專利名稱：整合態人乳頭瘤病毒的散在重復序列檢測法的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，涉及一種檢測整合至人基因組中的人乳頭瘤病毒脫氧 核糖核酸成分的實驗方法。
背景技術：
人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，縮寫HPV)是一種閉合環狀雙股脫氧核糖 核苷酸(DNA)病毒，按其Ll基因的特征可分為100多種亞型。其中，與人類惡性腫瘤有關 的病毒亞型包括5、6、8、11、16、18、31、33型等，它們攜帶的病毒癌基因，比如E6、E7等，在 長期共存基礎上，可隨同病毒基因組本身一起整合到受感染人體細胞的基因組中，與染色 體共同復制、轉錄，最終導致細胞癌變。因此掌握HPV病毒基因組所處的狀態，即是處于細 胞內的游離態，還是處于與人類基因組聯結的整合態，可以幫助臨床醫生判斷受感染細胞 病理演變的轉歸趨勢，預測它們是將進入一般性的病毒損害和凋亡過程；還是將進入與病 毒長期共存，逐步癌變的過程。據此，醫生能夠制定合理的治療方案，在早期階段及時阻斷 病程發展，達到防止癌癥發生的目標。散在重復序列(Interspaced repeat sequence，縮寫IRS)是基因組上一段短脫氧 核糖核苷酸序列，可用于協助識別染色體上與IRS相鄰的某些未知基因的位置。人類很多 IRS已經明確，并得到廣泛應用，其中，以Alu、MIR和Kpn序列為最常見。在人類單倍體基 因組中，Alu序列有約100萬個拷貝，估計平均每隔3000個堿基，就會出現一段Alu序列。 MIR序列的拷貝數略少于Alu，約為30萬個。Kpn序列數量更少些，約3萬拷貝。當HPV整 合至染色體后，由于其癌基因E6、E7所在的基因組序列必然位于某個IRS附近，因此可以利 用鄰近的IRS，通過聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chainreaction，縮寫PCR)檢測出整 合態HPV。這種PCR方法只要在某種恰當的針對IRS和HPV基因組的特異性引物存在的情 況下，就可以實施。所得擴增產物可以在瓊脂糖電泳或脫氧核糖核苷酸測序中加以鑒定，并 根據電泳條帶大小、強弱或脫氧核糖核苷酸測序結果，判斷待測樣本中，是否存在HPV整合 情況。PCR技術由Muller在1983 1985年間發明，其原理是利用引物、脫氧核糖核酸聚 合酶和四種三磷酸脫氧核糖核苷酸單體在以目標基因為擴增模板的脫氧核糖核酸雙鏈上， 通過變性、退火和延伸的反復循環，將微量原始模板以幾何級數方式擴增至IO6 IO9倍以 上，從而能被電泳等方法檢測出來。這種檢測方法的技術關鍵在于引物設計。理想的引物 具有專一性識別能力，它們能夠從人類數萬種基因的復雜背景中，挑選出自己的目標序列， 即脫氧核糖核酸模板，進行特異擴增。通常，在PCR中，所采用的引物為一對含有15 25 個堿基對的寡聚核苷酸單鏈，它們可分別與目標基因兩端分屬于正義鏈和反義鏈的5’端脫 氧核糖核酸序列互補結合，起到引導脫氧核糖核酸聚合酶進行延伸的作用。理論上，PCR擴 增產物將按2n的指數曲線增長。于是當進行30 40輪反應循環后，原來一條模板就會倍 增至23° 4°條脫氧核糖核酸雙鏈，后者與原始模板序列完全一致，相當于忠實擴增了 IO9 IO12倍左右。但受脫氧核糖核酸聚合酶延伸能力和擴增效率的限制，擴增產物長度一般在
31000 2000堿基對之間，增加倍數一般在IO6 IO9倍之間<
發明內容
本發明目的是提供一種檢測整合至人基因組中的人乳頭瘤病毒脫氧核糖核酸成 分的實驗方法，即將通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引物(即第一組引物)、用于 擴增散在重復序列AhuMIR和Kpn家族成員的引物(即第二組引物)以及一條被命名為 “PS”的引物(即第三組引物)以不同方式混合在一起，進行聚合酶鏈反應，從而使DNA樣 品中與IRS相鄰的整合態HPV基因組成分得到高效、準確的擴增和檢測。下面三組引物中，用于指代簡并引物的符號意義為R = A、G ;Y = C、T ;Κ = G、T ； S = G、C ;M = A、C = A、T ;B = G、C、T ;V = A、G、C ;D = A、G、T ;H = A、C、T ;N = A、G、
C、T。
編號020201 (SEQ ID NO 13) 5‘-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTCCTCAGTTTCCTCANY-3’編號020202 (SEQ ID NO 14) 5‘ -GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGATGAGGAAACTGARK-3’第三對編號020301 (SEQ ID NO 15) 5‘-GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGTGCACATGTACCCTAVR-3’編號020302 (SEQ ID NO 16) 5‘ -GGGTAGAGTAGTTGGGTAGTTGGGTTGATCGTGAGAGTCTA GGTGTAGTTGTGCAGGTTTGTTACATA-3’該組第一對引物對針對Alu序列的各家族成員，其識別和結合的目標序列在基因 保守區內，可保證它與多數Alu同源序列有相似的結合能力；第二對引物對是針對MIR各家 族成員的，也是根據基因保守區設計得到；第三對引物對針對的是Kpn序列各家族成員，設 計原理一樣。這三對引物均用于半定向擴增IRS與整合態HPV所在部位之間的脫氧核糖核 酸序列。之所以要把這些建立在第二組引物基礎上的PCR擴增稱為半定向擴增，原因是該 組引物不僅可以擴增含HPV基因的IRS鄰近序列，并且對于相鄰IRS之間的無關序列，即使 在其不含HPV基因成分的情況下，也有將它們擴增出來的可能性。另外，要注意，該組每個 引物對所包含的兩個成員，都是反向互補的，因此在PCR過程中必須將兩者分開，絕不可在 同一反應體系中使用同一引物對。第三組PS引物編號030001 (SEQ ID NO 17) :5，-GGTTGATCGTGAGAGT-3，該組引物用于擴增第一、二組引物為基礎進行PCR得到的脫氧核糖核酸擴增產 物，引物結合處位于第二組引物內部。這組引物與人或HPV基因組同源性極低，因此得到非 特異性擴增產物的概率也非常低。又因該組引物只擴增前階段PCR的既得產物，而不擴增 未經過前階段PCR擴增的人或HPV基因序列，故稱其為定向擴增。該組弓I物對整合態HPV的 選擇性是通過其在第二組引物內的結合區獲得的。如果前次擴增產物不具HPV基因成分， 則其兩端將都由第二組引物構成。相同的序列間會反向互補，并以較高退火溫度自我結合， 于是阻礙了 PS引物與之的結合。如前次擴增產物含HPV基因成分，則其兩端將分屬于第一、 二組引物，這兩種序列之間并不互補，因此不會自我結合。于是，PS引物便可順利與目標序 列結合，而不受干擾。然后，它們可與第一組引物一起，對前次含整合態HPV基因的擴增產 物進行第二階段的擴增，這樣便形成了選擇性。用于檢測整合態HPV的PCR可分為兩個階段1、半定向擴增階段，和2、全定向擴 增階段。這兩個階段既可以在同一反應容器中進行，也可以在兩個或更多不同的反應容器 中進行。每個階段都由若干個溫度循環構成，每個溫度循環包括變性、退火和延伸三個步 驟，變性溫度為93攝氏度 95攝氏度，退火溫度為45攝氏度 72攝氏度，延伸溫度為50 攝氏度 72攝氏度。變性、退火和延伸的保溫時間為5秒 3分鐘。每階段所設定擴增循 環數在10 50次之間。第一階段的脫氧核糖核酸擴增模板是待測樣品基因組抽提物，第 二階段擴增模板所用的是第一階段PCR擴增產物。第一階段PCR過程中，用于擴增反應的引物組成為(1)1 5條編號為010x01的 引物，其中χ表示1 5號數字；(2) 1 3條編號為020y0z的引物，其中y表示1 3號數字，χ表示1 2號數字。上述引物既可以加入同一個反應容器中，以相同成分的緩沖溶 液、脫氧核糖核苷酸單體、脫氧核糖核酸聚合酶的反應體系，于同樣溫度條件下擴增；也可 以將010x01引物與020y0z引物，按照一條第一組引物對一條第二組引物，或一條第一組引 物對多條第二組引物等不同方式的進行組合，然后置于不同的反應容器中，于相同反應體 系和溫度條件下擴增。此處設定對于第一階段PCR過程中使用的引物，其第一組引物總量和第二組引 物總量的比值，按摩爾數計為η 1，要確保η必須大于10，且一個反應體系中，所用第二組 引物的總量必須小于lpmol，這種措施可稱為“IRS-PCR擴增的引物極限法”。采取這一措施 的主要目的在于通過對引物絕對數量的限制，來減少因單引物隨機結合而致相鄰IRS之間 無關序列擴增所得產物的數量，從而降低進入第二階段PCR擴增時，在有待擴增的脫氧核 糖核酸模板混合物中，作為初次產物的IRS無關序列和目標序列的濃度比值。第二階段PCR過程中，用于擴增反應的引物組成為(1) 1 5條編號為010x02的 引物，其中χ表示1 5號數字；或者仍然使用與第一階段反應相同的編號為010x01的引 物，其中χ表示1 5號數字。(2)編號為030001的PS引物。如果第一階段使用的是多管 擴增，第二階段使用的是單管擴增，那么在第二階段中要將前階段PCR擴增產物取出相同 數量的一部分，即相同微升數，并加以混合，然后添加到第二階段所用的單一反應容器中。 如果第一階段PCR使用的是多管擴增，第二階段使用的也是多管擴增，那么在第二階段中 要將前階段PCR擴增產物取出相同數量的一部分，即相同微升數，然后一一對應地添加到 對應的反應容器中，使得前后兩管所用010x01引物和010x02引物能夠一致起來，以確保它 們所針對的是同一 HPV基因區。第一階段和第二階段也可以合并起來，置于同一反應容器中，進行PCR擴增。這種 擴增使用的引物共有三種。(1) 1 10條編號為OlOaOb的引物，其中a表示1 5號數字， b表示1 5號數字；(2)1 3條編號為020c0d的引物，其中c表示1 3號數字，d表示 1 2號數字；(3)編號為030001的PS引物。這種情況下，使用的循環次數和溫度為第一 階段10 20次循環，變性溫度為93攝氏度 95攝氏度，退火溫度為50攝氏度 72攝氏 度，延伸溫度為50攝氏度 72攝氏度；第二階段30 50次循環，變性溫度為93攝氏度 95攝氏度，退火溫度為40攝氏度 55攝氏度，延伸溫度為50攝氏度 72攝氏度。變性、 退火和延伸的保溫時間為5秒 3分鐘。要注意的是，納入的第一、二組引物數量越多，則 得到的PCR檢測靈敏度就越高，但因此形成非特異性產物的機會也越多，這會使檢測的特 異性降低。
具體實施方案實施例1在同一反應容器中，以相同反應體系和溫度條件完成第一階段和第二階段PCR。所用實驗材料為從臨床獲得的婦女宮頸脫落細胞樣品一份，并取其基因組抽提 物用于本次實驗；10倍PCR緩沖液，25mmol/L MgCl2,4種脫氧核糖核苷酸單體即濃度為 5mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 溶液，5U/μ LTaq 酶(市售)和無菌水；編號為 010101、 010201、010301、010401、010501 的第一組引物，編號為 020101,020201,020301 的第二組引 物和編號為030001的第三組引物。
6
配制如下的50 μ L反應體系(1)樣品基因組抽提物溶液10 μ L(2)第一組引物溶液1 μ L，其中含 010101、010201、010301、010401、010501 號引 物各20pmol(3)第二組引物溶液lyL，其中含 020101、020201、020301 號引物各 20fmol(4)第三組引物溶液1 μ L，其中含030001號引物20pmol(5) dNTP 1 μ L，其中含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 5nmol(6) 10 倍 PCR 緩沖液:5 μ L(7) 25mmol/L MgCl2 :5 μ L(8) 5U/ μ L Taq 酶1 μ L(9)無菌水25 μ L在熱循環儀上，設置PCR程序如下(1)50攝氏度，2分鐘(2) 94攝氏度，5分鐘(3)93 攝氏度，15 秒(4) 6O 攝氏度，9O 秒(5)循環步驟(3) (4)，共10次⑶93攝氏度，I5秒(7) 5O 攝氏度，9O 秒(8)循環步驟(6) (7)，共40次(9) 72攝氏度，10分鐘反應完成后，取出擴增產物10μ L，在含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠中，以120伏電 壓電泳20分鐘。紫外燈下，可見凝膠中，相對于分子量標準的200 2000堿基對區間內， PCR產物中分布有十余條脫氧核糖核酸片段條帶，割膠取出最亮者，抽提其中含有的脫氧核 糖核酸擴增產物，并加以測序鑒定，證實此條帶為一條同時含有部分人和HPV Ε6基因的嵌 合型脫氧核糖核酸雙鏈擴增產物。實施例2第一階段PCR在5個反應容器中進行，第二階段PCR在1個反應容器中進行。所用實驗材料為從臨床獲得的婦女宮頸脫落細胞樣品一份，并取其基因組抽提 物用于本次實驗；10倍PCR緩沖液，25mmol/L MgCl2,4種脫氧核糖核苷酸單體即濃度為 5mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 溶液，5U/μ LTaq 酶和無菌水；編號為 010101、010201、 010301、010401、010501、010102、010202、010302、010402、010502 的第一組引物，編號為 020101、020102、020201、020202、020301、020302 的第二組引物和編號為 030001 的第三組 引物。為第一階段PCR配制5管如下的25 μ L反應體系(1)樣品基因組抽提物溶液10 μ L(2)第一組引物溶液lyL，對單個反應容器而言，體系中只含010101、010201、 010301、010401或010501號引物當中的一條，其含量為20pmol(3)第二組引物溶液lyL，其中所含為020101、020201、020301號引物組合，或是020102,020202,020302號引物組合中的一個，組合中每種引物含量為20fmol(4) dNTP 1 μ L，其中含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 5nmo 1(5) 10 倍 PCR 緩沖液5 μ L(6) 25mmol/L MgCl2 :5 μ L(7) 5U/μ L Taq 酶IyL(8)無菌水1 μ L為第一階段PCR，設置PCR程序如下(I)5O攝氏度，2分鐘(2) 94攝氏度，5分鐘(3) 93 攝氏度，I5 秒(4) 6O 攝氏度，9O 秒(5)循環步驟(3) (4)，共15次(6) 72攝氏度，5分鐘待第一階段PCR完成后，從5個反應容器擴增產物中各取出lyL，混合后待用。然 后，為第二階段PCR配制1管50 μ L反應體系如下(1)第一階段PCR擴增產物的混合物10yL(2)第一組引物溶液1 μ L，其中含 010102、010202、010302、010402、010502 號引 物各20pmol(3)第三組引物溶液:1 μ L，其中含030001號引物20pmol(4) dNTP 1 μ L，其中含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 5nmo 1(5) 10 倍 PCR 緩沖液5 μ L(6) 25mmol/L MgCl2 :5 μ L(7) 5U/ μ L Taq 酶1 μ L(8)無菌水26 μ L為第二階段PCR，設置PCR程序如下(I)5O攝氏度，2分鐘(2) 94攝氏度，5分鐘(3) 93 攝氏度，I5 秒(4) 5O 攝氏度，9O 秒(5)循環步驟⑶ (4)，共35次(6) 72攝氏度，10分鐘待第二階段PCR完成后，取出10μ L擴增產物，以120伏電壓，于含溴化乙啶的
瓊脂糖凝膠中，電泳20分鐘。紫外燈下，見凝膠中，對應于分子量標準200 2000堿基對 片段的區間內，在PCR產物中分布有幾條脫氧核糖核酸片段條帶，割膠取出其最亮者，抽提 其中所含的脫氧核糖核酸，并加以測序鑒定，證實此條帶為一條含有人基因組和HPV Ε6基 因接頭序列的脫氧核糖核酸雙鏈擴增產物。序列表<110>復旦大學附屬婦產科醫院<120>整合態人乳頭瘤病毒的散在重復序列檢測法
<160>17<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>1mavtrcwkkcttgcrwaayacrca24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>2kmarykyyktgcakarmtsdksta24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>3sykyhcctgttktktkbtsyacwa24<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t
9
<400>4oiiwwaaaccakccdktacah20<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>5rybtakrtcwktactrtywyttc23<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>6aytkgtcctgvmnsvmayyt20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g，y = c 或 t，k = g 或 t，s = g 或 c，m = a 或 c，w = a 或 t，b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>7waywayrtcwggkggrcatgtwcc24<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b =g或c或t，v = a或g或c，d = a或g或t，h = a或c或t<400>8arbtsdgtwrccgahgancg20<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>9gsgwkpiacatahkcatcsgtrby24<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>10mavrtakacdgtrbystcrcta22<210>11<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = g或c或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t<400>11gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttacagaghgag 60actch 65<210>12<211>65<212>DNA<213>人工序列<220>
11<221>misc_feature
<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = 或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t <400>12
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttdgagtctcdc 60 tctgt 65 <210>13 <211>66 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<221>misc_feature <222>(65)
<223>n = a 或 g 或 c 或 t,r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t, s = g 或 c,m = a w = a或 t,b = g或c或 t,v = a或g或c,d = a或g或 t,h = a或c或 t <400>13
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttcctcagtttc 60
ctcany 66
<210>14
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>r = a 或 g, y = c 或 t,k = g 或 t,s = g 或 c,m = a 或 c,w = a 或 t,b = 或t,v = a或g或c,d = a或g或t,h = a或c或t <400>14
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgatgaggaaa 60
ctgark 66
<210>15
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature <400>15
gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgtgcacatgt 60 accctavr 68 <210>16
10
CN
2 3<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<400>16gggtagagta gttgggtagt tgggttgatc gtgagagtct aggtgtagttgtgcaggttt 60gttacata 68<210>17<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<400>17Ggttgatcgtgagagt1權利要求
一種檢測整合態人乳頭瘤病毒的散在重復序列的方法，其特征在于，將通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引物、用于擴增散在重復序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物和PS引物以不同方式加以混合，進行多重和多階段聚合酶鏈式反應，使DNA樣品中整合態HPV基因組成分得到擴增和檢測。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其操作流程分為兩個階段，置于分屬于兩個 批次的兩個或兩個以上不同反應容器中進行擴增階段(1)將通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引物以及用于擴增散在重復序列 AhuMIR和/或Kpn各家族的引物混合在一起，置于屬第一批次的一個或多個反應容器中， 進行聚合酶鏈式反應，擴增DNA樣品；階段(1)取由(1)所得的一種或多種擴增產物為模板，將通用于人乳頭瘤病毒各亞型 基因的擴增引物和PS引物混合，置于屬第二批次的一個或多個反應容器中，進行聚合酶鏈 式反應。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，階段(1)或(2)中的聚合酶鏈反應的反應條 件是變性溫度為93攝氏度 95攝氏度，退火溫度為45攝氏度 72攝氏度，延伸溫度為 50攝氏度 72攝氏度。變性、退火和延伸的保溫時間為5秒 3分鐘；每階段所設定的擴 增循環數在10 50次之間。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其操作流程分為兩個階段，并在同一個反應 容器中完成擴增反應；兩個擴增反應階段中，所用的引物混合物由通用于人乳頭瘤病毒各 亞型基因的擴增引物、用于擴增散在重復序列AhuMIR和/或Kpn各家族的引物和PS引物 組成。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于第一階段10 20次循環，變性溫度為93攝 氏度 95攝氏度，退火溫度為50攝氏度 72攝氏度，延伸溫度為50攝氏度 72攝氏度； 第二階段30 50次循環，變性溫度為93攝氏度 95攝氏度，退火溫度為40攝氏度 55 攝氏度，延伸溫度為50攝氏度 72攝氏度；變性、退火和延伸的保溫時間為5秒 3分鐘。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引 物總量的摩爾數與用于擴增散在重復序列Alu、MIR和/或Kpn各家族的引物總量的摩爾數 之比大于10 1，其中，用于擴增散在重復序列AhuMIR和Kpn各家族的引物總量的摩爾 數小于Ipmol。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的 擴增引物是序列是SEQID NO 1-10中的任意1 10條。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用于擴增散在重復序列Alu、MIR和/ 或Kpn各家族的引物是SEQ ID NO 11、13或者15中的任意1_3條。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的用于擴增散在重復序列Alu、MIR和/ 或Kpn各家族的引物是SEQ ID NO 12、14或者16中的任意1_3條。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PS引物是序列為SEQIDNO 17的核 酸分子。
全文摘要
本發明屬于生物醫學領域，涉及一種整合態人乳頭瘤病毒的散在重復序列檢測方法，其包括步驟1，將通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引物和針對散在重復序列Alu、MIR和Kpn家族特征序列的特異性引物混合后，通過聚合酶鏈式反應擴增DNA樣品；步驟2，將通用于人乳頭瘤病毒各亞型基因的擴增引物和PS引物混合，通過聚合酶鏈式反應，對由步驟1得到的基因擴增產物再次擴增。本方法能高效、準確地擴增和檢測出與人類基因組散在重復序列位置相鄰的整合態HPV，有助于臨床醫生對受感染細胞病理演變的轉歸趨勢作出正確判斷，從而實現在疾病早期階段阻斷病程發展，防止癌癥發生的目標。
文檔編號C12Q1/68GK101935711SQ20091005425
公開日2011年1月5日 申請日期2009年6月30日 優先權日2009年6月30日
發明者何以豐, 徐叢劍 申請人:復旦大學附屬婦產科醫院