可二次驗證堿基信息的dna測序方法

專利名稱：可二次驗證堿基信息的dna測序方法
技術領域：
本發明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標記物，能夠二次驗證同一個堿基位置的信息，同時保護引物延伸末端完整，通過逐步合成鑒定未知堿基DNA測序方法，屬于生物技術領域。

背景技術：
被稱為第三大科學計劃的人類基因組計劃于20世紀80年代啟動，這個由多個國家參加的計劃的完成對人類認識自身，提高健康水平，推動生命科學、醫學、生物技術、制藥業、農業等的發展具有極其重要的意義。2000年6月26日，人類基因組工作草圖由美國、英國、法國、德國、日本和中國科學家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精細圖”。人類基因組計劃的實施期間，科學家還完成了大鼠、小鼠、水稻等物種的測序。眾多物種的基因組序列和大量的基因被識別，后基因組時代便是要對這些基因的結構、功能、表達和分布進行深入的研究，因此，急需高通量、大規模的分析手段和方法來解決這些需求。20世紀90年代建立起來的基因芯片技術和最近發展起來的第二代DNA測序技術是高通量研究基因的結構和功能的兩種比較重要的技術，推動了功能基因組和系統生物學研究的發展。
目前用于最為廣泛應用的測序技術是Sanger等(1977)發明的雙脫氧鏈末端終止法，Sanger法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。最近幾年發展起來的高通量測序技術結合基因芯片技術，可以一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，被科學家稱為下一代測序技術(next generation sequencing)，同時高通量測序技術使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全面的相關性分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。目前，高通量測序平臺的代表是羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch GS FLX sequencer)，Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiD sequencer)。Sanger測序法，454焦磷酸測序法和Solexa測序法其技術本質都是合成測序，合成測序方法通過把大量被測的模板DNA片段進行固定，并在固定化的DNA測序模板上雜交結合通用的DNA引物，分別控制4種堿基在DNA引物上的延伸。通過檢測延伸反應過程或所延伸的堿基，實現高通量并行的DNA序列信息的檢測。在合成測序策略中，測序引物首先和待測序的DNA模板結合，然后依次加入4種脫氧核苷酸，引物以被測DNA片段為模板，在DNA聚合酶的催化下逐步延伸。此過程中，有多種方法可以用來確定引物是否發生延伸反應，并根據所加入的相應的脫氧核苷酸種類，確定DNA模板上的堿基信息。通過4種脫氧核苷酸循環加入，或者按照指定的順序加入，最終獲取所需要的核酸閱讀長度。Solid測序技術較為特別，它使用的連接測序法，用已知的寡聚核苷酸片段代替核苷酸，用DNA連接酶代替DNA聚合酶。Sanger法的優勢在于可以分析未知的DNA序列，而且單向反應的讀序能力較長，目前的技術可以達到1000bp以上，然后，在實際工作中，很多情況需要對已知序列的DNA片段進行序列驗證或是對為數不多的位點進行分析驗證，在這種情況下，較短序列的高通量測序方法更為適用。測序技術可以在多個領域進行應用，在分子診斷學方面，可以用于病原微生物的快速鑒定，遺傳病分子診斷(如SNPs，SNP等位頻率)，在法醫鑒定方面，如對線粒體D-Loop區的HVI和HVII高可變區進行分析，在藥物基因組學方面，如瑞典Eurona Medical AB與Pyrosequencing公司合作對血管緊張轉換酶(ACE)的SNP進行分析以及在農業生物方面都有諸多應用。可見測序技術已經越來越受到關注，無不預示著測序技術在不久的將來，不僅僅是只作為一種科學研究的工具，而且將向一個產業發展，將更好的為人類健康服務，更貼近人類的生活。


發明內容
本發明的目的是針對上述不足之處提供一種可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，該方法不僅實現了原位清除延伸標記物的目的，而且還能夠二次驗證同一堿基位置的信息，降低測序中可能出現的錯誤率，并在硫代修飾保護堿基的基礎上測定下一個堿基信息，錯誤延伸的累積效應不嚴重，序列的測定準確，所進行的步驟按照傳統的分子生物學方法進行，能夠維持DNA模板和測序引物的量以保證足夠的延伸信號，沒有標記物量的累積效應，保證結果的易讀性和可靠性，不存在測序長度的限制。
可二次驗證堿基信息的DNA測序方法是采取以下技術方案實現 可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于DNA序列上一個堿基的信息的確定是通過兩次延伸測序步驟來實現的，該DNA測序過程如下 步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進行雜交； 步驟2)加入第一次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息； 步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標記核苷酸單體通過生物酶切割方法進行清除； 步驟4)加入第二次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體和同種類未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息； 步驟5)用化學試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上的可脫保護基團，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團； 循環上述步驟2)、3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
在執行上述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)被同時執行1到10次。
所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進一步驗證該堿基信息。
所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
所述的步驟(2)中用熒光標記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
所述的步驟(4)中所用的熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665； 所述的硫代核苷酸單體特征在于結構為

其中，Y為嘌呤堿基基團或者嘧啶堿基基團，核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，在一定條件下，R1或R2基團可以被分解，形成羥基，R1基團選自但不限于下列化學基團之一



R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環烴基、鏈烯基、環烯基或芐基。
所述的用熒光標記核苷酸單體或用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標記不相同或者不完全相同的熒光基團。
所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標記和熒光標記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復堿基的確定通過信號的線性遞增關系進行確定。
所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
所述步驟5)中的化學試劑至少選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種。
有益效果本發明與現有技術相比，具有如下優點 1、本發明的最大優點是能夠極大程度地降低測序過程中的錯誤率。在DNA擴增中通常所用的Taq DNA聚合酶擴增堿基出錯率為10-5左右，Pfu DNA聚合酶的堿基出錯率為10-6，在合成測序中，假如所使用的DNA聚合酶的堿基出錯率為10-6，那么在測序過程中，某一個堿基的出錯率為1/106，再次測定這個堿基時，其出錯率為1/1012，結果的準確率提高了6個數量級。
2、本發明可以降低DNA模板的需要量。目前的高通量測序方法通常在乳液單克隆擴增之前都需要進行DNA模板的PCR擴增，以保證相同序列區域能夠有多個相同的克隆，隨著堿基識別準確率的提高，我們可以減少克隆的需要量，甚至于不需要進行乳液擴增之前的PCR擴增過程。
3、本發明與其他測序技術的一個明顯區別在于，本發明對同一個位置的堿基驗證不止可以進行一次，圖1所示為本測序方法的示意圖，在未加入硫代修飾的核苷酸之前(步驟.4)，步驟.2和步驟.3可以進行多次，正如有益效果第1條所述的那樣，這兩個步驟進行次數越多，這個位置堿基出錯的可能性就越小，堿基出錯的可能性越小，意味著序列出錯的可能性越小，也就越有利于后續的生物學分析。如此方便的能對堿基進行重復驗證的測序方法是當前測序技術不曾擁有的。



以下將結合附圖對本發明作進一步的說明。
圖1是本發明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法的示意圖。圖中有不同未知序列的DNA模板①，通用測序引物②，未經修飾的核苷鍵③，硫代修飾的核苷鍵④，標記基團⑤，可切除的化學鍵⑥，可脫保護的基團⑦和羥基⑧。
步驟.1將DNA測序模板固定在固相載體上，相同的序列形成一個簇，不同簇之間的DNA序列完全不同或不完全相同；雜交上3′端硫代修飾(④)的測序引物(②)； 步驟.2加入四種不同熒光標記的雙脫氧核糖核苷酸(⑤)和DNA聚合酶，此時延伸步驟形成的是正常的核苷鍵(③)，由于雙脫氧核糖核苷酸沒有游離的羥基，因此，不能繼續延伸下一個堿基，經過熒光掃描和數據分析，第一次得到這個位置的堿基信息，由圖中示意，從左到右，分別是T、G、C、A，由堿基互補配對原則，可知DNA模板上的堿基分別為A、C、G、T； 步驟.3加入外切酶，由于步驟.2中形成的正常核苷鍵可以被外切酶切割，因此，我們可以去除步驟.2中延伸上的熒光標記的雙脫氧核糖核苷酸； 步驟.4加入四種熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸，這種硫代核苷酸上修飾有兩種基團，一種是活化的保護基團(⑦)，另一種是帶有可切割價鍵(⑥)的熒光基團，熒光所對應的核苷酸種類與步驟.2中的保持一致，當這四種熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸被延伸上之后，通過熒光掃描數據分析，我們再次得到了這個堿基位置的信息，起到驗證和糾錯作用； 步驟.5加入化學剪切和活化試劑，將熒光基團切割去除，并活化保護基團(⑦)形成羥基(⑧)，使之能夠進行再一次的延伸反應； 步驟.6重復步驟.2的操作，但是會得到下一個堿基的信息，如圖中所示，由左到右，熒光信息依次代表為G、C、A、T，對應的DNA模板堿基為C、G、T、A；
具體實施例方式 實施例1.可二次驗證堿基信息的DNA測序方法 可二次驗證堿基信息的DNA測序方法是通過兩次延伸測序步驟來實現的對DNA序列上一個堿基信息的確定，該DNA測序過程如下 步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進行雜交； 步驟2)加入第一次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息； 步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標記核苷酸單體通過生物酶切割方法進行清除； 步驟4)加入第二次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體和同種類未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息； 步驟5)用化學試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上的可脫保護基團，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團； 步驟6)循環上述步驟2)、3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
在執行上述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)可以被同時執行1到10次。
所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進一步驗證該堿基信息。
所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
所述的步驟(2)中用熒光標記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
所述的步驟(4)中所用的熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的硫代核苷酸單體特征在于結構為

其中，Y為嘌呤堿基基團或者嘧啶堿基基團，核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，在一定條件下，R1或R2基團可以被分解，形成羥基，R1基團選自但不限于下列化學基團之一



R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環烴基、鏈烯基、環烯基或芐基。
所述的用熒光標記核苷酸單體或用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標記不相同或者不完全相同的熒光基團。
所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標記和熒光標記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復堿基的確定通過信號的線性遞增關系進行確定。
所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
所述步驟5)中的化學試劑選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種或幾種。
實施例2具體的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法實施方案 第一步將2μg人類基因組DNA用超聲波打斷，通過割膠純化的方法割取25bp～50bp的基因組片段范圍。取100ng已純化的DNA片段與100nM的公共連接引物，在T4連接酶的作用下進行連接。連接好后的基因片段用公共引物進行10個循環的PCR預擴增，用純化試劑盒純化PCR產物，并進行濃度測定。
第二步將預擴增后基因組DNA片段稀釋到1fM，與事先固定在醛基片上的配對引物雜交，然后在片進行PCR擴增，形成用于測序的微陣列芯片。
第三步將擴增好后的基片用0.3M的氫氧化鈉溶液洗滌，使得基片上的PCR產物變性為單鏈，然后與2μM 3′端用硫代修飾的測序引物在42℃雜交30分鐘，洗滌后待用。
第四步基片上加上第一次延伸反應溶液，其中包括1～10U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的ddNTP、20nM Cy3-ddCTP、20nM Cy5-ddGTP、20nM FITC-ddATP、20nM JOE-ddTTP，52℃反應30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進行拍照，獲得該位置的堿基信息。
第五步加入3U/μL的核酸外切酶III，37℃反應30秒鐘，去除延伸上的堿基，并用去離子水進行洗滌。
第六步基片上加上第二次延伸反應溶液，其中包括2U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的2′位修飾

的硫代脫氧核糖核苷酸(即dNTP)、1nM用不同熒光修飾的、2′位同樣修飾著

的硫代脫氧核糖核苷酸，分別是Cy3-dCTP、Cy5-dGTP、FITC-dATP、JOE-dTTP，52℃反應30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進行拍照，再次獲得該位置的堿基信息。
第七步用0.1M的氫氧化鈉溶液與基片作用1分鐘，去除

基團，活化出羥基，并使四種熒光發生淬滅。
第八步反復進行第四、五、六、七步，直到全部獲得待測DNA模板的堿基信息。
第九步利用圖像分析軟件，由熒光與堿基類型已知的對應關系，得到待測DNA模板的具體序列信息，由于同一個位置的堿基，測定了兩次，兩次堿基信息完全相同的位置，判定為準確。兩次堿基信息不一致的位置，標識為可疑。由于，待測DNA模板進行了預擴增，那么存在著相同序列的其他克隆，可疑位置的堿基信息與其他克隆相同位置的信息進行比較，占90％以上的堿基信息被判定為準確。
實施例3可二次驗證堿基信息的DNA測序方法測定人基因組p16外顯子1序列 設計一對針對人基因組p16外顯子1的PCR引物，其中一條引物5′端修飾著氨基。用PCR引物擴增人樣本(血液、組織等)中的p16外顯子1序列片段，PCR產物純化后，通過點樣的辦法在醛基修飾的基片上形成陣列，洗去未結合的PCR產物，加入0.3M的氫氧化鈉溶液，用變性的辦法去除未固定的DNA鏈，得到單一的模板鏈，然后與2μM 3′端用硫代修飾的測序引物在42℃雜交30分鐘，洗滌后待用。進行以下步驟 第一步基片上加上第一次延伸反應溶液，其中包括2U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的ddNTP、20nM Cy3-ddCTP、20nM Cy5-ddGTP、20nM FITC-ddATP、20nM JOE-ddTTP，52℃反應30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進行拍照，獲得該位置的堿基信息。
第二步加入3U/μL的核酸外切酶III，37℃反應30秒鐘，去除延伸上的堿基，并用去離子水進行洗滌。
第三步基片上加上第二次延伸反應溶液，其中包括5U/μL的Taq DNA聚合酶、2μM的2′位修飾

的硫代脫氧核糖核苷酸(即dNTP)、20nM用不同熒光修飾的、2′位同樣修飾著

的硫代脫氧核糖核苷酸，分別是Cy3-dCTP、Cy5-dGTP、FITC-dATP、JOE-dTTP，52℃反應30秒鐘，用去離子水洗滌后，用CCD進行拍照，再次獲得該位置的堿基信息。
第四步用0.01M的高碘酸鈉溶液與基片作用1分鐘，去除

基團，活化出羥基，洗滌后，再加上0.01M的硫酸銅溶液使四種熒光發生淬滅。
第五步反復進行第一步到第四步，直到全部獲得待測DNA模板的堿基信息。
第六步利用圖像分析軟件，由熒光與堿基類型已知的對應關系，得到待測DNA模板的具體序列信息，由于同一個位置的堿基，測定了兩次，兩次堿基信息完全相同的位置，判定為準確。兩次堿基信息不一致的位置，標識為可疑。由于，待測DNA模板進行了預擴增，那么存在著相同序列的其他克隆，可疑位置的堿基信息與其他克隆相同位置的信息進行比較，占90％以上的堿基信息被判定為準確。
權利要求
1、一種可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于DNA序列上一個堿基的信息的確定是通過兩次延伸測序步驟來實現的，該DNA測序過程如下
步驟1)3′端堿基硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進行雜交；
步驟2)加入第一次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的核苷酸單體A、T、C、G和四種正常的核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的核苷酸單體和同種類正常核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在上述測序引物上延伸四種核苷酸單體A、T、C、G中的一種、并通過熒光檢測到第一次延伸的堿基信息；
步驟3)將步驟2)中延伸上的用熒光標記核苷酸單體通過生物酶切割方法進行清除；
步驟4)加入第二次延伸反應溶液，溶液成份包括1～10U/μL DNA聚合酶、四種用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G和四種未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G，用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體和同種類未標記熒光的可脫保護的硫代核苷酸單體之間的分子數比例為1∶50～100，通過在測序引物上延伸可脫保護的硫代核苷酸單體A、T、C、G中的一種，并通過熒光檢測到第二次延伸的同一位置的堿基信息；
步驟5)用化學試劑去除上述步驟4)中延伸上的用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上的可脫保護基團，同時去除該硫代核苷酸單體上的熒光基團；
循環上述步驟2)、3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
2、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的可二次驗證堿基信息是指待測DNA模板上某一個具體位置的堿基信息采用兩次檢測的方式獲得，第一次檢測得到該位置的堿基信息，第二次檢測則是進一步驗證該堿基信息。
3、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的固定的待測DNA模板是指待測定序列的DNA片段。
4、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟(2)中用熒光標記的核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665；所述的核苷酸單體是脫氧核糖核苷酸、雙脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
5、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的步驟(4)中所用的熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體上修飾有以下熒光化學基團中的一種DAPI、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、FITC、Alexa 488、Alexa 568、JOE、ROX、Rhodamine 6G、Tetramethylrhodamine、Lissamine、Texas Red、BODIPY 630/650、BODIPY650/665；所述的硫代核苷酸單體特征在于結構為
其中，Y為嘌呤堿基基團或者嘧啶堿基基團，核糖或脫氧核糖基團2′和3′位置上連接著R1和R2基團，在一定條件下，R1或R2基團可以被分解，形成羥基，R1基團選自但不限于下列化學基團之一
R2選自但不限于H、OH、羰基，以及與R1相同的基團；R4，R5和R6分別是R4選用氫原子或烴基；R5選用氫原子或烴基；R6選用烴基、環烴基、鏈烯基、環烯基或芐基。
6、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的用熒光標記核苷酸單體或用熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體是單色的，即四種核苷酸單體均修飾著同一種類的熒光基團；或者是不同種類的熒光，即四種核苷酸單體標記不相同或者不完全相同的熒光基團。
7、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于在執行權利要求1所述的步驟4)之前，步驟2)和步驟3)被同時執行1到10次。
8、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述的待測DNA序列中的堿基信息是通過檢測是否有熒光標記和熒光標記的強度以及堿基互補原理來確定模板的序列信息，相同重復堿基的確定通過信號的線性遞增關系進行確定。
9、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述步驟3)中的生物酶選用Lamda核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T中的一種。
10、根據權利要求1所述的可二次驗證堿基信息的DNA測序方法，其特征在于所述步驟5)中的化學試劑至少選用高碘酸鹽溶液、氨水、氫氧化鈉溶液、雙氧水、碘化鉀溶液、硫酸銅溶液、DABCYL溶液中的一種。
全文摘要
本發明可二次驗證堿基信息的DNA測序方法涉及的是一種能夠原位清除延伸標記物，能夠二次驗證同一個堿基位置的信息，逐個堿基鑒定未知DNA序列。該技術過程如下1)3′端硫代修飾的測序引物與被固定的待測DNA序列進行雜交；2)加入第一次延伸反應溶液，延伸四種熒光標記的核苷酸單體，通過檢測得到堿基信息；3)將2)中延伸上的核苷酸單體用酶進行切割清除；4)加入第二次延伸反應溶液，延伸熒光標記的可脫保護的硫代核苷酸單體，通過檢測再次得到堿基信息；5)用化學試劑去除4)中延伸上的硫代核苷酸單體上的可脫保護基團和熒光基團；循環上述2)、3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的堿基序列信息。
文檔編號C12Q1/68GK101575639SQ200910033400
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月19日 優先權日2009年6月19日
發明者陸祖宏, 羅俊峰, 白云飛, 肖鵬峰, 華 呂 申請人:無錫艾吉因生物信息技術有限公司