專利名稱：一種精制β-葡萄糖苷酶發酵液的生產方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及P -葡萄糖苷酶發酵液精制的生產方法。
背景技術：
P -葡萄糖苷酶(3 -Glucosidase)系統名稱是0 -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶 (P-D-Glucoside glucohydrolase; EC3. 2. 1.21)，是纖維素酶系的一個組成 部分，它廣泛分布與動物、植物和微生物中，它能催化水解含有烷基和芳香基 團的P -葡萄糖苷鍵以及水解二糖和低聚糖，被廣泛應用于各類生物技術行業 中。在工業上，e-葡萄糖苷酶被應用于分解木質纖維素生產燃料乙醇，隨著環 境和開發新型產品解決能源危機的問題受到日益重視，乙醇燃料無疑將成為替 代能源產品的新的開發方向。在食品行業中，P -葡萄糖苷酶也是一種很重要的 酶，它能將水果中糖苷酶前體的芳香族化合物釋放變為具有濃郁香味的化合物， 從而改善果汁的風味。在醫藥保健品行業中，P -葡萄糖苷酶通過生物轉化功能, 將無活性的化合物轉化成有生物活性的化合物，如3 -葡萄糖苷酶將大豆異黃酮 糖苷轉化成有生物活性的苷元時，才能發揮改善更年期綜合癥、預防骨質疏松、 抗氧化等生物學功能。目前，葡萄糖苷酶的制備通常采用的方法是先用微生物發酵方法得到 含P-葡萄糖苷酶的發酵液，該過程中采用霉菌作為目標菌，繁殖速度慢，發酵 時間長；再對含e-葡萄糖苷酶的發酵液進行分離純化，分離純化過程沿用蛋白質純化的經典步驟，如硫酸鹽沉淀、離子交換及柱層析等方法。因步驟復雜且 成本較高，因此大多數僅限于實驗室研制開發階段，國內外工業化生產P-葡萄 糖苷酶制劑的企業相對較少。復旦大學周珮等人發明用微晶纖維素作為親和層析介質純化P -葡萄糖苷酶 [1]，是直接對P-葡萄糖苷酶原料進行純化，純化步驟簡化，但由于微晶纖維素 的成本較高，因此也限制了e-葡萄糖苷酶的工業化生產。如何高效經濟地生產 3 -葡萄糖苷酶成為我們目前需要解決難題。 參考文獻[i]周珮，嚴欽，馮美卿等."一種分離純化e-葡萄糖苷酶的方法"[專利]專利號200710043571.3 發明內容本發明的目的是提供一種精制0 -葡萄糖苷酶發酵液的生產方法，以克服現 有技術存在的步驟復雜、成本較高和難以實現工業化生產的問題。為克服現有技術存在的問題，本發明提出的技術方案是 一種精制P -葡萄糖苷發酵液的生產方法，依次包括下述步驟一、 制備含e-葡萄糖苷酶的發酵液從納豆中篩選菌株經生化試驗及 16SrRNA序列分析鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為酶原產生菌， 采用黃豆粉培養基，經搖瓶發酵得到含6 -葡萄糖苷酶的發酵液；二、 純化發酵液經過離心除去菌體，采用超濾膜技術，在高壓和常溫條 件下截留有效e-葡萄糖苷酶的成分，脫除發酵液中的雜質和鹽分，得到精制e -葡萄糖苷酶液。上述步驟一中的發酵條件為41 、發酵培養基采用黃豆粉培養基黃豆粉10.0g，酵母膏10.0g，磷酸二 氫鉀1.0g， NaC15.0g，水1000ml， PH-7. 2 7. 4， 121。C滅菌30 min。2、 發酵菌株-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。3、 發酵條件溫度35 37。C，往復式搖床(振幅135次/min)培養72小時。4、 發酵液酶活150. 3IU/ml5、 發酵液處理將在搖床上培養完成的發酵液用低溫離心機在10000 15000rad/min條件下離心15min，留上清液用0. 45 u m的微濾膜過濾后備用。上述步驟二中所述的膜為中空纖維超濾膜組件，根據3 -葡萄糖苷酶的分子 量，選用切割分子量為超濾膜l (100KD)和超濾膜2 (20KD)的超濾膜各一個， 膜材料為聚醚砜(PES)，超濾方式為外壓式；具體操作過程是將含有P-葡萄糖 苷酶發酵液，于高速離心機上在4""C下以10000 15000rad/min離心15min,留 取上清液，測定酶活(檢測方法為DNS酶活測定法)應在150 .0IU/ml以上方 可用；將上清液在20 4(TC溫度，通過0. 45 u m的微濾膜過濾，在0. 1 0. 25MPa壓力下依次經過超濾膜組件1和2，得到精制e -葡萄糖苷酶液。與現有技術相比，本發明的優點是1、 步驟簡單本方法中純化過程通過離心和膜技術分離的物理方法，除 去發酵液中的菌體和其他雜質并截留有效的酶成分，使P -葡萄糖苷酶達到純化 與濃縮。2、 酶活高我們的目標菌株為細菌，其繁殖速度快，發酵時間短；又采 用物理的純化過程，可最大限度的保護酶的活性不受損失，比通常用方法獲得 e-葡萄糖苷酶的酶活要高，可達到600IU/ml以上。3、 成本低采用物理方法的分離設備(膜)，可以反復使用，因此可以大 大降低分離成本。
4、 可實現工業化生產本發明的純化過程是一種物理變化的過程，經過 低溫離心除去菌體，采用膜分離技術，通過確定酶分子量大小，選取合適孔徑
的超濾膜，在0. 10MPa 0. 25 MPa的壓力范圍內設定不同的超濾壓力以及設定 不同的超濾操作溫度(20-40°C)，使超濾能夠連續進行，因此適用于連續的工 業化生產。
5、產品適用范圍廣本發明所用原料為培養微生物的食品級原料，安全、 無毒，可適用于醫藥、食品等各個行業；同時本發明制得的產品是以液體形式 存在，可作為酶制劑，適用于降解纖維素使其生成葡萄糖，這對人類將是一個 很大的貢獻，它可以讓我們擺脫糧食的絕對依賴，緩和世界資源緊張；用于食 品行業中增加果汁的香氣；用于醫藥、保健品行業中，將無活性的黃酮糖苷類 化合物轉化成有活性的苷元。
具體實施例方式
下面將結合實施例對本發明做詳細地說明。
本發明中所有原料和試劑均為食品級和試劑級，其來源及規格如下
組分 規格 產地
黃豆粉 食品級 西安中西公司
酵母膏 BR (生化試劑) 北京博奧星生物技術有限責任公司
磷酸二氫鉀 分析純 西安化學試劑廠
NaCl 分析純 西安化學試劑廠
水 城市自來水3， 5二硝基水楊酸 分析純 國藥集團化學試劑有限公司
水楊苷 分析純 上海化學試劑采購供應站
超濾膜的規格
選用切割分子量分別為100KD和20KD的超濾膜1和超濾膜2，膜為中空纖 維超濾膜，膜材料均為聚醚砜(PES)，超濾方式為外壓式。 實施例1
在攪拌條件下將黃豆粉10克加入到1000ml水中，再順序加入酵母膏10. 0g， 磷酸二氫鉀1.0g， NaC15.0g，加熱溶解，調整PH-7. 3，平均分裝于5個300ml 的三角瓶中，滅菌鍋12rC滅菌30min，備用；將經過活化的自篩菌種Nl在無 菌條件下接入裝有培養基的三角瓶中，置于振幅為135次/min的往復式搖床上， 在35—37-C溫度下，培養72小時，得到含有P-葡萄糖苷酶發酵液；將含有P -葡萄糖苷酶發酵液，于高速離心機上在10000 rad/min條件下離心15min，留 取上清液920ml，再通過0.45um的微濾膜過濾，測定酶活(檢測方法為DNS 酶活測定法)152.2IU/ml;將上清液在4(TC溫度，0. 10MPa壓力下經過超濾膜 l和2，得到精制e-葡萄糖苷酶液220ml,測定酶活601.4IU/ml。 實施例2
在攪拌條件下將黃豆粉10克加入到1000ml水中，再順序加入酵母膏10. Og， 磷酸二氫鉀1.0g, NaC15.0g,加熱溶解，調整PH-7. 3，平均分裝于5個300ml 的三角瓶中，滅菌鍋121X:滅菌30min，備用；將經過活化的自篩菌種Nl在無 菌條件下接入裝有培養基的三角瓶中，置于振幅為135次/min的往復式搖床上， 在35—37°0溫度下，培養72小時，得到含有P-葡萄糖苷酶發酵液；將含有P -葡萄糖苷酶發酵液，于高速離心機上在12000rad/min條件下離心15min，留取上清液900ml，再通過0.45um的微濾膜過濾，測定酶活(檢測方法為DNS 酶活測定法)154. 1IU/ml;將上清液在25t:溫度，0. 15MPa壓力下經過超濾膜 l和2，得到精制P-葡萄糖苷酶液180ml，測定酶活625.4IU/ml。 實施例3
在攪拌條件下將黃豆粉10克加入到1000ml水中，再順序加入酵母膏10. 0g， 磷酸二氫鉀1.0g, NaC15.0g，加熱溶解，調整PH-7. 3，平均分裝于5個300ml 的三角瓶中，滅菌鍋12rC滅菌30min，備用；將經過活化的自篩菌種Nl在無 菌條件下接入裝有培養基的三角瓶中，置于振幅為135次/min的往復式搖床上， 在35—37'C溫度下，培養72小時，得到含有0 -葡萄糖苷酶發酵液；將含有P -葡萄糖苷酶發酵液，于高速離心機上在13000rad/min條件下離心15min，留 取上清液925ml，再通過0.45pm的微濾膜過濾，測定酶活(檢測方法為DNS 酶活測定法)151.6IU/ml;將上清液在3(TC溫度，0. 20MPa壓力下經過經過超 濾膜1和2，得到精制e-葡萄糖苷酶液200ml，測定酶活600.6IU/ml。 實施例4
在攪拌條件下將黃豆粉10克加入到1000ml水中，再順序加入酵母膏10. 0g， 磷酸二氫鉀1.0g， NaC15.0g，加熱溶解，調整PH-7. 3，平均分裝于5個300ml 的三角瓶中，滅菌鍋12rC滅菌30min，備用；將經過活化的自篩菌種Nl在無 菌條件下接入裝有培養基的三角瓶中，置于振幅為135次/min的往復式搖床上，
在35—37-c溫度下，培養72小時，得到含有e-葡萄糖苷酶發酵液；將含有e
-葡萄糖苷酶發酵液，于高速離心機上在15000md/min條件下離心15min，留 取上清液920ml，再通過0.45um的微濾膜過濾，測定酶活(檢測方法為DNS 酶活測定法)155.3IU/ml;將上清液在30'C溫度，0. 20MPa壓力下經過超濾膜l和2，得到精制e-葡萄糖苷酶液200ml ，測定酶活610.9IU/ml。 實施例5
在攪拌條件下將黃豆粉IO克加入到1000ml水中，再順序加入酵母膏10. Og， 磷酸二氫鉀1.0g， NaC15.0g，加熱溶解，調整PH-7. 3，平均分裝于5個300ml 的三角瓶中，滅菌鍋12rC滅菌30min，備用；將經過活化的自篩菌種Nl在無 菌條件下接入裝有培養基的三角瓶中，置于振幅為135次/min的往復式搖床上， 在35—37'C溫度下，培養72小時，得到含有e-葡萄糖苷酶發酵液；將含有P -葡萄糖苷酶發酵液，于高速離心機上在15000 rad/min條件下離15min，留取 上清液920ml,再通過0. 45 u m的微濾膜過濾，測定酶活(檢測方法為DNS酶活 測定法)154.6IU/ml;將上清液在35。C溫度，0. 25MPa壓力下經過超濾膜1和 2，得到精制e-葡萄糖苷酶液200ml，測定酶活620.8IU/ml。
權利要求
1、一種精制β-葡萄糖苷發酵液的生產方法，依次包括下述步驟一、制備含β-葡萄糖苷酶的發酵液從納豆中篩選菌株經生化試驗及16SrRNA序列分析鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為酶原產生菌，采用黃豆粉培養基，經搖瓶發酵得到含β-葡萄糖苷酶的發酵液；二、純化發酵液經過離心除去菌體，采用超濾膜技術，在高壓和常溫條件下截留有效β-葡萄糖苷酶的成分，脫除發酵液中的雜質和鹽分，得到精制β-葡萄糖苷酶液。
2、 如權利要求1所述的一種精制0-葡萄糖苷發酵液的生產方法，其特征 在于所述步驟一中的發酵條件為1 、發酵培養基采用黃豆粉培養基黃豆粉10. 0g，酵母膏10. 0g，磷酸二氫鉀 l.Og， NaC15.0g，水1000ml， PH-7. 2 7. 4， 121。C滅菌30 min。2、 發酵菌株-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。3、 發酵條件溫度35 37。C，往復式搖床(振幅135次/min)培養72小時。4、 發酵液酶活150. 3IU/ml5、 發酵液處理將在搖床上培養完成的發酵液用低溫離心機在10000 15000rad/min條件下離心15min，留上清液用0. 45 u m的微濾膜過濾后備用。
3、 如權利要求1所述的一種精制e-葡萄糖苷發酵液的生產方法，其特征 在于所述步驟二中的膜為中空纖維超濾膜組件，根據e-葡萄糖苷酶的分子量， 選用切割分子量為超濾膜1 (100KD)和超濾膜2 (20KD)的超濾膜各一個，膜 材料為聚醚砜(PES)，超濾方式為外壓式；具體操作過程是將含有0-葡萄糖苷 酶發酵液，于高速離心機上在4。C下以10000 15000rad/min離心15min，留取 上清液，測定酶活(檢測方法為DNS酶活測定法)應在150 .0IU/ml以上方可 用；將上清液在20 40。C溫度，通過0.45nm的微濾膜過濾，在0.1 0. 25MPa 壓力下依次經過超濾膜組件1和2，得到精制0 -葡萄糖苷酶液。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及β-葡萄糖苷酶發酵液精制的生產方法。本發明要克服現有技術存在的步驟復雜、成本較高和難以實現工業化生產的問題。一種精制β-葡萄糖苷酶發酵液的方法，本發明所述的制備原理以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為酶原產生菌，經搖瓶發酵得到含β-葡萄糖苷酶的發酵液，經過離心除去菌體和雜質，采用膜分離技術，在高壓和常溫條件下截留有效β-葡萄糖苷酶的成分，從而達到精制β-葡萄糖苷酶液的目的。該方法具有制備簡單、制備成本低、性能穩定、安全性高、適用面廣的優點，為工業化生產β-葡萄糖苷酶提供了一個新的途徑。
文檔編號C12N9/42GK101671660SQ20091002418
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者皎 李, 楊國武, 汪大敏, 媛 鄧 申請人:陜西省微生物研究所