適于表達用于基因治療的編碼序列的表達載體的制作方法

專利名稱：適于表達用于基因治療的編碼序列的表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于基因治療的表達載體，更特別地涉及包含轉錄調控元件(順式調 控元件或者反式作用元件)新組合的用于基因治療的表達載體，其包括啟動子、增強子、內 含子、非翻譯區(UTR)和基因座控制區(locus control region, LCR)，所述載體能夠支持 靶基因在肝中以高水平持續表達。
背景技術：
肝的功能包括血液儲存、糖轉換和分泌多種細胞因子，以及表達影響許多疾病 (如遺傳的、心血管的、代謝的、血液的和癌性疾病)的基因。已將多種肝特異性疾病(如感 染性肝炎)作為基因治療的靶標進行了研究。肝細胞在形成后擁有很長的壽命，具有大多數病毒基因轉運蛋白的受體而且直接 與血流相連，使其易于接觸藥物，因此肝被認為是基因治療的重要候選器官。血友病是一種由位于X染色體上的因子VIII(FVIII、f8)或因子IX (FIX、f9)基因 的缺陷所引起的退行性出血疾病，依據突變或缺失的基因將其分成血友病A(FVIII缺陷) 或B (FIX缺陷)。對用于治療血友病A或B的藥物，只有當FVIII或FIX以其正常血液濃度 的1-5% (分別為100-200ng/ml和500ng/ml)或更高水平持續表達時，治療效果才是可預 期的。在最近的血友病B基因治療研究中，已報道的是，將帶有人FIX(hFIX)基因的腺相 關病毒(AAV)引入血友病B小鼠模型中導致hFIX蛋白以高達1，500-1，800ng/ml的水平表 達(Snyder，R. 0.，Nat. Med.，5 :64_70 (1999) ；Manno, C. S.，Nat. Med.，12 :342_347 (2006))， 而在血友病B的狗模型中以高達730ng/ml的水平表達hFIX蛋白(Arruda，V. R.，Blood, 105 =3458-3464(2005)) 0然而，當將這種在動物模型中高效表達的載體臨床應用于人患者 時，FIX的血液濃度僅為185ng/ml或更低，這低于有效臨床治療的閾值(500ng/ml)，另外的 難題是在人受試者中的hFIX表達水平不是持續的而是瞬時的(Kay，M.A. ,Nat. Genet. ,24 257-261 (2000) ；Manno，C. S. ,Nat. Med.，12 342-347 (2006)) 在血友病 A 的治療模型中發 現了與上述相似的趨勢。針對遺傳疾病(如血友病)治療的臨床試驗結果表明，首要條件是開發能夠保持 在特定組織(如肝組織)中持續高水平表達治療基因的高效組織特異性表達載體。此外， 逃脫針對載體的體液及細胞免疫應答以及誘導對所表達蛋白的免疫耐受被認為是成功的 基因治療的關鍵因素。例如，為了將正常FVIII或FIX的表達水平提高到有效用于成功的 臨床治療的閾值，還必須考慮的是，注射高劑量的帶有FVIII或FIX基因的病毒并且抑制體 內的免疫應答。然而為使這種方法獲得成功，首先要通過改進表達載體來提高基因表達的 效率。僅在肝中產生的脂蛋白(a)是用于肝組織特異性表達載體開發的另一個重要靶 標。脂蛋白(a)是通過載脂蛋白(a)(—種糖蛋白)與apo B_100(低密度脂蛋白(LDL) 的主要蛋白質組分)結合而形成的(Fless，G.M.，J. Biol. Chem.，261 :8712_8717 (1986))。
4載脂蛋白(a)負責膽固醇的體內轉運，已報道血漿中脂蛋白(a)濃度的提高是動脈硬化 和心臟病的主要風險因子(Armstrong, V. W.等，Arteriosclerosis, 62 :249_257 (1986)； Assmann, G.，Am. J. Cardiol. ,77 :1179_1184(1996))。載脂蛋白(a)含有與纖維蛋白溶酶 原kringle IV和V相似的兩類kringle結構域，以及無活性的蛋白酶樣結構域。眾所周 知的是，具有kringle結構的蛋白質可抑制腫瘤的新血管形成及轉移(Folkman J.，N Eng J Med,285 1182-1186(1971) ；Falkman J, Klagsbrun M.，Science,235 442-447(1987)； Scapaticci FA.，J Clin Oncol. ,20 =3906-3927 (2002)) 最近，本發明人及其他研究者發 現，載脂蛋白(a)的kringle結構域由于其顯著的抗血管發生活性而具有抗癌和抗轉移活 性(Sculter V等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,21 433-438(2001) ；Trieu UN和Uckun FM.，Biochem Biophys Res Commun.，257 :714_718(1999) ；Kim JS 等，J. Biol Chem.，278 29000-29008(2003) ；Yu HK 等，Cancer Res.，64 :7092_7098 (2004) ；Kim JS 等，Biochem Biophys Res Commun.，313 534-540(2004) ；Lee K等，H印atology，43 :1063_1073(2006))。在抗轉移和抗癌治療中，公認的是，選擇性作用在患病位點上的治療方式會更有 效。因此，開發用于抗癌治療(例如用于對肝癌或者轉移肝腫瘤的有效基因治療)的能組 織特異性地持續進行基因表達的載體非常重要。如上所述，持續的組織特異性基因表達是有效基因治療的關鍵，這需要開發新的 改良表達載體。這可通過改進這種表達載體的轉錄調控元件(順式調控元件或反式作用元 件)來實現。常用轉錄調控元件的實例包括啟動子、增強子、內含子、非編碼區、基因座控制區寸寸。在這種肝組織特異性表達的表達載體中所使用的是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCK，為糖原異生酶)(Yang, Y. W.，J.等，Gene Med. ,5(5) :417_424 (2003))、α 1-抗胰 蛋白酶、白蛋白、FVII、有機陰離子轉運多肽C(OATP-C)、乙型肝炎病毒核心蛋白(Kramer， M.G.，等，Mol. Ther. ,7(3) :375_385 (2003))和甲狀腺素結合球蛋白(Wang，L.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，96 :3906_3910 (1999))的啟動子；以及白蛋白(Kang, Y.，等，Blood, 106 (5) 1552-1558 (2005))、苯丙氨酸羥化酶(PAH)和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素 (bikunin)前體(AMBP) (Wang, L.，等·，Mol. Ther.，1 (2) 154-158 (2000))的增強子。由于與肝中所富含的HNF_4(肝細胞核因子-4)結合，FVII啟動子(大小約為 500bp)在肝中的轉錄活化水平是其他組織中的10倍或更高。已報道的是，大多數轉錄因子 主要結合在 FVII 啟動子 3，端的 300bp 片段上(Greenberg,D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.， 92:12347-12351 (1995))。當截短FVII啟動子(大小為501bp)5，端的315bp片段時，啟 動子的肝特異性活性提高約30%，但當截短210bp片段時活性降低大約20-30% (Pollak, W. S.，等，J.Biol. Chem. ,271 (3) :1738_1747 (1996))。由于與肝中所富含的HNF-I α結合，有機陰離子轉運多肽C(OATP-C)的啟動子 (大小約為900bp)在肝中的轉錄活化水平是其他組織中的3倍或更高。已報道的是， 大多數轉錄因子結合在啟動子3’端的440bp片段上(Jung，D.，等，J. Biol. Chem.，276 37206-37214(2001))。可通過增強子的作用增強啟動子的活性。苯丙氨酸羥化酶(PAH)增強子(大小約 為230bp，并具有HNF-I結合位點)位于PAH基因5’端上游-3. 5kb。已報道的是，由于存
5在肝富含的HNF-I的結合位點，PAH增強子使其所結合的啟動子的活性提高為4倍或更高 (Lei, X. D.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. ,95 :1500_1504(1998))。AMBP ( α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前體)增強子大小約為400bp，其從AMBP基因 5，端的-2945bp延伸到-2539bp。它主要包括HNF_1、2、3和4的結合位點，它的主要活性 區域對應于其-2802 到-2659bp 的片段(Route, P.，等，Biochem. J.，334 :577_584 (1998))。 已報道的是，AMBP增強子一般使啟動子活性提高為兩倍或三倍。位于基因5’和3’端的非翻譯區(UTR)負責基因mRNA的結構穩定(Holcik，Μ.， Liebhaber S. A. , Proc NatlAcad Sci USA.，94 :2410_2414 (1997) ；Chkheidze，A. N.，等， Mol Cell Biol. ,19 =4572-4581 (1999)) 0已報道的是，3，UTR中的多腺苷酸化信號序列也 明顯有助于 mRNA 的結構穩定(Kolev, N. G.，等，Genes Dev.，19 :2583_2592 (2005))。真核基因包括外顯子(被翻譯成蛋白質)和內含子(在外顯子之間的非翻譯序 列)。通過剪接去除這些內含子，使由DNA首先轉錄得到的mRNA前體轉變為成熟的mRNA。 這些內含子包括以GT(U)開始的剪接供體和以AG結尾的剪接受體。此外，出現在內含子3’ 端的是多聚嘧啶片段、剪接因子、snRNP結合分支序列、三鳥嘌呤重復序列(3重G基序)等， 它們在形成剪接體(RNA與內含子剪接酶的復合物)的過程中起關鍵作用(Pagani，F.，等， Nat. Rev. Genet.，5 :389_396 (2004))。當與啟動子和增強子組合時，內含子可作為用于持續高效基因表達的轉錄調控元 件。內含子通過與轉錄因子結合而參與提高基因表達效率和轉錄效率(Liu，K.，等，Proc. Natl. Acad. Sci.，92 :7724_7728 (1995) ；LeBlanc, S. E.，等，J. Biol. Chem.，(2005))，還 參與提高轉錄后的蛋白質翻譯效率(Moore, M.J.，Cell, 108 :431_434 (2002))。已報道 的是，hFIX的內含子1引起hFIX蛋白表達的增加(Kurachi, S.，等，J. Biol. Chem.，270 5276-5281(1995)).抗凝血蛋白(如抗凝血酶和纖維蛋白溶酶原)和凝血因子(如凝血酶原)都在 肝中表達。通過分析這些蛋白為缺陷型的血栓形成或血友病患者的基因內含子，發現了 多種錯義突變和/或無義突變，這提示這些蛋白質的內含子對肝中的基因表達起關鍵作用 (Jochmans, K.，等，Blood, 84 :3742_3748 (1994))。已發現在至少36種哺乳動物(包括人、大鼠、兔、山羊等等)中存在基因座控制區 (LCR)。LCR是含有DNase I敏感區(其對轉錄因子具有組織特異性)的核苷酸序列。人 β -珠蛋白 LCR 的功能是眾所周知的(Harju S.等，Exp. Biol. Med. 227 :683_700 (2002))。肝細胞控制區(h印atocyte control region, HCR)因其增強肝特異性基因表達的 能力而眾所周知，該區發現于載脂蛋白E(ApoE)基因的下游。HCR具有與肝特異性轉錄因子 結合的DNase I敏感區域。HCR作為ApoE基因的肝特異性表達的LCR。ApoE HCR具有在與 多種因子(如HNF3a、HNF4、GATA-1、C/EBP、TF-LF2和Alu家族)結合時被活化的位點。在 這些位點中，表現出DNase I超敏感性的HNF3 α結合位點具有TGTTTGC基序，DNase I可切 開第一個 G 和第二個 T 之間的連接(Dang Q.，等，J. Biol. Chem. 270 =22577-22585 (1995)) 事實上，已報道了向表達載體中引入ApoE HCR導致動物模型中hFIX表達提高(Miao C. H.， 等.，Mol. Ther. 1 :522_532(2000))。已報道了具有與人ApoE基因的HCR(包含TGTTTGC基序)、人的載脂蛋白A_I、載 脂蛋白B、轉鐵蛋白、甲胎蛋白、α 1-抗胰蛋白酶等、以及小鼠中的甲胎蛋白、白蛋白等相似·，J. Biol. Chem. 270 :22577-22585(1995))。發明概述因此，本發明的一個目的是提供可用作轉錄調控元件的多核苷酸，所述轉錄調控 元件用于以高水平持續表達肝組織特異性基因。本發明的另一目的是提供用于以高水平持續表達肝組織特異性基因的表達載體。根據本發明的一個方面，提供具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸。根據本發明的另一方面，提供多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列的多核苷酸以及與SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具 有SEQ ID NO 44和45之核苷酸序列的多核苷酸。根據本發明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸。根據本發明的另一方面，提供多核苷酸，其選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸 序列的多核苷酸。根據本發明的另一方面，提供表達載體，其包含轉錄調控元件和與所述轉錄調控 元件有效連接并受其控制的編碼序列，其中所述轉錄調控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。根據本發明的另一方面，提供表達載體，其包含轉錄調控元件和與所述轉錄調控
7元件有效連接并受其控制的編碼序列，所述轉錄調控元件包含啟動子和與所述啟動子有效 連接的多核苷酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少 一個多核苷酸；以及與選自具有SEQ ID NO 58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多 核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷 酸。附圖簡述通過對本發明的下述描述結合下述附圖，本發明上述的和其他的目的和特征將變 得顯而易見，所述附圖分別顯示圖IA 包含FVII啟動子的pCR-FVII Pro質粒、包含有機陰離子轉運多肽 C(OATP-C)啟動子的pCR-OATP-C Pro質粒和包含α-抗胰蛋白酶(AAT)啟動子/增強子的 pCR-AAT Enh/Pro質粒的示意圖；圖 IB :mRLuc 螢光素酶表達載體 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro的示意圖，其分別含有FVII啟動子、截短的FVII (FVIIA)啟動子和OATP-C啟動子；圖2A:直方圖，其顯示FVII啟動子和OATP-C啟動子在人臍靜脈內皮細胞系 (HUVEC)、人肝細胞癌細胞系(Huh-7)、人腎細胞系(HEK293)、人肺腺癌上皮細胞系(A549) 和人宮頸癌細胞系(HeLa)中的表達效率；圖2B 含有FVII啟動子和FVII Δ啟動子的螢光素酶表達盒的示意圖，以及比較 所述啟動子表達效率的直方圖；圖2C 直方圖，其通過與CMV啟動子比較的方式顯示FVII Δ啟動子、OATP-C啟動 子、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBcP)啟動子、內皮糖蛋白(Endoglin)啟動子、細胞粘附分子 (ICAM2)啟動子和酪氨酸激酶受體(Tie2)啟動子的表達效率；圖3A :pCR-PAH enh和pCR-AMBP enh質粒的示意圖，其分別含有苯丙氨酸羥化酶 (PAH)增強子和α 1-微球蛋白/尿抑胰酶素前體(AMBP)增強子；圖 3Β :pmRL-PF、pmRL-AF、pmRL-PAF、pmRL-P0、pmRL-A0 和 pmRL-PAO 表達載體的示 意圖，其通過向含有FVII Δ啟動子的pmRL-FVII Δ Pro表達載體或者含有OATP-C啟動子的 pmRL-OATP-CPro表達載體中插入選自PAH增強子和AMBP增強子中的至少一種構建而成；圖4A 直方圖，其顯示根據PAH增強子和AMBP增強子與FVIIA、0ATP-C、Tie_2和 ICAM2啟動子組合方式的不同，在A549、HeLa和Huh_7中的體外螢光素酶表達水平；圖4B 直方圖，其通過與CMV啟動子比較的方式顯示當AMBP增強子與FVII啟動 子組合時在HEK293、A549、HeLa、Huh-7、人肝癌細胞系0fep3B)和HUVEC中螢光素酶表達效 率；圖4C 直方圖，其顯示在將每種表達載體與聚乙烯亞胺(PEI)或體內jetPEI的混 合物注射入小鼠尾靜脈之后，帶有表達盒的表達載體在肝組織中的螢光素酶表達效率，所 述表達盒含有PAH增強子、AMBP增強子、CMV增強子和SV40增強子以及圖4A中顯示的啟動 子；圖5 不含有UTR的hFIX表達質粒(FIX)和含有UTR的hFIX表達質粒(FIXUTR) ((a))以及含有多種內含子的FIXUTR質粒((b)、(c)和(d))的示意圖(SD，剪接供體；SA， 剪接受體；(G)3,三鳥嘌呤基序；BS，分支序列)；
圖6A =ELISA結果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平，所 述小鼠通過尾靜脈注射 了帶有 CMV-hFIXUTR-Synlint、CMV_hFIXUTR-Syn2int、CMV-hFIX 和 CMV-hFIXUTR表達盒的表達載體；圖6B =ELISA結果，其顯示在每周從免疫缺陷型小鼠獲得的血漿樣品中的hFIX蛋 白表達水平，所述小鼠中注射了帶有CMV-hFIXUTR-Synlint表達盒的重組腺相關病毒的 1XIO9個感染性顆粒(IP)；圖7A 螢光素酶表達盒的示意圖，所述表達盒在受TK啟動子控制的RLuc螢光素 酶基因中含有內含子；圖7B:直方圖，其顯示在用帶有表達盒(其含有圖7A中多種內含子)的表達載體 轉染的H印3B、HEK293和A549細胞中的螢光素酶表達水平；圖8A 逆轉錄PCR (RT-PCR)結果，其顯示在總RNA (從用圖7B表達載體轉染的A549 細胞中提取)中RLuc和β -肌動蛋白的mRNA表達水平；圖8B:直方圖，其顯示用β-肌動蛋白對圖8A中所獲得的RLuc和β-肌動蛋白 mRNA條帶強度進行歸一化的RLuc mRNA表達水平；圖9A =ELISA結果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水平，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有 CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV-hFIXUTR-Syn2AT、CMV-hFIXUTR-NA、 CMV-hFIXUTR-ANAL、CMV-hFIXUTR-ΔNAS 表達盒以及作為對照帶有 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFI Xint (CMV-hFIXm2)表達盒(含0. 3kb FIX內含子)的表達載體；圖9B =Western印跡分析結果，其顯示在用帶有CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR和 CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達盒的表達載體轉染的ΗΕΚ293Τ中的hFIX蛋白表達水平；

圖10 示意圖，其顯示甲胎蛋白、AAT和白蛋白基因的5’端側翼區中，與在Apo E 基因的LCR中所發現TGTTTGC基序相同或相似的基序的分布；圖IlA :pCR-HCR和pCR-HCRm質粒(分別含有HCR(已知為Apo E基因的肝細胞 控制區)和HCRm (已知為截短TGTTTGC基序的最小HCR結構))以及pCR_AAT78001 cr/ pCR-AAT1081cr、pCR-AFP38001cr和pCR_E61cr質粒(分別含有甲胎蛋白、AAT和白蛋白的 TGTTTGC基序)的示意圖；圖 IlB :pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)質粒(通過向 pBluescriptll 載體中插 入HCRm、AAT增強子和AAT啟動子構建而成)和pBS-HCR-AATpro (HA)質粒(通過向 pBluescript II載體中插入HCR和AAT啟動子構建而成)的示意圖；圖12A:表達盒的示意圖，其通過向含有PAH增強子、FVIIA啟動子和內含子 SynlPLA 的 hFIX 表達盒中引入多種 LCR (HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)而獲 得；圖12B =ELISA結果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達水平，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖12A表達盒的表達載體和CMV-hFIXUTR-SynlPLA表達載體；圖13A 示意圖，其顯示含有PAH增強子與FVII Δ啟動子(PF)的組合或者PAH增 強子、AMBP增強子與FVII Δ啟動子(PAF)的組合、NAL內含子以及AAT108LCR的表達盒； HmA (HCRm-AATenh/pro) -hFIXUTR- Δ NAL 表達盒；以及 HA (HCR-AATpro) -hFIXUTR-1. 4kbFIX int表達盒；圖13B =ELISA結果，其顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中hFIX蛋白表達水平，所述
9小鼠通過尾靜脈注射了帶有圖13A表達盒的表達載體以及CMV-hFIXUTR-ANAL表達載體；圖13C和13D:使用圖13B中獲得的血漿樣品，通過活化部分凝血活酶時間 (activated partial thromboplastin time, APTT)方法所測得的凝血時間和活性；圖14A和14B 分別顯示從血友病B小鼠中獲得的血漿樣品中的hFIX蛋白表達水 平(通過ELISA測量)和凝血活性(通過APTT方法測量)的結果，所述小鼠通過門靜脈施 用 了帶有 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表達盒以及作為對照 帶有普通HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint和CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint表達盒的重組腺相關病 毒的2 X IO9個傳染性顆粒(IP)；圖15A:表達載體的示意圖，其通過向PF-LK68-ANAL_UTR表達盒中引入多種 LCR(HCR、HCRm、AFP3800、AAT7800、AAT108 和 E6)構建而成； 圖 15B :AAT108-PF/PAF-LK68 表達載體、AAT108-PF/PAF-LK68-UTR 表達載體和 AAT108-PF/PAF-LK68- Δ NAL-UTR 表達載體的示意圖；圖16Α 顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達水平的ELISA結果，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有引入多種LCR(HCR、HCRm, AFP3800、ΑΑΤ7800、AAT108和Ε6)的 PF-LK68-Δ NAL-UTR表達盒的表達載體；圖16Β 顯示從小鼠中獲得的血漿樣品中LK68蛋白表達水平的ELISA結果，所述 小鼠通過尾靜脈注射了帶有已引入UTR或UTR和內含子ANAL的AAT108-PF/PAF-LK68表 達盒的表達載體；圖17Α 在ΗΕΚ293細胞及其培養基中LK68蛋白表達水平的Western印跡分析結 果，所述細胞用帶有CMV-LK68和CMV-LK68-Δ NAL-UTR表達盒的復制缺陷型腺病毒以不同 的感染復數比率(MOI)進行了轉染；以及圖17Β 從圖17Α的Western印跡分析結果中獲得的條帶強度的直方圖，以顯示 UTR和內含子對基因表達的影響。發明詳述除非另行定義，否則本文中所用的科技術語具有本發明所屬領域的普通技術人員 通常所了解的相同意義。此外，本文中所提到的所有文件均通過參考以其整體并入本文。本文中所用的術語“表達載體”旨在理解為集合體(表達盒或構建體)或包含該 集合體的載體，所述集合體包含編碼序列、啟動子，并任選地包含與編碼序列有效連接的一 個或多個轉錄調控元件。本文中所用的術語“編碼序列”指編碼氨基酸或者功能性RNA的DNA序列。本文中所用的術語“轉錄調控元件(順式調節元件或順式作用元件)”指位于編碼 序列上游、內部或下游的核苷酸序列，其控制RNA轉錄，以及所轉錄RNA的加工、穩定性和隨 后的翻譯。轉錄調控元件包括啟動子、增強子、內含子、5’和3’非翻譯區(UTR)和基因座控 制區(LCR)。本文中所用的術語“啟動子”和“增強子”是將編碼序列轉錄成RNA所需的DNA序 列代表片段。通常，啟動子是指與聚合酶和轉錄因子結合的DNA區段，增強子是指與聚合酶 活化結構域結合的DNA區段。本文中所用的術語“非翻譯區(UTR) ”是位于編碼序列3’端和5’端的序列，其包 含作為轉錄終止區的多腺嘌呤化信號等。
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本文中所用的術語“內含子”是位于外顯子(轉錄后被翻譯為蛋白質)之間的非 翻譯核苷酸序列。在通過剪接移除內含子后，轉錄的mRNA前體轉變為成熟mRNA。本文中 所用的術語“內含子”也旨在理解為剪接供體、剪接受體、三鳥嘌呤重復序列(三重G基序) 和/或分支序列。本文中所用的術語“基因座控制區(LCR) ”指具有DNase I敏感性位點的核苷酸序 列。組織特異性的轉錄因子結合于LCR。本文中所用的術語“有效連接”指一個或多個核酸序列與單個核酸片段偶聯，以影 響所述單個片段的功能。例如，啟動子與編碼序列有效連接以增強所述編碼序列的表達。在下文中對本發明進行詳細描述。如前所述，對有效的基因療法，應當在特定組織或細胞中以持續方式特異性表達 靶標基因，以使靶標基因替代致病基因。為實現組織特異性持續基因表達，需要包含改進的 轉錄調控元件的表達載體。因此，本發明提供截短的FVII(FVIIA)啟動子，其具有如SEQ IDN0:42所示的 核苷酸序列，所述核苷酸序列通過從SEQ ID NO :41之核苷酸序列中缺失XhoI (5，端)和 BamHI (3’端)限制性位點而截去504bp FVII啟動子的5’端上游207bp片段而產生。下述 實施例顯示所述FVII Δ啟動子具有的活性是未截短FVII啟動子的2. 5倍或更高。FVII Δ啟動子可與合適的增強子(例如選自具有如前所述SEQ IDNO 44中核苷 酸序列的PAH增強子和具有如前所述SEQ ID NO :45中核苷酸序列的AMBP增強子中的至少 一種)組合。本發明也提供內含子，其選自具有如前所述SEQ ID NO 46到57中核苷酸序列的
多核苷酸。SEQ ID NO :46、47和48的內含子分別由截短人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血 酶原的內含子1而產生。SEQ ID NO :49、50和51的內含子是合成的內含子，其分別包含SEQ ID NO :46、47和48之核苷酸序列，并共有剪接受體序列、來源于人α-珠蛋白內含子2的三 鳥嘌呤重復序列(三重G基序)、人纖維蛋白溶酶原的分支序列以及共有的剪接受體序列。 SEQ ID NO :52、53和54的內含子是合成的內含子，其分別缺少SEQ ID Ν0:49、50和51之 核苷酸序列的三重G基序和分支序列。SEQ ID NO :55的內含子是合成內含子，其包含抗凝 血酶的全長內含子1、剪接供體序列和共有的剪接受體序列；SEQ ID NO 56和57的內含子 是合成的內含子，其由截短SEQ ID NO :55之核苷酸序列而產生。在上述內含子中，更優選 SEQ ID NO 57的內含子。本發明還提供基因座控制區(LCR)，其選自具有如SEQ ID NO 58到61所示核苷 酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO :58、59、60和61的LCR分別位于人α 1-抗胰蛋白酶基因上游_108bp 和-7. 8kb處、人甲胎蛋白上游-3. 8kb處和人白蛋白基因上游-6kb處，其中優選SEQ ID NO 58 的 LCR。與本發明中所提到的序列基本相同且功能相似的多核苷酸也在本發明的范圍之 內。術語“基本相同且功能相似的多核苷酸”指某一多核苷酸與另一多核苷酸至少有70%、 優選80%、更優選90%、最優選95%的同一性，其中所述同一性由計算機算法或軟件所確定。
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本發明還提供表達載體，其包含轉錄調控元件和與所述轉錄調控元件有效連接并 受其控制的編碼序列，其中所述轉錄調控元件包括1)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :44和45之核苷酸序列的多核苷 酸；3)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷 酸；4)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸以及與SEQ ID NO 42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ IDNO :58到61之核苷酸序列的多核苷 酸；5)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQ ID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 46到57之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸 序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQ ID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；選自具有SEQ IDNO 44和45之 核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核 苷酸的至少一個多核苷酸；所述多核苷酸彼此有效連接。本發明還提供表達載體，其包含轉錄調控元件和與所述轉錄調控元件有效連接并 受其調控的編碼序列，所述轉錄調控元件包含啟動子和與所述啟動子有效連接的多核苷 酸，所述多核苷酸選自選自具有SEQ IDNO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個 多核苷酸；選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸； 以及與選自具有SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸有效連接 的選自具有SEQ ID NO :46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸。優選地，表達載體還可包含在編碼序列5，和3，端具有SEQ ID NO 62和63之核 苷酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO 62和63的核苷酸序列可來自FIX基因的5，和3，UTR0編碼序列可選自編碼肝特異性蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質包括但不限于 白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α -抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、 FVII, FVIII、FIX、紅細胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖 維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉鐵蛋白。編碼序列與啟動子、增強子、內含子、UTR和LCR有效且可控地連接。如上所述，本發明轉錄調控元件的適當組合能夠實現靶標編碼序列的肝組織特異性表達，并有助于mRNA穩定，因此使編碼序列的表達被提高。包含上述轉錄調控元件的各 種組合的表達盒或載體能夠使靶標編碼序列在肝組織中以高水平持續表達，因此可廣泛應 用于血栓形成、血友病、肝癌等的治療。下述實施例旨在舉例說明本發明而不限制其范圍。實施例1 肝組織特異性表達啟動子和增強子的分離和活性分析<步驟1>肝組織特異性表達啟動子的分離和活性分析使用DNeasy Tissue Kit(Qiagen)從人肝細胞系(Chang細胞)的細胞裂解物中提 取基因組DNA。為了分離FVII啟動子，使用作為模板的基因組DNA、SEQ ID NO :1和2的引 物組和DNA聚合酶(Ex-TaqJakara)進行PCR，以獲得具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的 DNA片段。具體地，PCR按照如下條件進行首先在94°C變性5分鐘；94°C變性30秒、56°C退 火30秒和72°C延伸1分鐘的30個循環；72 °C最終延伸3分鐘。將PCR產物通過凝膠提取 進行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0質粒載體中。具有SEQ ID NO 41之核苷酸序列的FVII啟 動子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。含有FVII啟動子的質粒命名為“pCR-FVII pro”。此外，如前文所述進行PCR(但使用OATP-C啟動子的引物組(SEQ ID NO :3禾P 4)和 AAT啟動子的引物組(SEQ ID NO 5和6)之外，將PCR產物插入到pCR2. 1-TOPO質粒載體 中。OATP-C啟動子(具有SEQ ID NO :43之核苷酸序列)和AAT啟動子通過限制性酶切圖 譜和序列分析進行鑒定。含有OATP-C啟動子和AAT啟動子的質粒分別命名為“pCR-OATP-C pro” 禾口“pCR-AAT enh/pro，，。pCR-FVII pro,pCR-OATP-C pro 禾口 pCR-AAT enh/pro 的示意 圖顯示于圖IA中。將表達Renilla螢光素酶的phRL-null載體(Promega)中的SV40晚期poly (A)替 換成人生長激素的poly(A)，并且從其中去除T7啟動子和內含子，以構建pmRL-null載體。 將所述pmRL-null載體用限制性酶BglII進行消化并用蝦堿性磷酸酶進行處理。用BamHI消化pCR-FVI I pro和pCR-OATP-C pro質粒。所得到的DNA片段通過凝 膠提取進行純化，并插入到預先制備好的pmRL-null載體中。通過限制性酶切圖譜在每個 質粒載體中鑒定所需DNA片段。所述質粒載體命名為“pmRL-FVII Pro”和“pmRL_0ATP-C Pro”。同時，用EcoRI限制性酶截掉pmRL-FVII Pro中FVII啟動子5，端約200bp的片 段，然后通過連接來構建帶有截短FVII (FVIIA)啟動子(具有SEQ ID NO :42之核苷酸序 列)的 pmRL-FVII Δ Pro 質粒。pmRL-FVII Pro、pmRL-OATP-C Pro 和 pmRL-FVII Δ Pro 的示意圖顯示于圖 IB 中。在人肝細胞系(Huh-7、H印G2、H印3B)、腎細胞系(HEK293)、肺癌細胞系(A549)和 宮頸癌細胞系(HeLa)中測量 pmRL-FVII Pro、pmRL_FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 的螢光 素酶表達水平。具體地，用聚乙烯亞胺(PEI)試劑(Polyplus, Illkirch, France)在六孔 板的每一個孔中培養細胞，以達到70到80%的匯合。將培養的細胞用2 μ g的pmRL-FVII Pro、pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro 質粒中每一種和 pcDNA-lacZ 質粒 1 μ g 進行轉 染，并于37°C培養24小時。對細胞進行收集，并以3，OOOrpm離心5分鐘以分離細胞和培養 基。在 100 μ 1 裂解緩沖液(25mM Tris-磷酸、pH 7. 8、2mM DTT (二硫蘇糖醇)、2mM 1，2_ 二 氨基環己烷N，N，N，N'-四乙酸、10%甘油、Triton X-100)中重懸細胞，然后凍融(3 次)以完全裂解細胞。細胞裂解物以10，OOOrpm離心1分鐘。對所得上清液進行半乳糖苷
13酶測定和Bradford測定，以使轉染效率歸一化，啟動子活性通過螢光素酶活性分析進行測 定。結果顯示于圖2A中。如圖2A中所示，FVII啟動子和OATP-C啟動子在肝細胞系Huh_7中誘導更高水平 的螢光素酶表達。在他11-7細胞中斤￥11八啟動子表現出的活性為FVII啟動子的2.5倍(見圖2B)。在他11-7細胞中斤￥11八啟動子表現出的表達效率為CMV啟動子的1.4%，在來源 于肝組織之外的其他組織的細胞系中平均為CMV啟動子表達效率的0. 07%。然而，與CMV 啟動子不同，FVII Δ啟動子對肝組織的特異性是其他組織的20倍(見圖2C)。這一結果顯 示，FVIIA啟動子提高靶標基因的表達效率而對肝組織特異性無不利影響，因此其適用于 在肝組織中選擇性作用的表達載體。在圖2C，(-)代表陰性對照(缺少啟動子)，ICAM2代 表細胞內粘附分子的啟動子，Tie2代表酪氨酸激酶受體的啟動子，內皮糖蛋白代表內皮糖 蛋白的啟動子，HBcP代表乙型肝炎核心蛋白啟動子。〈步驟2>分離增強子為了分離PAH增強子，如〈步驟1>所述進行PCR，但使用PAH增強子的弓丨物組(SEQ ID N0:7和8)。將PCR產物通過凝膠提取進行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0質粒載體中。 具有SEQ ID NO :44之核苷酸序列的PAH增強子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。 所述質粒命名為“pCR-PAHenh”。此外，重復上述步驟，但使用AMBP增強子的引物組(SEQ ID NO 9和10)，以構建帶有AMBP增強子(具有SEQ ID NO 45之核苷酸序列)的pCR-AMBPenh 質粒。pCR-PAHenh和pCR-AMBPenh質粒的示意圖顯示于圖3A中。將PAH 和 AMBP 增強子通過用 SpeI 和 XbaI 消化 pCR-PAHenh 和 pCR-AMBPenh 質 粒加以分離，通過凝膠提取進行純化，并插入到 < 步驟1>中所制備的pmRL-FVII ΔΡΓ0和 pmRL-OATP-C Pro 載體的 SpeI 位點。與 PAH 增強子組合的 pmRL-FVII Δ Pro 和 pmRL-OATP-C Pro分別命名為“pmRL-PF”和“pmRL-P0”。與AMBP增強子組合的pmRL-FVII Δ Pro和 pmRL-OATP-C Pro 分另Ij 命名為 “pmRL—AF，，禾口 “pmRL—AO，，。使用 SpeI 禾口 XbaI 從 pmRL-PF 中提取PAH增強子，并將其插入到pmRL-AF和pmRL_A0的SpeI位點。所得的載體命名為 "pmRL-PAF"禾口 “pmRL-PAO，，。pmRL-PF、pmRL-P0, pmRL—AF、pmRL—AO、pmRL-PAF 禾口 pmRL-PAO 載體的示意圖顯示于圖3B中。根據上述步驟，向OATP-C和FVII啟動子的上游插入能以非組織特異性的方式增 強啟動子活性的CMV和SV40增強子。<步驟3>根據啟動子與增強子的組合分析靶標基因的表達效率<3_1>體外測試在人肝細胞系(Huh-7)和對照細胞系(即人肺細胞系(A549)和人宮頸癌細胞系 (HeLa))中，以與 < 步驟1>中相同的方式測量 < 步驟2>中所構建的載體的基因表達效率。 結果顯示于圖4A中。如圖4A中所示，帶有PAH增強子和FVII Δ啟動子的載體在肝細胞系Huh_7中的特 異性平均為其他細胞系的28. 4倍。這顯示PAH增強子使FVII Δ啟動子的組織特異性提高 了 1.42倍。AMBP增強子使FVIIA啟動子的組織特異性提高了 213. 7倍或更多，這大約是 由AMBP增強子引起的OATP-C啟動子組織特異性提高(65. 6倍)的3倍。上述結果顯示， 增強子可顯著提高FVII Δ啟動子的肝選擇性。
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為了測量AMBP增強子和FVII Δ啟動子控制下的表達載體相對于CMV啟動子控制 下的表達載體的活性，在人肝細胞系(Huh-7、Hep3B)和對照細胞系(即腎細胞系(HEK293)、 肺癌細胞系(A549)、宮頸癌細胞系(HeLa)和血管內皮細胞系(HUVEC))中測量了螢光素酶 的表達水平。結果顯示于圖4B中。如圖4B中所示，在肝細胞系中，含有AMBP增強子和FVIIA啟動子的表達載體表 現出的螢光素酶表達效率為含有CMV啟動子的表達載體的8. 7% ；在其他細胞系中，其平均 為含有CMV啟動子的表達載體的螢光素酶表達效率的0. 14%。這顯示含有AMBP增強子和 FVII Δ啟動子的表達載體的肝組織特異性約為其他組織的62倍高。<3_2>體內測試為了測量在肝中的體內基因表達效率，向小鼠尾靜脈中注射 < 步驟2>的pmRL質 粒與聚乙烯亞胺(PEI) (Polyplus, Illkirch,France)或體內 jetPEI (Polyplus, Illkirch, France)的每種復合物。兩天后，從所述小鼠中取出肝，并測量螢光素酶表達水平。具體而言，在5%葡萄糖溶液中將 40 μ g 的 pmRL-P0、pmRL-PF、pmRL-A0 和 pmRL_AF 質粒中每一種和pcDNA-LacZ質粒10 μ g以與PEI或體內jetPEI的復合物的形式注射入 小鼠(六周齡)尾靜脈中。兩天后，將肝、腎、心臟、脾和肺組織從小鼠中分離，并在PBS溶 液中用勻漿器進行勻漿。然后，將500μ 1所得組織溶液與500μ 1 2Χ裂解緩沖液(50mM Tris-磷酸、pH 7. 8、4mM DTT (二硫蘇糖醇)、4mM 1，2-二氨基環己烷N，N，N，N'-四乙酸、 20%甘油、2%TritOn X-100)混合，其后進行凍融(3次)以完全裂解細胞。細胞裂解物 以10，OOOrpm離心1分鐘。所得上清進行半乳糖苷酶測定和Bradford測定以使轉染效率 歸一化，基因表達效率通過螢光素酶活性測定進行測量。結果顯示于圖4C中。如圖4C中所示，在肝組織中，由含有FVII Δ啟動子/PAH增強子的表達載體與PEI 的復合物誘導的螢光素酶表達水平等于由CMV啟動子誘導的14%，這是螢光素酶表達體外 測定的14倍或更高。由FVII △啟動子/AMBP增強子誘導的肝特異性螢光素酶表達水平等 于由CMV啟動子誘導的80%，這是螢光素酶表達體外測定的10倍或更高。用體內jetPEI代替PEI提高了肝中的基因表達效率。具體地，由含有OATP-C啟 動子/PAH增強子的表達載體與體內jetPEI的復合物誘導的肝特異性螢光素酶表達水平等 于由CMV啟動子誘導的約38%，由FVII Δ啟動子/PAH增強子誘導的螢光素酶表達水平等 于由CMV啟動子誘導的約80%。由FVII Δ啟動子/AMBP增強子和體內jetPEI的復合物誘 導的肝特異性螢光素酶表達水平與由CMV啟動子誘導的相似。這些結果顯示，本發明啟動 子和增強子的活性在體內優于體外。實施例2 分離hFIX UTR和肝特異性基因的內含子，并分析UTR和內含子的基因 表達效率<步驟1>鑒定hFIX的UTR并構建包含UTR的表達載體使用RNA提取試劑盒(Pharmacia Biotech)從Ig人肝組織中提取了 1. 2mg的總 RNA,預先用勻漿器對所述組織進行勻漿。使用作為模板的所提取RNA、M-MuLV逆轉錄酶 (Takara)和oligo_dT17引物(Takara)合成單鏈DNA，使用DNA聚合酶I (Takara)由單鏈 DNA合成雙鏈cDNAo為了評估FIX UTR對基因表達效率的影響，使用作為模板的cDNA、從FIX核苷酸序 列(Genbank登錄號ΝΜ000133)設計的引物組(SEQ ID NO 11和12)和Ex-Taq進行PCR，
15以獲得具有 5，UTR(SEQ ID NO 62)和 3，UTR(SEQ ID NO 63)的 FIX cDNA。PCR 條件如下: 首先94°C變性5分鐘；94°C變性1分鐘、56 °C退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘的30個循環 ’最 后72 °C延伸3分鐘。除了使用SEQ ID NO 13和14的引物組之外，重復上述步驟，以獲得不含UTR的 FIX cDNA作為對照。將擴增的DNA片段用限制性酶NotI和SalI進行消化，通過凝膠提取進行純化，并 插入到pBluescript SK(+)載體的NotI和SalI限制性位點。包含所需UTR的FIX和不含 UTR的FIX通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述載體分別命名為“pBS-hFIXUTR” 和 “pBS-hFIX”(見圖 5(a))。<步驟2>分離肝特異性基因的內含子并構建包含內含子的表達載體<2_1>構建 pCR-int首先，進行PCR以獲得包含人抗凝血酶、纖維蛋白溶酶原和凝血酶原內含子1中 5'端約300bp的片段。具體而言，使用實施例1〈步驟1>中所述的基因組DNA(作為模板)以及人抗凝 血酶內含子(SEQ ID N0:15和16)、人纖維蛋白溶酶原內含子(SEQ ID N0:17和18)和人 凝血酶原酶內含子(SEQ ID NO 19和20)的引物組在下述條件下進行PCR 首先94°C變 性5分鐘；94°C變性1分鐘、60°C退火1分鐘、72°C延伸2分30秒的30個循環；最后72°C 延伸3分鐘。將PCR產物通過凝膠提取進行純化，并插入到pCR2. 1-T0P0載體中。SEQ ID NO :46、47和48的內含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質粒分別命名為 "pCR-ATint，，、“pCR-PLAint，，禾口 "pCR-PTint，，。進一步地，為了分離Kurachi S所報道的FIX內含子1，重復上述PCR步驟，但使用 FIX內含子1的引物組(SEQ ID NO :21和22)，并將所獲得的PCR產物插入到pCR2. 1-TOPO 載體中。所產生的質粒載體用限制性酶PvuI或ScaI進行消化，并進行自連。具有不 同大小的FIX內含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質粒分別命名為 "pCR-1. 4kbFIXint” 和 “pCR-0. 3kbFIXint，，。<2-2> 構建 pBS-FIX-Synlint在FIX的外顯子1和2之間插入<2-1>中所制備的pCR-ATint、pCR-PLAint和 pCR-PTint內含子片段。具體而言，重復<2-1>的PCR，但使用FIX 5，UTR的有義引物(SEQ ID NO 11)和 共有剪接供體序列GTAA和三重G基序(來源于人α-珠蛋白的內含子2)的反義引物(SEQ ID NO :23)，以獲得包含FIX的5’ UTR和外顯子1、剪接供體和人α-珠蛋白三重G基序的 DNA片段。進一步地，重復上述PCR，但使用人纖維蛋白溶酶原的分支序列和共有剪接受體 序列TCGA的有義引物(SEQ ID NO 24)和FIX3，UTR的反義引物(SEQ ID NO 12),以獲得 包含分支序列、剪接受體、外顯子2至8和FIX 3’UTR的DNA片段。將PCR產物通過凝膠提 取進行純化，并插入到PCR2. 1-T0P0載體中。所需的DNA片段通過限制性酶切圖譜和序列 分析進行鑒定。所述質粒分別命名為“pCR-5’ hFIX”和“pCR-3’ hFIX”。將pCR-5，hFIX和pCR-3'hFIX分別用限制性酶NotI和NdeI以及NdeI和SalI進 行消化，均插入到pBluescript的NotI和SalI限制性位點。所得質粒用NdeI進行消化， 并插入用相同的酶(NdeI)預處理的<2-1>的pCR-ATint、pCR-PLAint和pCR-PTint中。所需的SEQ IDN0:49、50和51內含子通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質粒分 別命名為 “pBS-hFIXUTR-SynlAT” “pBS-hFIXUTR-SynlPLA” 和 “pBS-hFIXUTR-SynlPT，，。所 述質粒的示意圖顯示于圖5(b)中。<2-3> 構建 pBS-FIX_Syn2int將<2-2>的pBS-FIXUTR-SynlPLA質粒用XhoI和AatII進行消化(針對與剪接 供體和受體相鄰的XhoI和AatII限制性位點)，并插入用相同的酶(XhoI和AatII)預處 理的 <2-1> 的 pCR-ATint、pCR-PLAint、pCR-PTint、pCR-1. 4kbFIXint 和 pCR-0. 3kbFIXint 中。Syn2AT、Syn2PLA 和 Syn2PT (SEQ ID NO : 52、53 和 54)的內含子以及 1. 4kbFIXint 和0.3kbFIXint的內含子通過限制性酶切圖譜進行鑒定。所述質粒分別命名為 “pBS-hFIXUTR-Syn2AT”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PLA”、“pBS-hFIXUTR-Syn2PT”、“pBS-hFIXUTR-1. 4kbFIXint (hFIXml) ”和“pBS-hFIXUTR-O. 3kbFIXint (hFIXm2) ”。所述質粒的示意圖顯示 于圖5(c)中。<2-4>分離抗凝血酶全長內含子1并構建縮短的抗凝血酶內含子重復<2_1>的PCR，但使用SEQ ID NO 15和25的引物組，以擴增包含抗凝血 酶全長內含子1的片段。將大約2. 3kb的PCR產物插入到pCR2. 1-T0P0載體中，其命名 為“pCR-NAint”。所得的質粒用XhoI和AatII進行消化，并根據<2_3>的步驟插入到 pBS-hFIXUTR 中，以獲得包含 SEQ ID NO 55 內含子的 pBS-hFIXUTR-NA。使用Kilo-Sequence Deletion Kit(Takara)從 PvuII 位點截短在 pBS-hFIXUTR-NA中所插入的內含子。具體地，將pBS_FIXUTR_NA用PvuII進行消化，用核 酸外切酶III在25°C降解15秒、30秒、45秒和1分鐘，用綠豆核酸酶和klenow酶進行末 端補平，最后進行自連。將所得的構建體轉化到大腸桿菌中。將所得的轉化體在氨芐青霉 素平板上進行培養并從其中篩選單菌落，來源于所述菌落的質粒中內含子的大小使用限制 性酶通過電泳進行鑒定。對帶有正確大小內含子的質粒進行純化和測序，以獲得包含SEQ ID NO 56 的 811bp 內含子的質粒 pBS-hFIXUTR-ΔNAL 以及包含 SEQ ID NO 57 的 640bp 內含子的質粒 pBS-hFIXUTR- Δ NAS。所述質粒 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-ANAS的示意圖顯示于圖5(d)中。<步驟3>分析UTR和內含子對FIX表達的影響將〈步驟1>和〈步驟2>中所制備的pBS-hFIX、pBS-hFIXUTR、 pBS-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 pBS_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0. 3kbFIXint)質粒用NotI和SalI進行消化，并插入到含有CMV啟動子和牛poly (A) 的pTRUF6腺相關病毒載體中，以獲得hFIX表達載體CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-Synlint(AT, PLA, PT)和 CMV_hFIXUTR-Syn2int(AT、PLA, ΡΤ、1· 4kbFIXint、 0.3kbFIXint)。將25 μ g上述表達載體的質粒DNA注射到C57BL/6小鼠尾靜脈中。第二天，收集 血液樣品用于下述ELISA。將所得血液樣品在HBS-BSA-EDTA-T20 緩沖液(0. 1MHEPES-0. IM NaCl-I % BSA-IOmM EDTA-0. 1 % Tween-20)中稀釋100倍。將稀釋的血液樣品加入到包被了人 FIX (hFIX)抗體(Affinity Biologicals)的 96 孔板中，于室溫培養 90 分鐘，用 PBS-0. 1% Tween-20洗滌，并與過氧化物酶標記的二抗孵育。將平板再次用PBS-0. 1% Tween-20進
17行洗滌，并向其中加入溶有0-苯二胺和H2O2的底物緩沖液。將平板孵育5分鐘，并用2. 5M H2SO4 終止反應。用分光光度計(Spectra Shell Microplate Reader, STL Spectra,Milan, Italy)在490nm測量吸光度，根據標準吸光度對標準濃度的標準曲線計算樣品中的hFIX濃 度。結果顯示于圖6A中。如圖6A中所示，注射后第二天，由CMV-hFIXUTR所誘導的hFIX蛋白的血液濃度約 為910ng/ml，是由不含UTR的CMV-hFIX所誘導蛋白(540ng/ml)的約1. 7倍。這表明UTR 有助于hFIX的表達。CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 hFIX 表達水平(1，480ng/ml)高至 CMV_hFIXUTR(910ng/ ml)的 1. 6 倍，CMV-hFIXUTR-Syn2AT 的 hFIX 表達水平(2，170ng/ml)高至 CMV-hFIXUTR(910ng/ml)的2. 4倍。這表明該內含子參與hFIX基因表達及最初的hFIX蛋 白誘導。同時，使用表達載體 CMV-hFIX、CMV-hFIXUTR 和 CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、 PLA, PT)產生重組腺相關病毒 rAAV-CMV-hFIX、rAAV-CMV-hFIXUTR 和 rAAV-CMV-hFIXUTR-Synlint (AT、PLA, PT)。具體地，在 500mlSpinner 瓶中制備 200ml 的 HEK293T細胞，用低鈣DMEM培養基(0. ImM Ca++、0. 1 % PL-68U % FBS)將所述細胞調整成 1 X IO6個細胞/ml的濃度。向細胞中載入包含33 μ g的表達載體中每一種、167 μ g的腺病 毒輔助質粒PDG和650 μ 1的10 μ M PEI的DNA-PEI混合物，并將所述細胞在5% CO2培養 箱中以30rpm懸浮培養6小時。然后，將培養基更換成100 μ g硫酸葡聚糖低鈣DMEM。培養 48小時后，收集細胞，對其進行凍融(3次)并以2000rpm離心5分鐘。所得上清液通過碘 克沙醇梯度超速離心法進行純化(Zolotukhin，S.等，Gene Ther.，6 :973_985 (1999))。將 IX IO9個感染性顆粒(IP)注射到免疫缺陷型裸鼠(Japan SLC Inc)的尾靜脈中。兩周后， 每周收集一次血液樣品，并將其用于上文所描述的ELISA。結果顯示于圖6B中。如圖6B中所示，病毒注射后14周時，包含本發明內含子的病毒的hFIX表達水平 是不含內含子的病毒的10到20倍。具體地，帶有CMV-hFIXUTR-SynlAT的病毒的hFIX蛋 白濃度為19，996pg/ml，而帶有CMV-hFIXUTR的病毒的hFIX蛋白濃度為2，024pg/ml。這表 明本發明內含子在增強基因表達方面發揮關鍵作用。<步驟4>分析內含子對螢光素酶表達效率及mRNA穩定性的影響<4-1>向由TK啟動子控制的螢光素酶表達載體中引入內含子將pRL-TK表達載體(promega)用Hindlll/Nhel消化以去除SV40內含子，其后進 行末端補平及自連。內含子截短的PRL-TK載體命名為“pRL-Aint”，含有SV40內含子的 pRL-TK 載體命名為 “pRL-SV40”。將<2-2> 和 <2-3> 中得到的 pBS-hFIXUTR-SynlAT、pBS-hFIXUTR-SynlPLA 和pBS-hFIXUTR-0. 3kbFIXint用Xhol/Aatll進行消化及末端補平。將所得片段插入 到上述表達載體pRL- Δ int0所得載體分別命名為“pRL-SynlAT”、“pRL-SynlPLA”和 “pRL-hFIXm2”(見圖 7A)。<4_2>分析螢光素酶表達效率如實施例1〈步驟1>中所述，將2yg<4-l>的螢光素酶表達載體、Iyg β-半 乳糖苷酶表達載體和6yg PEI(polyplus)的復合物注射到肝細胞系0fep3B)、腎細胞系 (HEK293)和肺細胞系(A549)中。48小時后，收集細胞并根據與實施例1<步驟1>中相同
18的方法測量螢光素酶表達效率。結果顯示于圖7B中。如圖7B中所示，由含有內含子的表達載體所誘導的螢光素酶表達高達由不含內 含子的表達載體所誘導的200倍(SynlAT在H印3B肝細胞系中表達的情況)。特別地， SynlAT表達載體明顯有助于螢光素酶活性的誘導以及如 < 步驟3>中所述的FIX表達的誘導。<4-3>分析mRNA表達穩定性根據與<4_2>中相同的方法，將<4_1>的螢光素酶表達載體轉染到A549肺細胞系 中，48小時后收集細胞。使用FastPure RNA試劑盒(Takara)從所述細胞中提取總RNA。使 用500ng每種總RNA (作為模板)和AMV逆轉錄酶(Takara)制備單鏈DNA。然后，使用上述 單鏈DNA(作為模板)以及檢測螢光素酶和肌動蛋白的引物組進行PCR。結果顯示于圖 8Α禾口 8Β中。如圖8Α和8Β中所示，由pRL_SynlAT載體所誘導的RLuc mRNA相對量是由 pRL-Δ int所誘導的RLuc mRNA的1. 7倍。這表明，本發明內含子導致了 mRNA的更高穩定 性，這種更高的穩定性導致增強的基因表達。<步驟5>分析抗凝血酶內含子對FIX表達的影響為了確定抗凝血酶內含子對hFIX蛋白表達的影響，根據與〈步驟3>中相同的方 法，將 <2-4> 中所制備的 pBS-hFIXUTR-NA、pBS-hFIXUTR- Δ NAL 和 pBS-hFIXUTR-NAS 質粒 插入到pTRUF6腺相關病毒中，以獲得表達載體CMV-hFIXUTR-NA、CMV-hFIXUTR-ΔNAL和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS0根據與 < 步驟3>中相同的方法，將表達載體CMV_hFIX、CMV_hFIXUTR、 CMV-hFIXUTR-0. 3kbFIXint (CMV_hFIXm2)、CMV-hFIXUTR-SynlAT、CMV_hFIXUTR_Syn2AT、 CMV-hFIXUTR- Δ ΝΑ、CMV-hFIXUTR- Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR- Δ NAS 的質粒 DNA 注射到小鼠尾 靜脈中，并通過ELISA測量受試者血液hFIX濃度。結果顯示于圖9A中。如圖9A中所示，含有合成或天然抗凝血酶內含子的表達載體的hFIX蛋白濃 度是 CMV-hFIXUTR 的 1. 7 到 3. 5 倍(1，730 到 3，540ng/ml 對 1，000ng/ml)。特別地， CMV-hFIXUTR- Δ NAL表達載體表現出的表達效率是以前所構建的CMV_hFIXm2表達載體的 約1. 7倍(2，010ng/ml對1，000ng/ml)。這表明ANAL內含子非常適于hFIX的過表達。同時，為了在體外評估內含子八嫩1^對1^1乂表達的影響，將表達載體01^-1^1父、 CMV-hFIXUTR和CMV-hFIXUTR- Δ NAL轉染到ΗΕΚ293Τ腎細胞系中。轉染后兩天，收集細胞及 培養基并進行裂解。裂解物中hFIX蛋白水平通過使用hFIX抗體的電泳法進行測量，結果 顯示于圖9B中。如圖9B中所示，CMV-hFIXUTR-Δ NAL表達載體誘導的hFIX表達水平是CMV-hFIX 和CMV-hFIXUTR表達載體的1. 55倍。這一結果表明Δ NAL內含子對于hFIX過表達是很有 效的。實施例3 分離肝特異性LCR并分析LCR的基因表達效率<步驟1>分離肝特異性LCR并構建包含LCR的質粒載體在僅表達于肝組織中的α 1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白和白蛋白基因的下游分析 TGTTTGC基序的位置。結果顯示于圖10中。如圖10中所示，七個TGTTTGC基序分布在α 1_抗胰蛋白酶基因的_7. 8kb，六個基 序為正向的，一個基序為反向的；還有一個正向的基序位于α 1-抗胰蛋白酶基因的-108bp位點。在甲胎蛋白-3. 8kb位點，兩個TGTTTGC基序以正向分布，一個基序為反向；在白蛋白 基因的-6kb位點，一個基序為反向。此外，TGTTTGC基序在α 1_抗胰蛋白酶基因_800bp位 點、甲胎蛋白基因-1. 5kb和-500bp位點以及白蛋白基因-IOkb, -3. 5kb和-2. 6kb位點聚 簇。在這些位點中，對α 1-抗胰蛋白酶基因-7. 8kb和_108bp位點、甲胎蛋白基因的-3. 8kb 位點和白蛋白基因_6kb位點進行分離。具體而言，為了分離位于α 1-抗胰蛋白酶基因-108bp位點的LCR，使用實施例1< 步驟1>的基因組DNA (作為模板)、SEQ ID NO 26和27的引物組和DNA聚合酶(EX_Taq、 Takara)根據與實施例1<步驟1>中相同的方法進行PCR。將PCR產物通過凝膠提取進行 純化，并插入到PCR2. 1-T0P0載體中。所需具有SEQ ID NO :58之核苷酸序列的α 1-抗胰 蛋白酶LCR通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質粒命名為“pCR-AAT1081cr”。相似地，重復上述PCR步驟，但使用引物組SEQ ID N0:28和29、SEQ ID NO 30禾口 31以及SEQ ID NO :32和33，以分別擴增位于人α 1-抗胰蛋白酶的-7. 8kb位點、人甲胎蛋 白的-3. 8kb位點和人白蛋白基因的_6kb位點的LCR。將PCR產物插入到pCR2. 1-T0P0載 體中。所需具有SEQ ID NO :59、60和61之核苷酸序列的LCR通過限制性酶切圖譜和序列分 析進行鑒定。所述質粒分別命名為“pCR-AAT78001cr”、“pCR-AFP38001cr”和“pCR-E61cr”。同時，為了分離Dang Q.所報道的人載脂蛋白E (ApoE)基因的肝細胞控制區(HCR) 和最小結構HCR(HCRm)，使用引物組SEQ IDN0:34和35以及SEQ ID NO :34和36進行PCR， 并將所得的PCR產物插入pCR2. 1-T0P0載體中。人ApoE基因的HCR和HCRm通過限制性酶 切圖譜和序列分析進行鑒定。所述質粒分別命名為“pCR-ApoEHCR”和“pCR-ApoEHCRm”。這 些質粒的示意圖顯示于圖IlA中。進一步地，將AAT基因的增強子和啟動子與HCRm的組合插入到pBluescript II 載體中以構建pBS-HCRm-AATenh/pro (HmA)，將AAT基因的啟動子與HCR的組合插入到 pBluescript II載體中以構建pBS-HCR-AATpro (HA)。這些質粒的示意圖顯示于圖IlB中。〈步驟2>分析LCR的基因表達效率對 < 步驟1>中所分離的LCR與啟動子、增強子及內含子的組合，對FIX表達效率 的影響進行評估。具體而言，將〈步驟1> 中所制備的 pCR-AAT1081cr、pCR_AAT7800cr、 pCR-AFP38001cr、pCR_E61cr、pCR-HCR 和 pCR-HCRm 質粒用 HindIII/EcoRV 進行消化， 并插入到實施例1<步驟2>中所制備的pBS-PF的HindIII/EcoRI (稍后補平)限制 性位點，以分別獲得 pBS-AAT108-PF、pBS-AAT7800_PF、pBS-AFP3800_PF、pBS_E6_PF、 pBS-HCR-PF和pBS-HCRm-PF。將這些質粒用KpnI和NotI再次進行消化，并插入到 實施例2<步驟5>中所制備的pBS-CMV-hFIXUTR-SynlPLA的KpnI/NotI限制性位 點，以獲得 pBS-AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-AFP3800-PF-hFIXUTR-SynlPLA、pBS-E6-PF-hFIXUTR-SynlPLA、 pBS-HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 pBS-HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。這些質粒的示意圖顯示 于圖12A中。將所述質粒用KpnI和SalI進行消化，并插入到pTRUF6腺相關病 毒的KpnI/Sall限制性位點，以獲得表達載體AAT108-PF_hFIXUTR-SynlPLA、 AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA, AFP3800-PF_hFIXUTR-SynlPLA、E6-PF_hFIXUTR-SynlPLA、
20HCR-PF-hFIXUTR-SynlPLA 和 HCRm-PF-hFIXUTR-SynlPLA。將所述表達載體的質粒 DNA 根據 與實施例2〈步驟3>中的相同方法注射到小鼠尾靜脈中，通過ELISA測定hFIX蛋白的表達 水平。結果顯示于圖12B中。如圖12B中所示，注射兩天后，包含LCR的表達載體表現出的hFIX表 達水平高達 CMV-hFIXUTR-SynlPLA 的 7 倍(AAT7800-PF-hFIXUTR-SynlPLA 7, 640ng/ml 對 CMV-hFIXUTR-SynIPLA 1，090ng/ml)。特別地，直到注射后 4 周， AAT108-PF-hFIXUTR-SynlPLA仍持續表達390ng/ml或更高的hFIX，這一表達水平高達 HCR-PF-FIX-SynlPLA (250ng/ml)的1.6倍。該結果表明AAT108內含子非常適于hFIX的持 續表達。實施例4 評估本發明表達載體對血友病B的治療效果根據與實施例3<步驟2>中相同的方法，用實施例1<步驟2>中所制備的 pBS-PAF構建表達載體AAT108-PAF-hFIXUTR-SynlPLA。然后，將實施例2<2_4>中所構建的 pBS-CMV-hFIXUTR- Δ NAL用NotI和SalI進行消化，并插入到實施例3<步驟2>中所構建的 AAT 108-PF-hFIXUTR-SynIPLA 和 AAT108-PAF_hFIXUTR-SynlPLA 的 Notl/Sall 限制性位點， 以獲得 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108-PAF_hFIXUTR- Δ NAL。同時，將實施例1<步驟1>的pCR-AAT enh/pro用SpeI (稍后補平末端)/NotI 進行消化，并插入到實施例3<步驟2>的pCR-HCRm的EcoRV/NotI限制性位點，以獲得 pCR-HCRm-AATenh/pro 表達載體(HmA)。將 pCR-HCRm-AATenh/pro (HmA)表達載體用 KpnI 和NotI進行消化，并插入到實施例2<步驟5>中所構建的CMV-hFIXUTR-Δ NAL的KpnI和 NotI限制性位點，以獲得HmA-hFIXUTR-NAL表達載體。將實施例1<步驟1>中所描述的pCR-AAT enh/pro用BglII (稍后補平)/NotI進 行消化，并插入到實施例3<步驟2>中所描述的pCR-HCR的EcoRV/NotI限制性位點，以獲 得 pBS-HCR-AATpro (HA)表達載體。將 pBS-HCR-AATpro (HA)表達載體用 KpnI/NotI 進行消 化，并插入到實施例2<步驟3>中所描述的CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的KpnI/NotI限制 性位點，以獲得HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint表達載體。所述表達載體的示意圖顯示于圖13A中。將25 μ g 的 AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL、AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL、 HmA-hFIXUTR- Δ NAL和CMV-hFIXUTR-Δ NAL(實施例2<步驟5>中所制備)表達載體的每 一種質粒DNA注射到血友病B小鼠的尾靜脈中，并通過ELISA測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。如圖13B中所示，相對于由HmA-hFIXUTR-ΔNAL表達載體所誘導的hFIX表達水 平，由AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達載體所誘導的hFIX表達水平在注射后第1天為 9.8%，第2天為30.6%、第7天為82%，第2周為108%，第9周為208%。此外，相對于由 HmA-hFIXUTR- Δ NAL表達載體所誘導的hFIX表達水平，由AAT108-PF_hFIXUTR- Δ NAL表達 載體所誘導的hFIX表達水平在注射后第1天為9 %，第2天為19. 2 %，第7天為41. 9 %，第 2周為56. 9%，第9周為73. 0%。用hFIX表達載體注射的血友病B小鼠和正常小鼠的凝血活性通過如下的活化部 分凝血活酶時間(APTT)方法進行測定。將FIX缺陷型血漿、10倍稀釋的小鼠血漿、活化的 肌動蛋白(各50 μ 1)相混合，并在37°C孵育3分鐘。向其中加入CaCl2，用血液凝集檢測
21器KClOA(Amelung)測定樣品凝結所消耗的時間。正常小鼠的凝血時間約為44秒，血友病B 小鼠約為65秒。如圖13C中所示，直到注射后3天，施用了 hFIX表達載體的血友病B小鼠 才顯示出正常凝血時間的約80%。7天后，施用了 CMV-hFIXUTR-ΔNAL的小鼠的凝血時間 回復到注射前的水平，而施用 了 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 的小鼠表現出凝血時間改善為50到60秒。進一步地，根據標準活性對標準凝血時間的標準曲線計算所述樣品的凝血活性。 如圖 13D 中所示，用 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL 和 AAT108_PAF_hFIXUTR- Δ NAL 表達載體處 理的血友病B小鼠的凝血活性在注射后8周分別為正常小鼠的34. 和29.3%。特別地， 用AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL表達載體處理的小鼠的凝血活性在注射后8周為正常小鼠 的 31. 9%。同時，根據與實施例2<步驟3>中相同的方法，將使用HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint、 AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL, AAT108_PAF_hFIXUTR-Δ NAL 和 CMV-hFIXUTR-l. 4kbFIXint 的 2 X IO9IP的重組腺相關病毒注射到血友病B小鼠的門靜脈中，并通過如前所述的ELISA和 APTT方法測定hFIX蛋白濃度和凝血活性。結果顯示于圖14A和14B中。如圖14A中所示，帶有AAT108-PF-hFIXUTR- Δ NAL的病毒誘導高達2，379ng/ ml 的 hFIX 蛋白，帶有 AAT108-PAF-hFIXUTR-ANAL 的病毒誘導高達 1，431ng/ml 的 hFIX蛋白。另一方面，對照病毒(即，帶有CMV-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒和帶有 HA-hFIXUTR-1. 4kbFIXint的病毒)所誘導的hFIX表達水平分別為1，542ng/ml和380ng/ ml。特別地，含AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的病毒到注射后68周還誘導500ng/ml或更高 的hFIX表達。這一結果表明，本發明含有LCR的表達載體適用于需要長期基因表達的基因 治療。如圖14B中所示，施用了帶有AAT108-PF-hFIXUTR-ANAL的rAAV的小鼠到注射后 7周表現出正常小鼠凝血活性的59. 或更高。上述結果表明，本發明的基因表達系統對于血友病治療所需的穩定而持續的表達 是有效的。實施例5 構建包含抗血管發生蛋白Apo(a)kringle結構域KIV9-KTV10_KV(LK68) 基因的肝特異性表達載體并評估LK68蛋白表達效率為了向LK68表達載體中引入ANAL內含子和FIX UTR，首先使用作為模板的 pAAV-LK68(專利號 KR10-0681762)、引物組 SEQ IDNO 37 和 38、SEQ ID NO 39 和 40 以及 EX-Taq進行PCR，以獲得FIX 5，UTR信號序列片段和LK68-FIX 3，UTR片段。PCR條件如下 首先94 V變性5分鐘；94 V變性1分鐘、60 V退火1分鐘、72 °C延伸1分鐘的30個循環；72 °C 最后延伸3分鐘。將所述5’ UTR信號序列片段和LK68-3’UTR片段分別插入到實施例2<2_4> 中所制備的pBS-hFIXUTR-ANAL載體的Notl/Xhol和Aatll/Sall限制性位點。所需DNA片 段通過限制性酶切圖譜和序列分析進行鑒定，所述質粒命名為“PBS-LK68- Δ NAL-FUTR”。將 通過用限制性酶NotI和SalI處理pBS-LK68- Δ NAL-FUTR質粒所得到的LK68- Δ NAL-FUTR 片段插入到實施例4中所制備的AAT108-PF-hFIXUTR-NAL的Notl/SalI限制性位點， 以獲得表達載體AATl08-PF-LK68-Δ NAL-FUTR。在存在不同LCR或者缺少LCR時重復 上述步驟，以獲得表達載體 E6-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AAT7800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, AFP3800-PF-LK68- Δ NAL-FUTR, HCRm-PF_LK68- Δ NAL-FUTR、HCR-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 和PF-LK68-ΔNAL-FUTR。所述表達載體的酶切圖譜顯示于圖15Α中。根據與實施例2<步驟3>中相同的方法，將所述表達載體注射到小鼠尾靜脈中。從 小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達水平。如圖16Α中所示，在不同LCR中，ΑΑΤ108顯示出最高的基因表達效率。特別地，相 對于 PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達載體的 LK68 表達效率，AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達 載體的LK68表達效率在注射后第1天為158. 4%，第2天為104. 8%，第7天為155. 8%，第 2周為160. 2%，第3周為162. 7%，第4周為144. 1%0
進一步地，重復上述步驟以獲得包含表達盒MT108-PF-LK68、MT108-PF-LK68-FUTR、 AAT108-PF-LK68-ΔNAL-FUTR、 AAT108-PAF-LK68、 AAT108-PAF-LK68-FUTR 禾P AAT108-PAF-LK68-ΔNAL-FUTR的表達載體。所述表達載體的示意圖顯示于圖15Β中。根據與實施例2<步驟3>中相同的方法，將所述表達載體注射到小鼠尾靜脈中。從 小鼠中收集血液樣品，并通過ELISA測量LK68蛋白的表達水平。如圖16Β中所示，相對于AAT108-PF-LK68表達載體的LK68表達效率， AAT108-PF-LK68-FUTR 和 AAT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 表達載體的 LK68 表達效率分別在 注射后第1天為197. 7%和425. 4%，第2天為478. 6%和891. 2%，第7天為233. 2%和 319. 3%，第 2 周為 203. 0%和 253. 7%，第 3 周為 113. 8%和 243. 3%，第 4 周為 170. 4%和 277. 6%。相對于 AAT108-PAF-LK68 表達載體的 LK68 表達效率，AAT108-PAF-LK68-FUTR 和 AAT108-PAF-LK68-Δ NAL-FUTR表達載體的LK68表達效率分別在注射后第1天為147. 0% 和 344. 6%，第 2 天為 351. 0%和 824. 5%，第 7 天為 220. 2%和 260. 3%，第 2 周為 140. 8% 和 203. 0%,Μ 3 周為 146. 5%禾口 288. 4%，第 4 周為 177. 8%禾口 323. 8% 0這些結果表明，與不存在內含子和UTR的情況相比，基因表達在內含子和/或UTR 存在下是持續高水平的。實施例6 評估細胞內由UTR和內含子引起的抗血管發生蛋白Ap0(a)kringle結 構域KIV9-KIV10-KV(LK68)的表達效率將通過用NotI 和 SilI 消化實施例 5 所述 MT108-PF-LK68 和 MT108-PF-LK68- Δ NAL-FUTR 載體所得到的LK68和LK68-Δ NAL-FUTR片段插入到腺病毒穿梭載體 pENTR2B(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，以獲得 pENTR_LK68 和 pENTR_LK68_ΔNAL-FUTR 載體。將這些穿梭載體和靶標載體pAd/CMV/V5-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA)用 Clonase (Invitrogen, Carlsbad, CA)進行體外同源重組，以獲得 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 載體。將所述 pAd-CMV_LK68 和 pAd-CMV_LK68- Δ NAL-FUTR 載體 用PacI限制性酶進行線性化，并轉染到HEK 293腎細胞系中，以分別獲得帶有CMV-LK68和 CMV-LK68- Δ NAL-FUTR 的復制缺陷型腺病毒 rAd_LK68 和 rAd_LK68_UN。將所述 rAd_LK68 和rAd-LK68_UN注射到HEK 293腎細胞系中，并測量LK68蛋白的表達水平。以0. 1,0. 5、2和10的多種感染復數(MOI)感染HEK 293腎細胞系。在腺病毒感 染后2天收集細胞和培養基。使用抗LK68抗體，通過電泳測定LK68蛋白的表達水平。結 果顯示于圖17A和17B中。如圖17A和17B中所示，當MOI為0. 1,0. 5和2時，LK68蛋白的表達水平很低且 相等，然而當MOI為10時，與由rAd-LK68所誘導的相比，由rAd_LK68_UN所誘導的LK68蛋 白表達水平在細胞內提高了 420%，在培養基中提高了 242%。
23
這些結果表明，UTR和內含子存在下細胞和培養基中的基因表達效率都高于缺少 UTR和內含子的情況。盡管通過上述具體實施方案對本發明進行了描述，但應當理解，可以進行多種修 改和改變，而仍屬于由下述權利要求書所定義的本發明范圍。
權利要求
具有SEQ ID NO42之核苷酸序列的多核苷酸。
2.多核苷酸，其包含具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸；以及與所述SEQ ID NO :42之多核苷酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核 苷酸序列的多核苷酸。
3.多核苷酸，其選自具有SEQID NO :46至57之核苷酸序列的多核苷酸。
4.多核苷酸，其選自具有SEQID NO :58至61之核苷酸序列的多核苷酸。
5.表達載體，其包含轉錄調控元件和與所述轉錄調控元件有效連接并受其控制的編碼 序列，其中所述轉錄調控元件包含1)具有SEQID NO 42之核苷酸序列的多核苷酸；2)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :44和45之核苷酸序列的多核 苷酸；3)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核 苷酸；4)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，以及與所述SEQID NO :42之多核苷 酸有效連接的至少一個多核苷酸，后者選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列的多核 苷酸；5)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO :44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；6)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID N0:44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；7)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID N0:46到57之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸，以及選自具有SEQ ID NO :58到61之核苷酸序列 的多核苷酸的至少一個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接；或者8)具有SEQID NO :42之核苷酸序列的多核苷酸，選自具有SEQID NO: 44和45之核苷 酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸，選自具有SEQ ID NO 46到57之核苷酸序列的多 核苷酸的至少一個多核苷酸；以及選自具有SEQ ID NO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸 的至少一個多核苷酸，所述多核苷酸彼此有效連接。
6.表達載體，其包含轉錄調控元件以及與所述轉錄調控元件有效連接并受其控制的編 碼序列，所述轉錄調控元件包含啟動子和與所述啟動子有效連接的多核苷酸，所述多核苷 酸選自選自具有SEQ ID NO :46到57之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；選 自具有SEQ IDNO 58到61之核苷酸序列的多核苷酸的至少一個多核苷酸；以及與選自具有 SEQ ID NO :58到61核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸有效連接的選自具有SEQ ID NO 46到57核苷酸序列之多核苷酸的至少一個多核苷酸。
7.權利要求5或6的表達載體，其中所述編碼序列是編碼肝特異性蛋白質的序列，所述 蛋白質選自白蛋白、甲胎蛋白、α-葡萄糖苷酶、α 1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶、脂蛋白、血漿銅藍蛋白、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、紅細胞生成素、纖維蛋白原、葡糖腦 苷脂酶、觸珠蛋白、IGF-1、胰島素、纖維蛋白溶酶原、凝血酶原和轉鐵蛋白。
8.權利要求5或6的表達載體，其還包含分別位于所述編碼序列5'和3'端的具有 SEQ ID NO :62和63之核苷酸序列的多核苷酸。
全文摘要
提供了用于基因治療的表達載體，其含有轉錄調控元件的新組合，包括啟動子、增強子、內含子、非翻譯區(UTR)和基因座控制區(LCR)。所述表達載體能夠持續表達肝組織特異性基因，因而能有效地用于治療血栓形成、血友病、肝癌等等。
文檔編號C12N15/67GK101952440SQ200880126705
公開日2011年1月19日 申請日期2008年2月14日 優先權日2008年2月14日
發明者尹成泰, 李圭鉉, 李賢 , 趙義哲, 高垡經 申請人:財團法人牧巖生命工學研究所