專利名稱：一種集成微流控芯片及其用于活細胞控制與分析的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微流控芯片，尤其是一種集成微流控芯片，應用該集成微流控芯片能夠進行時間與空間控制不同種類細胞的定位培養及相互作用研究。
背景技術：
微流控芯片技術是指把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離和檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米或更小的芯片上，由微通道網絡運輸流體貫穿于整個系統以控制生物或化學反應過程，并對其反應產物進行分析的一種技術。微流控芯片的最大優勢在于微小尺寸下各種功能單元技術的靈活組合和規模集成，其結果是實現最大限度的自動化、高通量和
低消耗。與此同時，微流控芯片的上述特征使得芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)概念向基于微流控芯片平臺的基因診斷、病毒檢測及細胞分析研究的滲透成為可能。這種從傳統的中心實驗室向芯片實驗室的模式轉變將為許多研究工作帶來革命性進步， 一些原本無法實現的工作諸如復雜生物學實驗、微觀生命科學研究、野外考察、疾病現場檢測等將藉助于芯片實驗室得以完成。
由于在高通量、微型化、集成化、自動化和便攜化等方面的巨大發展潛力，近十幾年來，微流控芯片技術受到了國內外生物化學、分析化學、分子毒理學、環境醫學和預防醫學等領域的高度重視，也成為21世紀最為重要的前沿技術之一。目前，基于微流控芯片技術的基因分析、蛋白質(酶)分析、核酸分析、免疫分析等方面的應用，已取得很大的進展。此外，基于微流控芯片技術的單細胞研究也正在有條不紊地進行。國外已初步實現了微米級管道或腔內的多種類型活細胞培養R. Gomez-Sjoberg, A.A. Leyrat, D.M.Pirone， et al., Anal. Chem. 2007， 79(22): 8557-8563.及其實時分析；同時產
生了一批以基于活細胞的藥物篩選與分析系統、細胞傳感器等為代表分析設 備P.J. Lee， RJ. Hung, V.M. Rao, et al.， Biotechnol. Bioeng. 2006， 94(1): 5-14.，其簡單、快捷、高通量和高敏感性優勢，在很大程度上促進了生命 科學研究進展，同時也進一步加速了該技術的多元化、市場化，從而服務于 社會。
然而，微流控芯片技術在細胞生物學領域的應用仍處于發展階段，尤其 涉及到細胞精確控制與定位以及細胞-細胞相互作用方面。針對細胞的控制 與定位，現多采用表面化學修飾法來實現細胞的黏附與脫離E.E.Hui，S.N. Bhatia, PNAS 2007, 104(14): 5722-5726.，且這種方法具有不可逆性和非重 復性。關于細胞相互作用的微流控芯片，目前也僅實現了簡單的平行單管道 7jC平A.P. Wong， R. Perez畫Castillejos， L丄Christopher, et al., Biomaterials 2008: 29(12): 1853-1861.。因此，建立一種多功能集成的微流控芯片分析系統與 平臺，實施細胞的精確控制與定位，開展細胞相互作用研究，不僅有利于研 究工作的簡單、高效、快速的展開，同時也有利于加快所獲得技術成果的市 場化應用。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種集成微流控芯片以及該集成微流控芯片應 用于各種生理和病理情況下的多種細胞相互作用研究。本發明的一種集成微 流控芯片能夠實現多種細胞的精確定位、共培養，開展時間與空間控制的單 細胞水平的生命科學研究。同時，該芯片的應用改變了以往慣用的兩種類型 細胞相互作用研究模式，拓寬了細胞相互作用研究的范圍，發揮了其研究系 統全面性的特點。
為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案
一種集成微流控芯片，其特征在于，該集成微流控芯片自上而下設有流動層、控制層和覆蓋虔，其中，流動層主要由一個微米級管道網絡和四個圓 形細胞培養腔組成，流動層周邊設有八個進樣口和兩個出樣口，中間設有四
個圓形細胞培養腔，圓形細胞培養腔之間通過細管道相連；控制層設有二十 八個進氣口，進氣口上分別連接單個管道末端封閉的微闊開關；覆蓋層則是 對控制層的管道進行封裝。
上述集成微流控芯片的制備方法，其特征在于，采用軟光刻技術，首先 將流動層和控制層的設計結構制成光掩膜;然后進行光刻膠涂膜、紫外曝光、 顯影，制備芯片模子；最后將聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已知的彈性 高分子材料覆蓋于芯片模子表面，烘烤固化，顯微鏡下將流動層和控制層校 對粘合，再將控制層與覆蓋層粘合封裝，制成集成微流控芯片。
本發明具有如下優點
1、 本發明的集成微流控芯片選用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已 知的彈性高分子材料，相對于以往芯片材料(如硅、玻璃和石英等)而言， 具有更好的生物兼容性、電絕緣隔離性、熱隔離性等性能，且具有優異的透 光性。以上優點便于開展活細胞為基礎的相關研究。
2、 本發明的集成微流控芯片的控制層微閥開關結構，可以在特定時間 對流動層特定區域進行流體的進樣和出樣，以及時間和空間控制各種不同類 型細胞在各自培養區的定位以及共培養。
3、 本發明的集成微流控芯片具有兩兩連接相鄰微型細胞培養區的微米 級管道設計。相鄰細胞培養區的連通，便于研究不同培養區的同型和異型細 胞相互作用。
4、 本發明的集成微流控芯片可開展兩種以上不同類型細胞的相互作用 研究，突破了以往的兩種細胞相互作用研究模式，有利于探索生理或病理情 況下各種生物體和組織器官內不同種類細胞的協作與拮抗。
圖l是集成微流控芯片的流動層和控制層平面結構示意圖，其中標號分別表示1、 2為流動層管道進樣口， 3、 4為流動層管道出樣口， 5、 6、 7和8 為控制層微閥開關的進氣口， 9、 10、 11和12為微型細胞培養區，13為相鄰 培養區的連接管道，14為控制層的微閥開關。
圖2是微閥開關關閉狀態的微流控芯片截面圖，其中標號分別表示21 為流動層單個管道，22為關閉狀態的控制層微閥開關，23為控制層微閥開關 的進氣管道，24為控制層微閥開關的進氣口。
圖3是流動層管道半關閉狀態的微流控芯片截面圖，其中標號分別表示: 31為半開啟狀態的微閥開關，32為低氣壓氣體進入微閥開關管道。
圖4是流動層管道完全關閉狀態的微流控芯片截面圖，其中標號分別表 示41為完全開啟狀態的微闊開關，42為較高氣壓氣體進入微閥開關管道。
圖5是集成微流控芯片內定位接種第一種細胞的示意圖，其中51為關閉 狀態的微閥開關，52為完全開啟狀態的微閥開關，53為第一種細胞。
圖6是集成微流控芯片內定位接種第一種細胞后清洗的示意圖，其中61 為清洗液進入路線。
圖7是集成微流控芯片內定位接種第二種細胞的示意圖，其中71為第二 種細胞。
圖8是集成微流控芯片內定位接種第二種細胞后清洗的示意圖，其中81 為清洗液進入路線。
以下結合附圖和發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
實施例l:
如圖1所示，本實施例制備的集成微流控芯片，由流動層、控制層和覆 蓋層(自上而下)三層組成。其中，流動層周邊設有八個進樣口 (如圖標號 1、 2處，每處4個)以及兩個出樣口 (如圖標號3、 4處)，中間設有四個圓形 細胞培養腔(如圖標號9、 10、 11、 12)，通過細管道13將相鄰的腔體兩兩連 接以進行細胞相互作用研究。控制層設有共二十八個進氣口 (如圖標號5、 6、 7、 8處，每處7個)，分 別連接單個管道末端封閉的微閥開關。
微流控芯片的制作(以PDMS微流控芯片的制作為例)
1、 采用軟光刻技術制備芯片模子，首先將流動層和控制層的設計結構 制成光掩膜；然后進行光刻膠(SU-8)涂膜、使用曝光機進行紫外曝光， 隨后用顯影劑進行顯影，從而制備出芯片模子，其中流動層模子的厚度為40
控制層模子的厚度為25iim。
2、 微流控芯片的制備將聚二甲基硅氧垸(PDMS)預聚物分別覆蓋 于流動層和控制層模子表面，其中流動層所用PDMS預聚物(合成橡膠:交聯 劑，比例為5:1)，控制層所用PDMS預聚物(合成橡膠:交聯劑，比例為20:1), 分別烘烤固化，然后將流動層和控制層在顯微鏡下校對粘合。將該雙層以控 制層表面粘合于涂有均勻PDMS預聚物(合成橡膠:交聯劑，比例為5:1)的 覆蓋層的玻片上封裝。最后放入烘箱內烘烤，加速層層粘合，從而制備出 PDMS集成微流控芯片。
實施例2:
控制層進氣口上的微閥開關對流動層管道的控制如圖2所示，進氣口24 未進氣時，微閥開關管道23內處于大氣壓狀態，微閥開關22則處于關閉狀態， 此時流動層管道21暢通，管道內樣品可任意出入；當較低壓強(20 psi)氣 體32進入微閥開關管道時(圖3所示)，微閥開關31膨脹而呈現凸起，使流動 層管道處于半關閉狀態；進一步，如圖4所示，當較高壓強(40psi)氣體42 進入微閥開關管道時，微閥開關41與流動層管道完全緊貼，封閉了流動層管 道，從而達到控制流動層管道內樣品出入的目的。 實施例3:
本實施例以微流控芯片內進行肝癌細胞和成纖維細胞定位培養為例。 1、首先將制備的實施例l中的微流控芯片進行高壓滅菌，然后對流動層 管道和腔體進行清洗(采用微量注射泵進樣，清洗液選用0.01M的PBS，pH=7.4，流速25nL/min，時間15min)，再對流動層管道和腔體的表面進行 包被修飾(包被修飾物選用多聚-L-賴氨酸，10(Hig/mL， 37°C， 2h)，再清洗 (同樣采用微量注射泵進樣，清洗液選用0.01M的PBS， pH=7.4，流速 25nL/min，時間15min)，無菌氣體吹干，待用。
2、 制備肝癌細胞和成纖維細胞懸液，本實施例中選用肝癌細胞系細胞 (HepG2細胞)和成纖維細胞系細胞(NIH3T3細胞)，通過常規體外細胞培
養，進行細胞數目的擴增。臨用時將細胞分別消化，離心，重懸，細胞密度 調整為l(^個細胞/mL。
3、 細胞進樣，首先對肝癌細胞進行進樣(如圖5所示)，將肝癌細胞培 養區和細胞進樣路線的微閥開關關閉，其它細胞培養區和管道的微閥開關開 啟，形成單一通路，配合微量注射泵，將肝癌細胞接種于特定的培養區內； 開啟肝癌細胞培養區微閥開關(如圖6所示)，使肝癌細胞定位于該區域，然 后對進樣路線中的周邊管道進行清洗(DMEM細胞培養液)，以便于進行下 一種細胞的進樣，防止不同種類細胞的交叉污染。靜置20min，促進細胞貼 壁。第二步，成纖維細胞進樣(如圖7所示)，將成纖維細胞培養區和細胞進 樣路線的微閥開關關閉，其它細胞培養區和相關管道的微閥開關開啟，配合 微量注射泵，將成纖維細胞接種于特定的培養區內；開啟成纖維細胞培養區 微閥開關(如圖8所示)，關閉該培養區，然后對進樣路線中的周邊管道進行 清洗，并靜置10min。
4、 芯片內細胞的培養，參照生物體體內狀態，盡量保障相對靜態的細 胞生長環境，采用隔時微量進樣方式，配合微量注射泵進樣功能，對芯片內 細胞進行營養的供給(細胞培養液)，每2小時進樣一次，每次lmin，進樣速 率為5pL/min，此時4個細胞培養區的微闊開關均為關閉狀態。細胞生長和細 胞行為則通過倒置顯微鏡進行定時觀察、記錄。
權利要求
1、一種集成微流控芯片，其特征在于，該集成微流控芯片自上而下設有流動層、控制層和覆蓋層，其中，流動層主要由一個微米級管道網絡和四個圓形細胞培養腔組成，流動層周邊設有八個進樣口和兩個出樣口，中間設有四個圓形細胞培養腔，圓形細胞培養腔之間通過細管道相連；控制層設有二十八個進氣口，進氣口上分別連接單個管道末端封閉的微閥開關；覆蓋層則是對控制層的管道進行封裝。
2、 如權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述集成微流 控芯片的材料為聚二甲基硅氧垸，或者是已知的彈性高分子材料、玻璃及其 硅相結合的芯片材料。
3、 如權利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述的控制層 進氣口上的微閥開關，分別用于對流動層不同管道位置的樣品輸入和輸出進 行時間和空間的控制。
4、 權利要求1所述的集成微流控芯片的制備方法，其特征在于該方 法首先將流動層和控制層的設計結構制成光掩膜；然后進行光刻膠涂膜、紫 外曝光、顯影，制備芯片模子；最后將聚二甲基硅氧垸或其他已知的彈性高 分子材料覆蓋于芯片模子表面，烘烤固化，顯微鏡下將流動層和控制層校對 粘合，再將控制層與覆蓋層粘合封裝，制成集成微流控芯片。
5、 權利要求1所述的集成微流控芯片用于活細胞控制與分析的應用。
6、 如權利要求5所述的應用，其特征在于，對兩種以上不同種類的細 胞在集成微流控芯片的不同區域進行定位接種和共培養以及開展多種細胞 的相互作用研究。
7、 如權利要求5所述的應用，其特征在于，通過細管道將相鄰的圓形 細胞培養腔直接兩兩連接，便于不同區域培養的不同種類細胞的相互作用。
全文摘要
本發明公開了一種適用于不同種類細胞定位、培養和相互作用的集成微流控芯片，由流動層、控制層和覆蓋層(自上而下)三層組成。其中，流動層主要由一個微米級管道網絡和四個圓形腔組成，通過細管道將相鄰的腔體兩兩連接，該層總共有十個進出樣口。控制層由數個單管道末端封閉的微閥開關組成，可以分別對流動層不同管道位置的樣品輸入和輸出進行時間和空間的控制。本發明的集成微流控芯片具有制備材料優質、制備方法重復性強、應用范圍廣的優點。可開展對多種類細胞的定位共培養及相互作用研究。
文檔編號C12M3/00GK101597568SQ20091002316
公開日2009年12月9日 申請日期2009年7月2日 優先權日2009年7月2日
發明者麗 任, 任莉莉, 劉文明, 鵬 宋, 立 李, 王旭明, 王進義, 王雪琴 申請人:西北農林科技大學