖3)和IGFBP-3(圖4)基因由MWG生物技術公司(MWGBiotechnologyCompany)獲得。IGF-I和IGFBP-3的密碼子改變分別為28.6%和14.8%。10表1:根據LRP和PN2S序列優先化的密碼子優選性的小結<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>設計構建物，以提高rhlGF-I和rhlGFBP-3的穩定性和產率，并控制其糖基化。加入兩種蛋白質靶向信號，以將靶蛋白導向稻谷粒的特定部位中，它們或者是谷蛋白信號肽(SP)用于在高爾基體中糖基化，或者是四肽KDEL用于在內質網中穩定累積(無糖基化)。由種子特異性谷蛋白啟動子(GWpJ驅動該表達構建物。嵌合基因構建物的詳情如下，IGF-I:1)(G"pro)+SP+IGF-I*+NOSter2)(G"pro)+SP+IGF-I*+KDEL+NOSIGFBF-3:3)(G"pro)+SP+IGFBP-3*+NOSter4)(G"pro)+SP+IGFBP-3*+KDEL+NOSter其中*表示IGF-I或IGFBP-3的經修飾的cDNA，NOSter表示胭脂堿合酶終止子。將該嵌合基因盒插入超級二元載體pSB130中，并轉化到土壤桿菌菌株EHA105中，該菌株非常適合感染稻愈傷組織。利用簡單的凍融方法來轉化土壤桿菌(如Chen，H.，等，B/o7^c/zm々w^(1994)16:664-668，670所述)。用抗生素潮霉素(50mg/L)選擇轉化的細菌，通過PCR進一步確認靶基因的DNA轉化。實施例2稻的轉化、選擇和培育切開日本稻(/fl;o"/ca)9983成熟種子的盾片，在愈傷組織誘導培養基(N6基礎培養基，2mg/12,4-D，0.5g/l酪蛋白水解，30g/l蔗糖，2.5g/1Phytagef，pH5.8)上培養，以誘導愈傷組織。在愈傷組織誘導培養基中培養4-7天后，衍生自未成熟胚胎的愈傷組織立即用于與含有靶基因的土壤桿菌EHA105共同培養。首先將土壤桿菌接種到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的3mlLB肉湯中，28。C過夜，然后在25mlAB培養基(3g/lK2HP04、1g/lNaH2P04、1g/1NH4C1、0.3g/1MgS04-7H20、0.15g/1KCl、10mg/1CaCl2'2H20、2.5mg/1FeSCV7H20、5g/1葡萄糖、pH7.2)中再次培養5小時，接著離心，并重懸于15-25mlAAM培養基(AA基礎培養基，68.5g/l蔗糖，36g/1葡萄糖，0.5g/1酪蛋白水解物，pH5.2，100|imol/l乙酰丁香酮)。將稻愈傷組織浸入土壤桿菌培養物中，室溫下靜置10-20分鐘，間歇地振蕩。然后，將感染的愈傷組織轉移到含有100pmol/l乙酰丁香酮的N6D2C培養基(N6D2，10g/l葡萄糖，pH5.2)中，26-28。C避光靜置3天。共同培養后，將愈傷組織放置在N6D2S培養基(N6D2，50mg/l潮霉素B，500mg/1頭孢噻肟，pH5.8)上，在26'C避光選擇耐受性愈傷組織2周，接著在新N6D2S培養基中培養，直到出現新形成的耐受性愈傷組織。然后，將耐受性愈傷組織放在HGPR培養基(Higrow稻培養基12(GIBCO-BRL)、50mg/l潮霉素B、200mg/1頭孢噻肟)上，避光靜置7天，并在光照和26"C的條件下靜置7天。預先再生后，將耐受性愈傷組織轉移到MSR培養基(MS基礎培養基、30g/1蔗糖、0.5g/1酪蛋白水解物、2mg/16-BA、0.5mg/1NAA、0.5mg/IKT、pH5.8、50mg/1潮霉素B、500mg/1頭孢噻月虧、2.5g/1Phytagel)中，在26X:和光照的條件下靜置16小時/避光靜置8小時以便再生。出現再生的新芽后，將它們放在1/2MSH培養基(1/2MS大分子鹽(macrosalt)、Fe-EDTA和小分子鹽(microsalt)、MS維生素、30g/1蔗糖、0.5mg/1NAA、pH5.8、50mg/l潮霉素B、500mg/1頭孢噻肟、2.5g/1Phytagef)上以便生根。最后，將轉基因稻苗轉移至土壤中，在溫室中生長。實施例3轉基因稻的分析Southern印跡分析分析轉基因稻植株，以確認靶基因整合到稻基因組中。通過溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)法提取葉基因組DNA(Doyle，J.D.等，Foc^(19卯)12:13-15)。甩BamHI將15嗎基因組DNA消化過夜，在0.8%瓊脂糖凝膠上分離，并利用VacuGeneXL真空印跡系統(法瑪西亞生物科技公司(PharmaciaBiotech))轉移到帶正電的尼龍膜(羅氏公司(Roche))上。按照DIG核酸檢測試劑盒(羅氏公司)所述的方法進行雜交和檢測。利用DIGDNA標記試劑盒(羅氏公司)，通過PCR制備雙鏈DIG-標記的DNA探針(IGF-I和IGFBP-3)。臨用前99。C加熱探針以變性。結果證實，稻基因組中存在該構建物。Western印跡分析通過將種子研磨成粉末并與蛋白質提取緩沖液(50mMTris-HClpH6.8，0.1MNaCl和10%SDS)混合，由成熟的稻種子提取總種子蛋白質。離心后，將澄清的上清液轉移到新的離心管中，儲存為種子總蛋白提取物。然后，在17%TricineSDS-PAGE上分析不同量的總蛋白，并印到PVDF膜上。利用抗-人IGF-I或IGFBP-3多克隆抗體進行Western印跡分析。最后，如AuroraWestern印跡化學發光檢測系統(ICN)手冊所述，用化學發光Starlight底物(ICN)對該印跡進行非放射性檢測。結果證實，種子提取物中存在IGF-I和IGFBP-3蛋白。實施例4稻中產生的rhIGF-I的生物學活性類似于胰島素，IGF-I能引起肌肉細胞的膜邊緣波動和葡萄糖攝入。IGFBP-3可結合于IGF-I形成ALS復合物，該復合物會抑制IGF-I引起的膜邊緣波動作用。稻中產生的重組hIGF-I與胰島素平行檢測，以比較其生物學活性。在成肌細胞單層培養物中培養表達c-myc表位標記的葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的大鼠L6骨骼肌細胞(L6myc細胞)，其培養是在含有1()n/。(v/v)胎牛血清(FBS)和1%(v/v)抗生素-抗真菌藥溶液(100U/ml青霉素G、10mg/ml鏈霉素和25mg/ml兩性霉素B)的a-極限必需培養基中、5%<:02氣氛下、37'C進行的。用0.25%胰蛋白酶消化亞鋪滿的培養物，以便亞培養細胞。為了分化成肌管，將成肌細胞接種到含有2%(v/v)FBS的培養基中，細胞密度約為4x104個細胞/毫升，以便進行自發融合。每48小時更換一次培養基，接種后5-7天使用肌管。然后使大鼠L6肌肉細胞在置入六孔板的25-mm-直徑的蓋玻片上生長至肌管階段。使肌管失去血清3小時，用不同濃度和組合的提取自轉基因稻的rhIGF-I和rhlGFBP-3于37'C處理10分鐘。培育后，肌管用冰冷的3M(v/v)多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，然后用0.1M甘氨酸的PBS溶液洗滌10分鐘，用0.1%(v/v)曲通X-100的PBS溶液通透3分鐘，然后用PBS洗滌。肌管在0.1%BSA中封閉1小時，然后在鬼筆環肽(1:500稀釋于0.1%(w/v)BSA)中培育。培育后，用？88洗滌細胞，加入？『01^1^@不變色溶液中滴在載玻片上。用蔡司(2^53)Axioplan2成像顯微鏡和蔡司LSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡(德國耶拿的卡爾蔡司公司(CarlZeiss，Jena，Germany))檢測樣品。轉基因IGF-I稻的粗蛋白引起L6細胞的膜邊緣波動，該邊緣波動作用可被市售的MGFBP-3顯著降低。這些結果見圖7。如圖7所示，1.25mg和5mg的IGF-1以劑量依賴方式在稻中產生邊緣波動作用。這種活性被12nM濃度的市售IGFBP-3所抑制。實施例5稻中產生的rhlGFBP-3蛋白的抗癌活性人IGFBP-3能抑制雌激素-依賴性和-非依賴性乳腺癌細胞的增殖。為了檢測稻中產生的rhlGFBP-3是否具有抗癌功能，使用MCF-7人乳腺癌細胞。MCF-7人乳腺癌細胞通常在添加有1%青霉素和鏈霉素、0.1%兩性霉素B和5。/。胎牛血清(FBS)的Eagle極限必需培養基中培養，培養條件是37t:和5%C02濕氣氛。對于rhlGFBP-3處理，將MCF-7細胞接種到含有含血清培養基的96孔板中。1天后將不同濃度的由含有rhlGFBP-3的稻轉化體提取的粗蛋白加入細胞中。每3天用新鮮的蛋白質提取物替代粗蛋白提取物，共替換兩次。處理7天后，收集細胞進行MTT測定。簡要說，將20|ilMTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)溶液(5mg/mlMTT的HPBS溶液，pH7.4)加入各孔中，再于37t:培育2小時。將100pl酸化異丙醇加入各孔中，以分解細胞并溶解結晶紫。用微孔板分光光度計測定OD57Q，以確定各孔中的紫色強度。如圖8所示，濃度為1.56mg和3.125mg的稻中產生的IGFBP-3能夠以劑量依賴方式提高對MCF-7細胞的生長抑制作用。實施例6重組產生的蛋白質的純化用親和層析進一步純化前一實施例中所述的粗提取物。將IGF-I和IGFBP-3各自施加于色譜柱，該柱偶聯于各抗體進行進一步純化。通過柱洗滌雜質，通過調節pH和鹽濃度洗提蛋白質。通過修飾實施例1的構建物以包含標記蛋白，以簡化純化過程。實施例7提高重組蛋白產率由實施例2所述的植物獲得種子，再種植產生第二代和第三代作物。實現了重組IGF-I和IGFBP-3的產率提高。權利要求1.一種單子葉植物細胞，其經修飾包含用于表達編碼胰島素樣生長因子I(IGF-I)的核苷酸序列或編碼胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)的核苷酸序列的DNA構建物，其中所述DNA構建物包含操作性連接于控制序列以便在單子葉植物細胞中表達的所述編碼核苷酸序列。2.如權利要求1所述的細胞，其特征在于，所述IGF-I和IGFBP-3是人蛋白。3.如權利要求1或2所述的細胞，其特征在于，所述控制序列包含在單子葉植物種子中可操作的啟動子和在單子葉植物種子中可操作的終止序列。4.如權利要求1或2所述的細胞，其特征在于，所述編碼核苷酸序列在N末端延伸有編碼導致內質網(ER)分泌途徑的信號肽的核苷酸序列。5.如權利要求1或2所述的細胞，其特征在于，所述編碼核苷酸序列在C末端延伸有編碼ER保留信號的核苷酸序列。6.如權利要求1或2所述的細胞，其特征在于，所述細胞是稻細胞。7.—種轉基因植物或植物部分，其包含權利要求1或2所述的細胞。8.—種單子葉植物細胞，其包含IGF4或IGFBP-3。9.如權利要求8所述的細胞，其特征在于，所述K3F-1和IGFBP-3是人1GF-I和人IGFBP-3。10.如權利要求8或9所述的細胞，其特征在于，所述細胞是稻細胞。11.一種植物或植物部分，其包含權利要求8或9所述的細胞。12.如權利要求ll所述的植物部分，其特征在于，所述植物部分是種子組織。13.如權利要求U所述的植物或植物部分，其特征在于，所述植物或植物部分是稻。14.如權利要求13所述的植物部分，其特征在于，所述植物部分是種子組織。15.—嚇在單子葉植物中產生IGF-l或IGFBP-3的方法，所述方法包括培養權利要求1或2所述的植物細胞。16.—種在單子葉植物中產生IGF-I或IGFBP-3的方法，所述方法包括培養權利要求11所述的植物。17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述植物是稻。全文摘要已經在單子葉植物中生產出兩種重要的人類蛋白，即胰島素生長因子I(IGF-I)和胰島素生長因子結合蛋白3(IGFBP-3)。重組產生的蛋白質具有天然形式的已知活性。文檔編號C12N15/82GK101675167SQ200880005298公開日2010年3月17日申請日期2008年2月20日優先權日2007年2月20日發明者P·C·Y·童,張振佳,辛世文申請人:香港中文大學