專利名稱：一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方法
技術領域：
本發明涉及一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方法，是 一種利用離子交換樹脂直接提取、作為原料藥或保健食品功效成分的蚯蚓纖溶酶的 工業化生產技術，屬于生物技術領域。
二背景技術：
選用適合的樹脂在適當的條件下進行離子交換或吸附層析，直接從動植物或微 生物粗提液中、直接從發酵液中提取一濃縮目標蛋白或目標多糖或其他生化物質， 是目前最常用的快速簡便、成本低廉的工業化分離純化技術。
蚯頓纖溶酶亦稱蚓激酶，作為口服溶血栓藥的主要原料藥在我國與日本已經應 用多年，同時還有若干種以蚯蟲引纖溶酶為功效成分的保健食品上市，兩大類產品在 我國年銷售額已超過10億元，目前仍呈快速上升趨勢。
蚯頓纖溶酶的實驗室提取、提純，通常采用蚯蚓勻漿一抽提一離心一硫酸銨分 級鹽析或有機溶劑分級沉淀一透析或凝膠過濾、脫鹽一離交層析或親和層析一透析 一冷凍干燥。
藥用蚯KI纖溶酶的工業化提取，在我國和日本目前是將鮮蚯蚓(或蚯蚓粉)加
水(或0.1mol/LNaCl)保溫、攪拌、自溶，或者蚯蚓勻漿加水(或0.1mol/LNaCl)
抽提一離心或過濾取上清一硫酸銨分級鹽析或乙醇、丙酮等有機溶劑分級沉淀一超 過濾、洗滌、濃縮一冷凍干燥或有機溶劑沉淀、真空干燥。有的還插入活性炭等吸 附劑吸附、脫色、脫腥工序。
上述工業化制備蚯頓纖溶酶的生產工藝，缺點是收得率低、產品純度和生物活 性較低、生產成本高、需要耗費大量硫酸銨或乙醇、丙酮等化工原料。因此，尋找 一種簡易、高效的工業化制備蚯蚓纖溶酶生產工藝，取代目前國內外采用的生產工 藝，是一項具實用價值的迫切任務。
三、
發明內容
技術問題
本發明是針對目前蚯蚓纖溶酶工業化生產工藝收得率低、產品純度和生物活性 較低、生產成本高、需要耗費大量硫酸銨或乙醇、丙酮等化工原料等缺點，公開一
種簡易、高效的工業化制備蚯蚓纖溶酶的工藝技術。該提取工藝的核心工序離子交換，即直接從蚯蚓粗提液中提取并濃縮纖溶酶。蚯蚓纖溶酶的收得率、生物活性
得到提高，生產周期縮短、生產成本降低。
技術方案
利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方法，包括
(1) 洗凈的鮮蚯蚓或冷凍的鮮蚯蚓加0. 14mol/L NaCl溶液、勻漿，攪拌提取l-2 小時，離心或過濾取上清液，沉渣加0. 14mol/L NaCl溶液攪拌提取0.5小時、離 心、合并上清；
(2) 上清液用1 mol/L NaOH調節pH7. 5_9. 5，加無離子水調節離子強度(按電 導率計)至1-5 m
(3) 靜態離子交換-階梯洗脫加入活化的大孔陰離子交換樹脂攪拌交換2-4小 時、抽干；常水漂洗、抽干，重復洗滌一次；加入0.8-1.2 mol/L NaCl溶液攪拌 洗滌、抽干，重復洗滌一次；加入2. 5-4. 5 mol/L pH 5-6 NaCl溶液攪拌洗脫2-4 小時、抽干、收集洗脫液，重復洗脫1次、合并洗脫液；
或者采用動態離交層析-梯度洗脫活化的樹脂裝層析柱，第(2)項下的上清液 上柱，無離子水洗滌，0. 5-4. 5 raol/L pH 5-6 NaCl溶液梯度洗脫，收集、合并纖 溶酶洗脫峰；
(5)洗脫液用冷酒精或冷丙酮沉淀，有機溶劑脫水，真空干燥；或者洗脫液通 過超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥。
所用大孔陰離子交換樹脂是指大孔強堿性陰離子交換樹脂或大孔弱堿性陰離 子交換樹脂如D254、 D2卯、ZGA351或ZGA451。 有益效果
目前國內外普遍利用赤子愛勝蚓(Eisenia Foetide)作為提取纖溶酶的原料， 赤子愛勝蚓至少含有6種纖溶酶的同工酶，它們的分子量范圍在2. 5—4. 5萬D.， 等電點范圍3.5—4.5， pH穩定范圍5—12，完全失活溫度70°C、 60分鐘。對于這 種穩定的酸性蛋白，選擇適合的陰離子交換樹脂直接從蚯蚓粗提液中提取，照理并 不十分困難，但實際并非如此。正因為此，至今國內外仍沿用硫酸銨或有機溶劑分 級沉淀從蚯蚓粗提液中提取纖溶酶。即便利用離子交換、疏水層析、親和層析等提 純技術，也只能放在初步分離提純之后才能有效地進行。
我們的試驗證明，是因為生產過程中含量占細胞核98%以上、等電點pll.0左 右的DNA及其降解產物一分子量大小不一的核苷酸，干擾并阻礙了蚯蚓纖溶酶與離 子交換樹脂的結合與洗脫。只有消除了數量與荷電量占絕對優勢的DNA與核苷酸的千擾，才有可能利用適合的離子交換樹脂直接從蚯蚓粗提液中提取、濃縮蚯蚓纖溶酶。
蚯蚓纖溶酶工業化生產過程中，防止DNA溶解與降解，并通過離心或過濾將DNA 沉淀從蚯蚓粗提液中除去乃是技術之關鍵。新鮮或冰凍的蚯蚓，在0. 14mol/L NaCl 中勻漿、提取，占細胞核98。/。以上的DNA易溶于水，但在O. 14mol/LNaCl溶液中幾 乎不溶，較容易除去。在上述操作過程中扣緊生產環節、在夏季O. 14raol/LNaCl溶 液預冷或在較低溫度環境下操作、防止DNA被細胞固有的DNA酶降解，也是一個重 要方面。
采用本技術方案可以有效去除蚯蚓粗提物中數量和荷電量占絕對優勢的DNA并 防止降解，因而有可能直接用大孔陰離子交換樹脂從蚯蚓粗提液中提取、濃縮纖溶 酶。實踐表明，
本發明具有以下優點
1. 提高蚯頓纖溶酶產品的生物活性和純度本發明技術的產品白色、無異
味、易溶于水，生物活性大于40uku/mg (蚓激酶單位40000u/mg)，高于目前工業 化產品的一般生物活性》12uku/mg (蚓激酶單位12000u/mg)。
2. 簡化生產過程、降低生產成本、節省大量化工原料一硫酸銨、乙醇、丙酮 本發明通過核心工序一離交層析， 一次完成目標蛋白的提取一濃縮，大幅度減少后 續工序的設備體積和化工原料用量；樹脂可反復再生使用；而且樹脂再生、洗滌、 洗脫僅僅使用最便宜、最常用的化工原料一NaCl、 Na0H、 HC1，極少量的乙醇僅用 于纖溶酶脫水千燥。據估算，本發明的工業化生產技術使生產成本降低50%左右。
3. 提高產品收得率本發明由于縮短工業化生產工序、提高吸附目標蛋白的 特異性，使得纖溶酶的收得率普遍提高10%以上。
具體實施方式
1.生產工藝
(1) 鮮蚯躬l洗凈、瀝干，或冷凍的鮮蚯頓，加0. 14mol/L NaCl溶液、勻漿、攪 拌提取1-2小時，離心或過濾取上清液，沉渣用0. 14mol/L NaCl溶液攪拌提取0. 5 小時、離心、合并上清；
(2) 上清液用1 mol/L Na0H調節pH7. 5-9. 5，加適量無離子水調節離子強度(按 電導率計)1 - 5 m
(3) 加入活化的大孔陰離子交換樹脂如D254、 D290、 ZGA351、 ZGA451等、攪拌 交換2-4小時、抽干；無離子水漂洗、抽干，重復洗滌一次；(4) 加入0. 8-1. 2 mol/L NaCl溶液攪拌洗滌1-2小時、抽干，重復洗滌一次；
(5) 加入2.5-4.5 mol/L pH 5-6 NaCl溶液攪拌洗脫2-4小時、抽干、收集洗 脫液，重復洗脫1次、合并洗脫液；
(6) 洗脫液抽濾、冷酒精沉淀，收集沉淀物、有機溶劑脫水，真空干燥；或者 洗脫液經超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥。
(7) 上述第(2)項的上清液，也可通過動態離交層析-梯度洗脫、代替(3)-(5)項靜 態離子交換-階梯洗脫。即活化的離子交換樹脂裝層析柱，(2)項上清液在調節pH 和離子強度后上柱，無離子水洗滌，配制pH 5-6的梯度洗脫液0.5mol/L NaCl、 4.5mol/L NaCl溶液，梯度洗脫、收集、合并纖溶酶活性洗脫峰。以下操作同第 (6順.
2. 實施例一
鮮赤子愛勝蚓22Kg、配制0. 14mol/LNaCl溶液，蚯蚓勻漿，共加0. 14mol/L NaCl溶液22 L，攪拌、提取2小時，5000g、 10° C離心45分、取上清。沉淀物加 5 L 0. 14 mol/L NaCl溶液、攪拌提取0. 5小時，離心，合并2次離心上清。用1 mol/L Na.OH調節pH 8. 5,加無離子水調電導率2. 3 m 1/Q，加入活化的D254樹脂(大孔強 堿性陰離子交換樹脂)4.4 Kg攪拌4小時，抽干。常水充分漂洗、抽干，重復漂 洗一次。樹脂加10 L 1 mol/L NaCl溶液，攪拌洗滌2小時、抽干，重復洗滌1小 時。抽干的樹脂加6 L 3.5mol/L NaCl溶液(pH 5.5)、攪拌洗脫4小吋，抽干； 同樣攪拌洗脫2小時、抽干，合并2次洗脫液、抽濾(濾過液澄明微黃)。洗脫液攪 拌加入冷酒精至終末濃度78 %(V/V)，置4"C過夜，收集沉淀，無水酒精脫水，真 空干燥，粉碎，得白色、無異味的蚯蚓纖溶酶粉末101.4g。
以(牛血)纖維蛋白平板法、尿激酶國際標準品為對照，測得蚯頓纖溶酶活性 為48 uku/mg (48000頓激酶單位)。D254樹脂對蚯蟲引粗提液中纖溶酶的交換率為 92.6%、洗脫率為91.5%，總收得率為76. 3%。
3. 實施例二
冰凍的鮮赤子愛勝頓28Kg、勻漿，同上用0. 14mol/LNaCl抽提兩次、共用NaCl 溶液34 L。蚯蟲引粗提液用1 mol/L Na0H溶液調節pH9.0，加無離子水調節電導率 1.8 m 1/￡2。活化的ZGA451sc樹脂(大孔弱堿性陰離子交換樹脂)6 kg、裝離交柱 一蚯蚓粗提液上樣 一 無離子水洗滌一 0.5mol/L、 4.5mol/LNaCl溶液(pH5.3) 各8 L、梯度洗脫。繼一個大而平緩的雜蛋白洗脫峰之后，出現相連的纖溶酶活性 峰，收集、合并纖溶酶洗脫峰，抽濾。濾液經中空纖維超過濾器(截留分子量10000D.)超過濾、無離子水洗滌、濃縮。濃縮液冷凍干燥，得白色、無異味的纖溶酶粉 末104. 4g。
以(牛血)纖維蛋白平板法、尿激酶國際標準品為對照，測得蚯頓纖溶酶活性 為56uku/mg (蚓激酶單位56000u/mg)。 D254樹脂對蚯蚓粗提液中纖溶酶的交換率 為92. 2%、洗脫率為86. 7%，總收得率為72. 0%。
用大孔陰離子交換樹脂D290或ZGA351代替D254和ZGA451可以同樣取得 以上的效果。
權利要求
1. 利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方法，包括(1)鮮蚯蚓或冷凍蚯蚓，在0.14mol/L NaC1溶液中勻漿并隨即攪拌提取，防止數量占絕對優勢、pI1.0左右的DNA溶解或被細胞固有的DNA酶降解，隨即離心或過濾除去DNA沉淀，得蚯蚓粗提液；(2)無離子水調節蚯蚓粗提液的電導率1-5m1/Ω，再用大孔陰離子交換樹脂進行靜態或動態離子交換；(3)用2. 5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液攪拌洗脫纖溶酶，或者0.5-4.5mol/L pH5-6的NaCl溶液梯度洗脫、收集纖溶酶洗脫峰；(4)洗脫液用冷酒精或其它有機溶劑沉淀、有機溶劑脫水、真空干燥，或者洗脫液通過超過濾洗滌、濃縮，冷凍干燥，得蚯蚓纖溶酶；
2. 根據權利要求1所述利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方 法，其特征在于，所用大孔陰離子交換樹脂是指大孔強堿性陰離子交換樹脂 或大孔弱堿性陰離子交換樹脂如D254、 D290、 ZGA351或ZGA451 。
全文摘要
本發明涉及一種利用離子交換樹脂直接提取蚯蚓纖溶酶的工業化生產方法，屬于生物技術領域。鮮蚯蚓或冷凍蚯蚓加0.14mol/L NaCl、勻漿、攪拌提取、離心上清調節pH7.5-9.5、電導率1-5ml/Ω；加活化的大孔陰離子交換樹脂攪拌交換2-4小時，洗滌，3-4mol/L NaCl洗脫；或者樹脂裝離交柱、動態交換、0.5-4.5mol/L NaCl梯度洗脫；洗脫液冷酒精沉淀或超過濾脫鹽、濃縮，低溫干燥得蚯蚓纖溶酶。本發明技術產品白色、無異味、易溶于水，生物活性由≥12uku/mg提高到40uku/mg以上，收得率提高10％以上，節約大量化工原料、生產成本降低50％左右。適用于工業化生產。
文檔編號C12N9/68GK101544968SQ200910026780
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者張治國, 連桂芳 申請人:南京農業大學 被以下專利引用 (1),