專利名稱：：一種轉化體及基于其制備重組人降鈣素基因相關肽的方法
技術領域：
：本發明屬于生物制藥領域，涉及人降鈣素基因相關肽(CGRP)重組質粒的構建、轉化體的構建，融合蛋白的表達以及目的蛋白的純化，特別涉及一種基于轉化體制備重組人降鈣素基因相關肽的方法。
背景技術：
：降鈣素基因相關肽(CacitoninGene-RelatedPeptide,簡稱CGRP)是1983年Rosenfeld等應用分子生物技術發現的一種生物活性多肽，是由37個氨基酸組成Ala-Cys-Asp誦Thr-Ala畫Thr-Cys-Val-Thr國His-Arg-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser畫Arg-Gly-Gly國Val-Val-Lys陽Asn畫Asn-Phe畫Val畫Pro-Thr-Asn曙Val-Gly-Ser畫Lys-Ala-Phe-NH2。CGRP與降鈣素來自一個共同的由2800個堿基對組成基因，其中含有5個內含子和6個外顯子。該基因在不同的組織中進行基因重組在甲狀旁腺可以轉錄、表達成降鈣素，而在神經系統可以轉錄、表達成CGRP。人的CGRP有ot和P兩種分子型式，其氨基酸的組成和排列基本相同，僅在第3、22、25為的氨基酸不同a型為Asp、Val和Asn，P型為Asn、Met和Ser;CGRP的基因亦有a和P兩種，分別表達a和P型的CGRP，均為單拷貝基因，定位在第11號染色體的短臂上。CGRP的mRNA最先翻譯成分子量為16000Da、由128個氨基酸組成的CGRP前體，存貯于分泌顆粒內，釋放時酶解成CGRP發揮其生物學作用。CGRP是人體內由感覺神經末梢釋放的一種重要的神經血管調節肽，它是目前已知的舒血管作用最強的內源性舒血管物質，且可抑制平滑肌細胞增殖。CGRP在CGRP能神經纖維分化成熟，CGRP能神經纖維廣泛分布于中樞和外周的血管壁上，在心臟的CGRP能神經纖維一般沿心肌纖維或冠狀動脈平行走向，亦可交織成網，形成神經叢。CGRP主要分布于神經系統，亦廣泛分布于心血管系統和肺組織內，正常人血漿的CGRP水平為32.9±11.7pg/ml。在心臟CGRP主要存在于心房、心室、室間隔、竇房結、房室結、乳頭肌和冠狀動脈壁的神經纖維內，在心臟局部副交感神經節、心內膜和外膜亦有CGRP。心內CGRP分布是不均勻的心房高于心室，右心房高于左心房，近心外膜的含量高于近心內膜的含量。在血管系統，幾乎所有的血管床均有CGRP分布，尤以腹主動脈、腸系膜動脈、頸總動脈、腎動脈、中腦動脈、基底動脈、下腔靜脈、股靜脈的含量為高，其含量最高達50pmol/g。CGRP能神經纖維在血管外膜或平滑肌層交織成網，包繞著整個血管，是調節心血管活動的重要的肽能神經纖維。CGRP舒張冠狀動脈和腦血管的作用不依賴內皮細胞的完整性，取出內皮細胞其舒張血管的作用依然存在，CGRP對粥樣硬化的冠狀動脈仍有舒張作用。CGRP舒張血管降低血壓的作用可能是對血管的之間抑制作用所引起的，其作用不受預先使用使用腎上腺素受體阻斷劑、膽堿能受體或組織胺受體阻斷劑，利血平耗竭兒茶酚胺，切除迷走神經或前列腺素合成抑制劑的影響。CGRP對心臟具有正性變力和變時性作用，可使心率加快，心肌收縮力增強，心輸出量增加。其作用對心房肌尤其明顯，且較去甲腎上腺素強大。在心房、心室和血管存在有CGRP特異性受體，CGRP與其受體結合后，可以激活腺苷酸環化酶，促進細胞內cAMP水平升高發揮其生物學效應。此外，CGRP還可促進前列環素的釋放的釋放和細胞內外的NaVC^+交換。CGRP作為人體已知最強的擴張血管物質，其舒張作用比較臨床上常用的硝酸甘油或硝普鈉血管擴張作用強240倍，亦強于P物質、心鈉素和異丙基腎上腺素的血管擴張作用。CGRP在臨床上可減輕心絞痛，減少心絞痛發作頻率，降低高血壓，治療心律失常和心力衰竭。CGRP還可以保護在缺血型情況下心腦腎細胞免受損傷，保護人重要生命器官的功能。CGRP近年來5成為研究心臟和血管系統的熱點，在CGRP對心律失常、急性心肌梗塞、冠狀動脈造影、心肌缺氧、阿霉素性心肌損傷、高血壓和血糖的調節進行了大量的探索和驗證實驗。鑒于CGRP對于心、腦以及血管的作用，CGRP或其拮抗劑作為藥物治療存在廣泛的需求。目前CGRP主要依靠化學合成，將氨基酸殘基按照CGRP氨基酸序列合成。具有生物活性的成品含量低，作用不甚理想，價格昂貴。或者由動物心臟和肌肉為原料提取，但是生產原料有限，成本高；獲得的產品純度和比活性都很低。
發明內容本發明解決的問題在于利用生物技術實現人降鈣素基因相關肽(CGRP)的制備，包括構建CGRP重組質粒，轉化宿主細胞獲得穩定表達CGRP的轉化體，以及純化、制備方法。本發明通過以下技術方案來實現一種轉化體，其宿主細胞是大腸桿菌TB1(E.coliTBl)，導入宿主細胞的表達載體為pMAL-CGRP線性載體，其中，CGRP為重組人降鈣素基因相關肽基因，通過Xmnl酶切位點克隆入pMAL-c2X載體，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；該轉化體保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209021。一種基于上述轉化體的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，包括下步驟1)菌株培養在酵母培養基中培養CCTCCM209021菌株至對數期，然后按l:101:100的比例轉接于50500L的含氨芐青霉素50mg/L的酵母培養基培養，培養到對數生長期時用IPTG誘導培養35小時，此時CCTCCM209021菌株表達出MBP-CGRP融合蛋白；2)融合蛋白的純化a、誘導表達后的培養液經冰凍離心機離心，收集菌體沉淀；b、按lg菌體力Q510mlSTE緩沖液的比例將凍存的濕菌重懸，然后加入裂解液進行裂解，裂解后的菌體在4'C條件下12000rpm離心20min，收集上清；所述的STE緩沖液20mMTris-HClpH7.5，100mMNaCl，lmMEDTA;所述的裂解液蔗糖200500g，0.5M的EDTA2ml，pH8.0的3MTris-Hcl10ml加水至1000ml;c、上清用親和層析柱洗脫，用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，所述洗脫液llgNacl，0.5M的EDTA2ml，pH7.4的lMTris-Hcl20ml加水至勵Oml;3)CGRP的純化用凝血因子Xa消解收集的融合蛋白洗脫峰，從融合蛋白切下CGRP,然后通過葡聚糖G25層析柱收集CGRP。,所述的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，所述的裂解液或者為包含質量分數為1%的NP-40溶液或者質量分數為in/。的SDS溶液。所述的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明通過構建表達載體pMAL-CGRP，該載體轉化到大腸桿菌后得到穩定表達pMAL-CGRP載體的，保藏編號為CCTCCM209021的轉化體。2、構建CGRP重組質粒，該轉化體穩定表達MBP-CGRP融合蛋白，在得到純化后的融合蛋白后，用凝血因子Xa從融合蛋白切下CGRP，得到高活性的CGRP。3、與化學合成或者生物提取CGRP相比，本發明通過現代生物工程實現了具有高活性的CGRP的規模生產，成本大大降低，生產條件溫和、易于控制；所得CGRP不僅生物活性超強，而且比化學合成的CGRP半衰期延長近兩倍。4、與其他生物工程制備具有CGRP活性的融合蛋白相比，本發明實現了CGRP從融合蛋白的分離，保證了生物活性，降低了異源性，高效無毒。保藏說明本發明所述的轉化體進行了下述保藏保藏時間2009年2月12日；保藏單位中國典型培養物保藏中心，CCTCC，湖北省武漢市武漢大學；保藏編號為CCTCCM209021;分類命名^sc力ehch'sCo/!.TBl/p亂-c2X。圖l是pMAL-c2X載體的質粒圖譜；圖2是重組質粒pMAL-CGRP的XmnI酶切電泳圖；圖3是克隆入重組質粒的CGRP部分的DNA測序結果圖；圖4是15。/。SDS-PAGE檢測IPTG誘導CGRP表達的電泳圖；圖5是12。/。SDS-PAGE檢測CGRP表達及純化過程的電泳圖；圖6是融合蛋白的免疫印跡鑒定圖；圖7是CGRP的HPLC分析圖譜；圖8是CGRP等電點聚焦電泳圖譜；圖9是CGRP的質譜檢測圖譜。圖10是CGRP對雄兔眼睛血管擴張的檢測圖，其中，圖A為雄兔右眼未處理前，圖B為雄兔右眼給10plCGRP(10)Lig/ml)后3min的檢測圖，圖C雄兔右眼給10]LilCGRP(10|Lig/ml)后7min的檢測圖，圖D雄兔右眼給10inlCGRP(10|iig/ml)后12min的檢測圖。具體實施例方式下面對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。8一種轉化體，其宿主細胞是大腸桿菌TB1(E.coliTBl),導入宿主細胞的表達載體為pMAL-CGRP線性載體，其中，CGRP為重組人降轉素基因相關肽基因，通過XmnI酶切位點克隆入pMAL-c2X載體載體，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示；該轉化體保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209021。上述轉化體的制備，通過以下步驟實施1)表達載體pMAL-CGRP的構建a、CGRP的序列設計.在GenBank中查找人p-CGRP基因，根據其翻譯的氨基酸序列，并按大腸桿菌的慣用密碼設計并人工合成一段114bp的核苷酸，其序列如SEQ.ID.NO.1所示gcttgcgacaccgctacctgcgttacccaccgtctggctggtctgctgtctcgttctggt60ggtgttgttaaaaacaacttcgttccgaccaacgttggttctaaagctttctga114b、pMAL-c2X載體質粒用XmnI酶切pMAL-c2X載體大小約6.7Kbp，載體宿主為E.coli，Amp抗性，購自美國NEB公司(NewEnglandBiolabs)，X腿I的酶切位點為ggaaggatttca，其質粒圖譜如圖l所示。pMAL-c2X質粒經XmnI酶切得到線性化片段，用試劑盒(購自NEB公司)回收線性化片段。c、將SEQ.ID.NO.l所示的CGRP序歹ijPCR擴增，退火產物用Klenow酶(購自NEB公司)補平PCR產物末端。d、將末端補平的CGRP序列和回收的pMAL-c2X線性片段用T4DNA連接酶連接，得到表達載體pMAL-CGRP。e、表達載體pMAL-CGRP轉化感受態TBl細胞，37'C恒溫箱培養12h后挑取單克隆菌落接種于含氨芐青霉素(Amp)100mg/L的LB培養液中，搖床37'C培養后收菌提取質粒后Xmnl酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定；如圖2重組質粒pMAL-CGRP的酶切電泳圖所示，圖中泳道l:DNAmarker;泳道2、3:重組質粒pMAL-CGRP經XmnI酶切獲得預期114bp大小的插入片段。提取質粒后DNA測序結果顯示與所合成CGRP序列插入到了pMAL-c2X載體，如圖3所示的DNA測序結果圖，上下箭頭之間標注部分所示的序列與SEQ.IE.NO.l所示的序列一致，并且上下箭頭兩側的序列分別為ggaagg和atttca，為XmnI的酶切識別位點；至此pMAL-CGRP表達載體構建成功。2)轉化體的構建a、感受態細胞的制備取大腸桿菌TB1菌種按1:100的體積比接種入LB培養液，在37'C振蕩培養過夜，次日轉接一次，繼續培養至OD600為0.40.6，無菌操作下將菌液冰浴10min，在離心為3000rpmX5min，溫度為4。C下棄去上清液，加入沉淀物1/2體積預冷的100mmol/L的CaCl2，吹起沉淀，冰浴40min，在離心為3000rpmX5min,溫度為4°(:下棄去上清液后加入沉淀物1/25體積的含質量濃度25%的甘油和100mmol/L的CaCl2的混合溶液再次吹起沉淀，分裝入Eppendor滑中，-7(TC保存備用；b、感受態細胞的轉化將大腸桿菌感受態細胞從-7(TC中取出，冰浴融解510分鐘，加入含有重組質粒pMAL-CGRP的懸液，輕微混勻，繼續冰浴30分鐘，然后鋪板，含氨芐青霉素(Amp)50mg/L的酵母培養基培養，37'C孵箱培養過夜；所述的酵母培養基組分酵母浸出粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，葡萄糖2g，PH7.4，加水至1000ml。c、藍白篩選轉化體將pMAL-CGRP轉化到感受態的大腸桿菌TBl宿主菌中，37'C恒溫箱培養12h后挑取邊緣整齊，生長狀態良好的菌落，接種于含氨芐青霉素50mg/L的酵母培養液中，搖床37'C培養過夜；次日以l:100的體積比接種于新鮮的含氨芐青霉素50mg/L的酵母培養液中，371:繼續培養至細菌密度達到00600=0.40.6，加入O.OlmMIPTG誘導4h后12000rpm離心20min收取白色克隆的細菌，-20^保存。所述轉化體保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209021。基于上述轉化體的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，包括下步驟1)菌株培養在酵母培養基中培養CCTCCM20902l菌株至對數期，然后按l:IO的比例轉接于50L,或者按l:100的比例轉接于500L的含氨芐青霉素50mg/L的酵母培養基培養，培養到對數生長期時用IPTG誘導培養35小時，此時CCTCCM209021菌株表達出MBP-CGRP融合蛋白；2)融合蛋白的純化a、誘導表達后的培養液經冰凍離心機離心，收集菌體沉淀；b、按lg菌體加510mlSTE緩沖液的比例將凍存的濕菌重懸，然后加入裂解液進行裂解，裂解后的菌體在4'C條件下12000rpm離心20min，收集上清；所述的STE緩沖液20mMTris-HClpH7.5，100mMNaCl，lmMEDTA;所述的裂解液蔗糖200500g，0.5M的EDTA2ml，pH8.0的3MTris-Hcl10ml加水至1000ml;或者為包含質量分數為1%的NP-40溶液或者質量分數為P/。的SDS溶液。c、上清用AmyloseResin(購自NEB公司)親和層析柱洗脫，用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，融合蛋白的洗脫時間為1215min，所述洗脫液11gNacl，0.5M的EDTA2ml，pH7.4的lMTris-Hcl20ml加水至1000ml;ii或者用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析，冷凍保存。3)CGRP的純化用凝血因子Xa消解收集的融合蛋白洗脫峰，從融合蛋白切下CGRP，然后通過葡聚糖G25層析柱收集CGRP;CGRP的洗脫時間為15min。對上述CGRP表達過程及純化分別做以下鑒定a、SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測15G/oSDS-PAGE檢測，參見圖4;圖中，泳道10:蛋白質marker,9.74、6.62、4.3、3.1、2.01、1.44KDa;泳道1-9經過IPTG不同時間的誘導表達;12。/。SDS-PAGE檢測，參見圖5;圖中，泳道7:蛋白質marker,9.74、6.62、4.3、3.1、2.01、1.44KDa;泳道l國3IPTG誘導表達;泳道4:裂菌上清；泳道5:裂菌沉淀；泳道6:過AmyloseResin層析柱后約4.3KDa融合表達區帶。比較上述SDS-PAGE結果圖，可知經過IPTG誘導，表達載體pMAL-CGRP得到了表達，重組蛋白MBP-CGRP是在裂菌后的上清中，經過柱層析之后得到純化的重組蛋白，如泳道6所示的清晰的條帶。b、免疫印跡鑒定電泳結束后，拆下凝膠，按照Bio-Rad產品說明，將凝膠靠近陰極一側、硝酸纖維(NC)膜靠近陽極一側，在預冷的轉移緩沖液(25mMTris、192mMGlycine、20%甲醇)中100V恒壓電泳50分鐘，將蛋白轉移至NC膜上。電泳結束后，取出NC膜，洗漆液TBST(20mMTris-HCl，pH7.5、150mMNaCl，0.05%Tween-20)清洗后浸入封閉液(含2%BSA的TBST)中室溫封閉1h，TBST室溫洗3次，每次5min，加入鼠源性的抗CGRP作為一抗，室溫孵育lh，TBST室溫洗3次，每次5min，再加入人抗鼠作為二抗，室溫孵育1h，TBST室溫洗3次，每次5min，最后用TBS(20mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl)洗3次，NC膜浸入DAB(3',3，-二甲基聯苯胺)顯色液中，室溫避光顯色lmin，蒸餾水沖洗終止反應。參見圖4，圖中泳道l為標準品；泳道2:為融合蛋白MBP-CGR。c、CGRP的HPLC的檢測用凝血因子Xa從融合蛋白切下CGRP，通過葡聚糖G25層析柱收集之后得到純化的CGRP。說明HPLC柱層析的為C18，流動相為乙腈甲醇=20:80，檢測波長為215nm，如圖7所示的HPLC檢測圖譜，本發明所得在CGRP在12分鐘得到CGRP的峰值，與標準品一致；計算峰值面積，得到CGRP的純度大于95%。d、CGRP的等電點檢測如圖8所示對CGRP等電點聚焦電泳圖譜，泳道1所示從上到下PH值為3.5、4.55、5.20、5.85、6.55、6.85、7.35、8.15、8.45、8.65、9.3;泳道2所示CGRP的PH為8，與預期相符合。e、CGRP的分子量檢測將本發明所得CGRP送交北京質譜中心進行質譜檢測，如圖9所示的CGRP質譜檢測圖，所示CGRP的分子量為4135，與理論值相當。動物模型實驗檢測CGRP生物活性在CGRP生物活性實驗中，將1毫克的CGRP作不同劑量的稀釋滴入兔眼，每種稀釋劑量以8只兔眼作實驗組，另以生理鹽水代替樣品作對照組，在倒置顯微鏡的觀察下，通過測微計測量，血管擴張作用十分顯著。當1毫克樣品稀釋到10-10時，仍表現出血管擴張作用。更令人振奮的是血管擴張作用在7分鐘時達到高峰，擴張作用可持續15分鐘以上。這個實驗結果充分證明了本發明用基因重組制備的的CGRP不僅生物活性超強，而且比化學合成的CGRP半衰期延長近兩倍。參照王軍志主編.《生物技術藥物研究開發和質量控制》，科學出版社；584。具體實驗步驟如下-①劑量設置高劑量組每次滴入l.OpgCGRP，按實驗方法要求，以10的倍數為比例進行稀釋，得到中劑量組和低劑量組每次加藥的量。②給藥途徑原位滴入給藥③給藥確認家兔眼球無充血后入選實驗，用10%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30mg/kg)，麻醉后將動物側臥，置于倒置顯微鏡下，直接觀察眼球結膜，至血管清晰地在計算機屏幕上成像。在被觀察球結膜血管處原位滴入受試樣品溶液，在計算機上采集同一處毛細血管直徑變化的清晰圖象。根據預實驗結果，于加藥后0、1、2、3、5、7、9、12、15min采集毛細血管直徑變化的清晰圖象，一只眼睛一個劑量共觀察15min。生理鹽水組實驗時按同樣的方法觀察，只是將加樣藥液改成生理鹽水，一只眼睛觀察15min。④指標觀察觀察毛細血管的直徑。(D實驗結果家兔球結膜血管直徑的變化率，即(處理前血管直徑-處理后血管直徑)/處理前血管直徑X100。/。的結果如下表1，其中，低劑量0.01嗎/次(溶液濃度l嗎/ml，n=8)，中劑量0.1嗎/次(溶液濃度10嗎/ml，n=8)，高劑量1.0(ig/次(溶液濃度100ug/ml，n=8)表l各組各時間點家兔球結膜血管直徑的變化率(平均值土標準差，單位％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>對上述結果采用SPSS統計軟件進行處理，組間比較用重復測定雙因素方差分析的統計方法；各組內不同時間點的比較用方差分析的方法。統計結果表明高、中、低劑量組與生理鹽水組比較，均有顯著性差異(P<0.01);高、中劑量組間有顯著性差異(P<0.01)。這說明CGRP具有明顯的擴血管作用，結合預實驗結果，最大有效濃度是10pg/ml。此外，如圖10A-D所示，其中，圖A為雄兔右眼未處理前，圖B雄兔右眼給10nlCGRP(10pg/ml)后3min，圖C雄兔右眼給10iulCGRP(10pg/ml)后7min，圖D雄兔右眼給10nlCGRP(10嗎/ml)后12min;給藥后可見到明顯的血管擴張中出現毛細血管增多的現象，說明毛細血管處于擴張狀態。滴入生理鹽水的各時間點與未滴入生理鹽水時相比，均無顯著性差異(P〉0.05);高、中、低劑量組原位滴入人重組降鈣基因相關肽(CGRP)的各時間點與未給藥時相比，均有顯著性差異(P<0.05)。這說明CGRP起效很快，作用持續時間超過15min。核苷酸序列表〈110>馬挺光〈120〉一種基于轉化體制備重組人降鈣素基因相關肽的方法〈160〉1<210〉1〈211>114〈212〉腿〈213>人工合成〈400〉1gcttgcgacaccgctacctgcgttacccaccgtctggctggtctgctgtctcgttctggt60ggtgttgttaaaaacaacttcgttccgaccaacgttggttctaaagctttctga1141權利要求1、一種轉化體，其特征在于，其宿主細胞是大腸桿菌TB1(E.coliTB1)，導入宿主細胞的表達載體為pMAL-CGRP線性載體，其中，CGRP為重組人降鈣素基因相關肽基因，通過XmnI酶切位點克隆入pMAL-c2X載體，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；該轉化體保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCM209021。2、一種基于權利要求1所述轉化體的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，其特征在于，包括下步驟1)菌株培養在酵母培養基中培養CCTCCM209021菌株至對數期，然后按l:101:100的比例轉接于50500L的含氨芐青霉素50mg/L的酵母培養基培養，培養到對數生長期時用IPTG誘導培養35小時，此時CCTCCM209021菌株表達出MBP-CGRP融合蛋白；2)融合蛋白的純化a、誘導表達后的培養液經冰凍離心機離心，收集菌體沉淀；b、按lg菌體加510mlSTE緩沖液的比例將凍存的濕菌重懸，然后加入裂解液進行裂解，裂解后的菌體在4"C條件下12000rpm離心20min，收集上清；所述的STE緩沖液20mMTris-HClpH7.5，100mMNaCl，lmMEDTA;所述的裂解液蔗糖200500g，0.5M的EDTA2ml，pH8.0的3MTris-Hcl10ml加水至1000ml;c、上清用親和層析柱洗脫，用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，所述洗脫液llgNacl，0.5M的EDTA2ml，pH7.4的lMTris-Hcl20ml加水至畫0ml;3)CGRP的純化用凝血因子Xa消解收集的融合蛋白洗脫峰，從融合蛋白切下CGRP，然后通過葡聚糖G25層析柱收集CGRP。3、如權利要求2所述的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，其特征在于，所述的裂解液為包含質量分數為1%的NP-40溶液或者質量分數為1%的SDS溶液。4、如權利要求2所述的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，其特征在于，用洗脫液反復洗脫后收集融合蛋白洗脫峰，然后用密理博透析膜(Millimore)透析。全文摘要本發明公開了一種基于轉化體制備重組人降鈣素基因相關肽的方法，所述轉化體宿主細胞是大腸桿菌TB1(E.coliTB1)，導入宿主細胞的表達載體為pMAL-CGRP線性載體，其中，CGRP為重組人降鈣素基因相關肽基因，通過XmnI酶切位點克隆入pMAL-c2X載體，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；基于該轉化體的重組人降鈣素基因相關肽CGRP制備方法，包括菌株培養、融合蛋白的純化、CGRP的純化得到具有高活性的CGRP，該方法制備CGRP成本大大降低，生產條件溫和、易于控制。文檔編號C12N1/21GK101613670SQ20091002176公開日2009年12月30日申請日期2009年3月31日優先權日2009年3月31日發明者馬梃光,馬炳潔申請人:馬梃光;馬炳潔