用于生物反應器的換液方法及使用該方法的生物反應器的制作方法

專利名稱：用于生物反應器的換液方法及使用該方法的生物反應器的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物材料液體懸浮培養的換液方法及使用該方法的培養設備。更 具體地，涉及一種用于生物反應器的換液方法及使用該方法的生物反應器。
背景技術：
在生物體(例如細菌、真菌、病毒等的各種微生物)、生物體的離體器官(例如植物 的根尖、莖尖、子葉、葉原基、花原基等)、生物體的離體組織(例如植物的愈傷組織等)或生 物體的細胞(例如各種動物細胞)的液體培養過程中，都需要定期更換培養液體(培養基 等)以保證供應給被培養物足夠的營養，并及時排出被培養物的代謝廢物。所述更換培養 液體的過程被稱為換液。因此對進行生物液體培養的裝置——生物反應器的要求很高，比 如在進行所述更換培養基過程中，嚴格防止雜菌從各種渠道進入到生物反應器中引起被培 養物的污染。現有技術中用于生物反應器的換液方法一般依靠離心過濾的步驟來實現細胞與 培養液的分離，最終完成換液。比如通過生物反應器中的旋轉過濾器來實現細胞與培養液 的分離。如圖2所示，現有的生物反應器包括培養罐102、進料儲罐103、收集儲罐104以及 位于培養罐102內的旋轉過濾器101，其中，旋轉過濾器101固定在培養罐102的實心攪拌 軸109上。實心攪拌軸109的轉動帶動固定在其上的攪拌葉110和旋轉過濾器101 —起轉 動，產生離心作用，防止培養基中的被培養物或其碎片堵塞旋轉過濾器的過濾網，同時實現 被培養物和培養液體的分離。培養罐102與進料儲罐103通過進料管105相連；培養罐102 與收集儲罐104通過收集管107相連。進料管105 —端開口從進料儲罐103頂部伸入進料 儲罐103底部，另一端開口位于培養罐102頂部，并且進料管105上裝有進料泵106，可以將 新鮮培養基泵入培養罐102。收集管107 —端開口經培養罐102頂蓋從旋轉過濾器101頂 部伸入旋轉過濾器101底部，另一端開口位于收集儲罐104頂部，并且收集管107上裝有收 集泵108，可以將過濾掉被培養物或其碎片后的培養基泵入收集儲罐104。收集管中的培養 基可以用于(a)檢測被培養物代謝產物含量以監測被培養物生長情況；(b)分離由被培養 物新陳代謝產生的有用產物(比如青霉素、抗體等)；(c)通過凈化處理等處理步驟回收其 中營養成分重新利用等。現有技術中用于生物反應器的換液方法的缺點在于離心以及過濾會產生對被培 養物影響極大的剪切力。所述剪切力會損壞被培養物例如細胞的正常生理結構，甚至導致 被培養物破碎死亡，影響被培養物的產量和質量。在換液量達到一定程度(比如1000L以 上)，培養罐中的細胞密度達3. 0X 106cells/ml及以上時，很容易發生細胞堵塞過濾器濾孔 的現象，因此現有技術一般采取犧牲細胞密度的方式，來避免堵塞發生。此外，如圖2所示， 現有生物反應器排出廢液的程度取決于旋轉過濾器在生物反應器培養罐中的深度，一般情 況下，需要一邊排出廢液，一邊注入新鮮的培養基。由于旋轉軸在此過程中一直工作，很難 保證比較徹底地排除廢液，經常會把部分剛剛灌入的新鮮培養基也排出培養罐。如圖2所示，適合使用現有技術用于生物反應器的換液方法的生物反應器包括以下缺點(1)旋轉過濾器安裝拆卸操作復雜。生物反應器常常用于大規模的生物體或其離體器官、組織和細胞的液體培養。根 據實際生產的需要，生物反應器的規模可以從幾升到幾千升，甚至達到上萬噸，數百萬噸 (比如抗生素生產所需發酵罐)。由于生物反應器運行一定時間后，被培養物或其碎片可能 會堵塞旋轉過濾器的過濾網，必須拆卸旋轉過濾器清洗其過濾網。現有的生物反應器在首 次安裝時，必須先安裝旋轉過濾器，再安裝培養罐頂蓋；在拆卸旋轉過濾器時，必須首先打 開頂蓋。但是如果在被培養物生長周期過程中，生物反應器的頂蓋一旦打開，其中的被培養 物與外界接觸，會導致污染事故的發生。(2)無法在線清洗生物反應器的優點在于可以連續大規模培養生物體及其離體器官、組織和細胞， 但每種被培養物都有其一定的生長周期。如果在被培養物生長周期內發生旋轉過濾器的堵 塞，現有的生物反應器無法實現不終止生物反應器內的培養而進行旋轉過濾器的清洗。此 外，即使是一個生長周期結束，可以終止培養，也必須將按照上述復雜操作將旋轉過濾器拆 卸下來，進行超聲清洗。(3)攪拌軸負荷大，增加密封難度，且其馬達占用培養罐上方空間由于現有技術的旋轉過濾器是由培養罐實心攪拌軸帶動的，因而攪拌軸不僅要帶 動攪拌葉轉動，而且還要負荷旋轉過濾器的轉動，因而需要大功率的馬達提供動力。而馬達 的功率越大，其占用的體積也越大，因而現有技術生物反應器攪拌軸的馬達會占用生物反 應器培養罐上方的有限空間，使對生物反應器配套設施的要求提高，比如對設備所在廠房 的高度的要求增加，維修保養難度增加。此外，由于攪拌軸的負荷增大，攪拌軸與培養罐頂蓋的機械密封難度也必然增加， 容易造成生物反應器密封不完全，導致污染事故的發生。另外，旋轉過濾器需要電機、清洗機等配套設備來保證其正常工作運轉，大大增加 了生產的成本。盡管存在上述諸多缺點，現有技術仍然認為，離心以及過濾是用于生物反應器的 換液方法中所必需的步驟。如果不進行離心和過濾，被培養物和培養液體僅依靠自然沉降 分離的周期很長，生產周期延長；并且由于長時間停止旋轉進行自然沉降，會影響被培養物 的正常生長，生產效率下降。綜上，現有技術用于生物反應器的換液方法以及使用現有技術換液方法的生物反 應器還存在以上缺點，尤其是存在被培養物損傷大、污染幾率高、生產成本高的缺點，亟需 一種能夠克服上述缺點的用于生物反應器的換液方法以及使用現有技術換液方法的生物 反應器。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服目前用于生物反應器的換液方法對被培養 物損傷大、生產成本高以及使用現有技術換液方法的生物反應器安裝拆卸操作復雜、無法 在線清洗、由培養罐攪拌軸帶動引起培養罐密封難度大、馬達占用空間大和生產成本高的 缺點；提供一種對被培養物損傷小、生產成本低用于生物反應器的換液方法及使用現有技
4術換液方法的生物反應器。本發明的發明人意外地發現，如果不采用現有技術的離心過濾步驟，而是利用自 然沉降的步驟分離被培養物和培養液體，不僅能夠達到被培養物幾乎不受機械損傷就得到 分離目的，而且不會產生本領域技術人員誤以為會產生的，諸如自然沉降分離的周期很長， 導致生產周期延長；以及由于長時間停止旋轉，被培養物的正常生長受影響，生產效率下降 的問題。本發明提供了一種用于生物反應器的換液方法，其中，該方法包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少50%的被培養物沉降至所述第 一培養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面 到生物反應器底部的高度；2)移出上部的至少二分之一體積的第一培養液體；3)注入第二培養液體。本發明還提供了用于實現本發明的方法的生物反應器，其中，所述生物反應器包 括培養罐2、進料儲罐3、收集儲罐4、收集管7、進料管5以及攪拌軸1，其中，培養罐2與進 料儲罐3通過進料管5相連；培養罐2與收集儲罐4通過收集管7相連；攪拌軸1的轉動 帶動固定在其上的攪拌葉9 一起轉動；進料管5 —端開口從進料儲罐3頂部伸入進料儲罐 3底部，另一端開口位于培養罐2頂部；收集管7 —端開口最高位于所述生物反應器的最大 培養液體進料量的液面高度的二分之一處，最低位于距生物反應器底部5厘米處，另一端 開口位于收集儲罐4頂部。與現有技術相比本發明所具有的有益效果是由于本發明的用于生物反應器的換 液方法不包括離心過濾的步驟，因而大大降低了因離心過濾剪切力帶來的對于被培養物生 理結構的機械破壞。使用本發明的用于生物反應器的換液方法，在自然沉降過程中的被培 養物仍然維持正常的生理活性，并非如本領域技術人員通常持偏見所認為的那樣，由于自 然沉降周期很長，導致生產周期延長；以及由于長時間停止旋轉，被培養物的正常生長受影 響，生產效率下降的問題。相反采用本發明的用于生物反應器的換液方法大大降低了成本。此外，專門適用于實現本發明的方法的生物反應器，由于無需包括旋轉過濾器以 及與之配套的設備，大大降低了成本。“收集管7—端開口最高位于所述生物反應器的最大 培養液體進料量的液面高度的二分之一處，最低位于距生物反應器底部5厘米處”保證了上 層培養液體可以及時被收集管排出。專門適用于實現本發明的方法的生物反應器還具有操 作簡單、靈活性好、換液比例容易提前控制和設定、連續工作周期長、密封性能好、不易污染 的特點。


圖1本發明實施例1的生物反應器結構示意圖；圖2為現有技術帶有旋轉過濾器的生物反應器結構示意圖。圖 1 中1攪拌軸 2培養罐 3進料儲罐 4收集儲罐5進料管 6進料泵 7收集管 8收集泵9攪拌葉
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圖 2 中101旋轉過濾器102培養罐105進料管106進料泵109實心攪拌軸110攪拌葉
103進料儲罐 107收集管
104收集儲罐 108收集泵
具體實施例方式本發明提供的用于生物反應器的換液方法包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少50%的被培養物沉降至所述第 一培養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面 到生物反應器底部的高度；2)移出上部的至少二分之一體積的第一培養液體；3)注入第二培養液體。本發明的用于生物反應器的換液方法打破了常規必須達90%的被培養物與培養 液體分離才能換液的誤區，實際上由于所收集的下游生物產品不同，并不一定要達到如此 高的分離程度，也能實現對被培養物的連續培養以及下游生物產品的連續收集。被常常不 需改變現有的下游生物產品提取分離條件，也能從收集到的帶有少量被培養物的培養液體 得到同樣的生物產品。本發明的用于生物反應器的換液方法，利用重力即可實現，不過適當改變生物反 應器培養罐罐內的壓力，可以加速換液的過程，并且不會帶來對被培養物的機械損傷。例 如，本發明的用于生物反應器的換液方法優選包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少80%的被培養物沉降至所述第 一培養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面 到生物反應器底部的高度；2)將生物反應器內的壓力升至高于周圍環境壓力0. 02-0. IMPa，移出上部的至少 二分之一體積的第一培養液體；3)將生物反應器內的壓力降至周圍環境壓力，注入第二培養液體。本發明的用于生物反應器的換液方法更優選包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少90%的被培養物沉降至所述第 一培養液體液面高度的靠近生物反應器底部的三分之一處以下，所述培養液體液面高度指 所述第一培養液體液面到生物反應器底部的高度。2)將生物反應器內的壓力升至高于周圍環境壓力0.03-0. 05MPa，移出上部的至 少二分之一體積的第一培養液體；3)將生物反應器內的壓力降至周圍環境壓力MPa，注入第二培養液體。本發明所述的周圍環境壓力是指生物反應器工作所在地的環境氣壓，可能因生物 制藥車間的壓差控制的不同而不同，但只要產生高于周圍環境壓力的壓力差，就有助于排 出第一培養液體。本發明用于生物反應器的換液方法適用于各種被培養物，所述被培養物選自由生 物體、生物體的離體器官、生物體的離體組織和生物體的細胞所組成的組中。所述生物體可 以為本領域能夠實用液體培養的微生物，比如病毒、類病毒、朊病毒、細菌、放線菌、衣原體、支原體、立克次氏體、藍細菌、真菌(如酵母)、顯微藻類、原生動物等。所述生物體的離體 器官可以為植物的根尖、莖尖、子葉、葉原基、花原基等。所述生物體的離體組織可以為植物 的愈傷組織等。所述生物體的立體細胞可以為各種生物體的細胞比如動物細胞。所述被培 養物還可以附著在一定的載體上，比如動物細胞附著在微載體上在液體中得到培養。所述 動物細胞可以為BHK21細胞、CH0細胞、NS0細胞、Vero細胞、293細胞、Macl45細胞、MA104 細胞、PK細胞、ST細胞、MDCK細胞等傳代細胞以及MRC5、2BS等二倍體細胞；牛睪丸細胞、地 鼠腎細胞等原代細胞。所述生物體、生物體的離體器官、生物體的離體組織和生物體的比重 為本領域技術人員公知。所述生物體中對培養條件要求比較高的是動物細胞的液體培養。 能夠滿足動物細胞的液體培養的需要的方法和設備一般都能夠滿足微生物的培養。優選地，在被培養物培養到適當濃度時，開始自然沉降換液過程。例如，當所述被 培養物動物細胞生長至密度達1 x 106-1 X 107細胞/ml時，開始步驟1)靜置包含被培養物 的第一培養液體，直到至少50%的被培養物沉降至所述第一培養液體液面高度的二分之一 處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面到生物反應器底部的高度。優選 靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少80%的被培養物沉降至所述第一培養液體液 面高度的二分之一處以下，更優選靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少90%的被 培養物沉降至所述第一培養液體液面高度的三分之一處以下。自然沉降的時間范圍為5-40 小時，更優選為10-20小時。此外還優選向培養罐內施加適當的壓力。所述第一培養液體是被培養物在其中生長代謝過的培養液體，即換液過程中需要 除去的培養液體。所述第二培養液體是換液過程中需要添加的新鮮的培養液體。當一次換 液完成之后，下一次換液開始前，原有的第二培養液體也有被培養物在其中生長代謝過，即 在生物反應器中已經轉化為新的第一培養液體。所述第一培養液體與第二培養液體可以相同也可以不同。當收獲的主要是被培養 物分泌到培養液體中的代謝產物時，所述第一培養液體與第二培養液體可以相同，例如可 以都是一種培養基。換液的時機可以根據本領域公知常識來確定，例如根據檢測到的生物 反應器中營養物質的消耗程度(如葡萄糖)、代謝副產物(例如乳酸等)的累積程度，或者 被培養物所達到的密度，或者生產工藝等來確定。所述第一培養液體與第二培養液體可以因被培養物的特殊要求而不同。例如，在 通過動物細胞液體培養來生產疫苗、重組蛋白和/或抗體的工藝中需要換液時，前期液體 培養動物細胞需要用含血清的培養基，因此第一培養液體是含血清的培養基，后期收獲病 毒或蛋白則需要用無血清培養基，因此第二培養液體是含血清的培養基。在對培養好的細 胞接種病毒時，需要將第一培養液體細胞培養液，更換為第二培養液體病毒維持液。本發明提供的用于生物反應器的換液方法，可以適用于各種現有類型的生物反應 器，只是在使用本發明的方法時不進行攪拌和過濾操作即可。此外，本發明還提供了一種更 適于用于實現本發明的方法的生物反應器，其中，所述生物反應器包括培養罐2、進料儲罐 3、收集儲罐4、收集管7、進料管5以及攪拌軸1，其中，培養罐2與進料儲罐3通過進料管5 相連；培養罐2與收集儲罐4通過收集管7相連；攪拌軸1的轉動帶動固定在其上的攪拌葉 9 一起轉動；進料管5 —端開口從進料儲罐3頂部伸入進料儲罐3底部，另一端開口位于培 養罐2頂部；收集管7 —端開口最高位于所述生物反應器的最大培養液體進料量的液面高 度的二分之一處，最低位于距生物反應器底部5厘米處，另一端開口位于收集儲罐4頂部。
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優選地，通過壓力調節裝置改變生物反應器培養罐內的壓力，有利于加快換液過 程。例如所述進料管5上裝有進料壓力裝置6;所述收集管7上裝有收集壓力裝置8。所 述壓力裝置可以是諸如泵等本領域常規可用的所有壓力裝置。此外，所述生物反應器還包 括溫控裝置，可以將生物反應器培養罐以及進料管中的溫度控制在15-35°C，優選控制在 15-20°C。所述生物反應器在安裝后反應前，都按照被培養物的一般培養要求進行清洗和消 毒操作，比如在i2rc高溫高壓條件下濕熱滅菌。下面結合圖1和圖2，具體說明本發明用于生物反應器的換液方法及實現該方法 的生物反應器的工作過程，以及現有的用于生物反應器的換液方法及實現該方法的生物反 應器的工作過程。實施例1生物反應器Clavorus 500L動物細胞培養用生物反應器(北京天和瑞生物科技 有限公司制造)該儀器屬于現有生物反應器的一種，該生物反應器帶有旋轉過濾器。在使 用本發明的方法換液時，停止攪拌軸旋轉。被培養物BHK21細胞培養基BHK21細胞懸浮培養基(MD910，北京清大天一生物技術有限公司制造)細胞培養過程所述生物反應器中裝有的被培養細胞和培養基的體積為420L，當BHK21細胞生長 至3 X 106cells/ml時，停止攪拌軸轉動，靜置30小時后，90 %的細胞沉降至培養基液面高 度的三分之一處以下，所述培養基液面高度指所述培養基液面到生物反應器底部的高度， 即細胞集中在培養基液體靠近生物反應器底部的三分之一部分。將生物反應器內的壓力升 高于周圍環境壓力0. 05MPa，移出上部的300L的培養基；將生物反應器內的壓力降周圍環 境壓力，注入新鮮培養基至體積達420L。換液后細胞密度仍在3X106cells/ml數量級，細 胞活率超過94%。換液完成2小時后取樣，測定培養罐中培養基的葡萄糖濃度大于所含葡 萄糖的濃度大于lg/L。實施例2 生物反應器ClaVOrus 2000L動物細胞培養用生物反應器(北京天和瑞生物科技 有限公司制造)。在使用本發明的方法換液時，停止攪拌。被培養物CH0細胞培養基CH0細胞無血清無動物組分培養基(SAF01，北京清大天一生物技術有限公司制造)細胞培養過程所述生物反應器中裝有的被培養細胞和培養基的體積為1500L，當BHK21細胞生 長至3. 3X106cells/ml時，停止攪拌軸轉動，靜置20小時后，80%的細胞沉降至培養基液 面高度的二分之一處以下，所述培養基液面高度指所述培養基液面到生物反應器底部的高 度。將生物反應器內的壓力升至高于周圍環境壓力0. IMPa，移出上部的700L的培養基； 將生物反應器內的壓力降至周圍環境壓力，注入新鮮培養基至體積達1500L。換液后細胞 密度仍在3X 106cells/ml數量級，細胞活率超過90%，繼續培養1天，細胞密度可提高至6.2X106cellS/ml，細胞活率約為96%。換液完成2小時后取樣，測定培養罐中培養基的葡 萄糖濃度大于0. 85g/L，近一半的廢液被排走，換液比較徹底。實施例3生物反應器ClaVOrUS 500L動物細胞培養用生物反應器(北京天和瑞生物科技 有限公司制造)該儀器屬于現有生物反應器的一種，該生物反應器帶有旋轉過濾器。對該 反應器進行了如下改裝拆除了旋轉過濾器，將收集管開口位于距生物反應器底部8厘米 處，如圖1所示。被培養物BHK21細胞培養基BHK21細胞懸浮培養基(MD910，北京清大天一生物技術有限公司制造)細胞培養過程所述生物反應器中裝有的被培養細胞和培養基的體積為420L，當BHK21細胞生長 至3X106cells/ml時，停止攪拌軸轉動，靜置30小時后，取樣發現約90%的細胞沉降至距 反應器底部5cm以下，用無菌壓縮空氣將生物反應器內的壓力升至0. 03MPa，移出上部的 380L的培養基；將生物反應器內的壓力降至周圍環境壓力(1個大氣壓)，注入新鮮培養基 至體積達420L。換液后細胞密度約為2.8X106cells/ml數量級，細胞活率超過96%。換液 完成2小時后取樣，測定培養罐中培養基的葡萄糖濃度大于1. 4g/L，約90%的廢液被排走， 換液效果非常徹底。實施例1-3所使用的細胞計數的測定方法具體步驟如下(1)將血球計數板擦拭干凈，蓋玻片可用無水乙醇預先浸泡，用時將之擦干凈，蓋 于計數室上方；(2)取待測細胞懸液樣品；(3)將0. lml細胞懸液從所述待測細胞懸液樣品中吸出沿蓋玻片邊緣自然滲入， 使懸液充滿蓋片和計數板之間，不要留有氣泡，亦不要外溢；(4)靜置，40倍或10倍光學顯微鏡下觀察計數板四角大方格和中央大方格中細 胞數，細胞壓中線時，一般遵循“計左不計右，計上不計下”的原則。將計數結果代入下式計 算5大格細胞總數/5X104X稀釋倍數=細胞數/ml。實施例1-3所使用的細胞活率的測定方法具體步驟如下(1)將細胞懸液與0. 4%臺盼藍染液以等體積混合；(2)輕輕吹打細胞使之分散混勻，染色2-3分鐘；(3)依上述細胞計數方法的步驟操作，可在鏡下任意取幾個視野分別計死細胞和 活細胞數，計細胞活力，將計數結果代入下式{細胞總數-死細胞數(深藍色)}/細胞總數X 100%=細胞活率。對比例1生物反應器Clavorus 500L動物細胞培養用生物反應器(北京天和瑞生物科技 有限公司制造)該儀器屬于現有生物反應器的一種，該生物反應器帶有旋轉過濾器。在使 用現有技術的方法換液。被培養物BHK21細胞
培養基BHK21細胞懸浮培養基(MD910，北京清大天一生物技術有限公司制造)細胞培養過程所述生物反應器中裝有的被培養細胞和培養基的體積為420L，當BHK21細胞生長 至3 X 106cells/ml左右，通過離心過濾分離細胞和培養基，注入新鮮培養基至體積達420L。 換液開始后8小時后取樣，測定培養罐內的培養基中所含葡萄糖的濃度不到0. 5g/L。在換 液過程進行10小時后，由于細胞密度過大，發生旋轉過濾器堵塞，終止培養過程。實施例1-3和對比例1中換液后葡萄糖的濃度，是應用YSI2700生化分析儀(美 國維賽儀器公司制造)按照其產品說明書中提供的方法和步驟來測定的。實施例1-3及 對比例比較可以看出，由于廢液的排除和新鮮培養基的注入可以是分步完成的，本發明用 于生物反應器的換液方法比現有的換液方法更徹底，不會浪費新鮮培養基。葡萄糖濃度達 1. 5g/L的新鮮培養基，經本發明換液方法注入后2小時，培養罐內的葡萄糖的濃度仍然能 維持在0. 8g/L，可以說明大部分廢液被排走，對新鮮培養基的稀釋作用小，換液徹底。而對 比例換液開始后8小時后取樣，測定培養罐內的培養基中所含葡萄糖的濃度不到0. 5g/L， 新鮮的培養基被未排除的廢液稀釋很多。并且由于不使用旋轉過濾器，因此對細胞的損傷 小。并且由于不存在堵塞過濾孔的顧慮，可以在細胞生長至細胞密度很高的時候再開始進 行換液。
權利要求
一種用于生物反應器的換液方法，其特征在于，該方法包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少50％的被培養物沉降至所述第一培養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面到生物反應器底部的高度；2)移出上部的至少二分之一體積的第一培養液體；3)注入第二培養液體。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少80%的被培養物沉降至所述第一培 養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面到生 物反應器底部的高度；2)將生物反應器內的壓力升至高于周圍環境壓力0.02-0. IMPa，移出上部的至少二分 之一體積的第一培養液體；3)將生物反應器內的壓力降至周圍環境壓力，注入第二培養液體。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述被培養物選自由生物體、生物體的離 體器官、生物體的離體組織和生物體的細胞所組成的組中。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述被培養物為動物細胞。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述被培養物選自由BHK21細胞、CH0細 胞、NS0細胞、Vero細胞、293細胞、Macl45細胞、MA104細胞、PK細胞、ST細胞、MDCK細胞、 MRC5細胞、2BS細胞、牛睪丸細胞、地鼠腎原代細胞所組成的組中。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，該方法包括1)當所述被培養物動物細胞生長至密度達1 X 106-1 X 107細胞/ml時，靜置包含被培 養物的第一培養液體，直到至少50%的被培養物沉降至所述第一培養液體液面高度的二分 之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面到生物反應器底部的高度。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培養液體與第二培養液體相同。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培養液體為細胞培養液，所述第 二培養液體為病毒維持液。
9.用于實現權利要求1-8中任意一項所述的方法的生物反應器，其特征在于，所述生 物反應器包括培養罐(2)、進料儲罐(3)、收集儲罐(4)、收集管(7)、進料管(5)以及攪拌軸 (1)，其中，培養罐(2)與進料儲罐(3)通過進料管(5)相連；培養罐(2)與收集儲罐(4)通 過收集管(7)相連；攪拌軸(1)的轉動帶動固定在其上的攪拌葉(9) 一起轉動；進料管(5) 一端開口從進料儲罐(3)頂部伸入進料儲罐(3)底部，另一端開口位于培養罐(2)頂部；收 集管(7) —端開口最高位于所述生物反應器的最大培養液體進料量的液面高度的二分之 一處，最低位于距生物反應器底部5厘米處，另一端開口位于收集儲罐(4)頂部。
10.根據權利要求9所述的生物反應器，其特征在于，所述進料管(5)上裝有進料壓力 裝置(6)；所述收集管(7)上裝有收集壓力裝置(8)。
全文摘要
本發明提供了一種用于生物反應器的換液方法，該方法包括1)靜置包含被培養物的第一培養液體，直到至少50％的被培養物沉降至所述第一培養液體液面高度的二分之一處以下，所述培養液體液面高度指所述第一培養液體液面到生物反應器底部的高度；2)移出上部的至少二分之一體積的第一培養液體；3)注入第二培養液體。本發明還提供了適用該換液方法的生物反應器。由于本發明的換液方法不包括離心過濾的步驟，降低了因離心過濾剪切力帶來的對于被培養物生理結構的機械破壞，并降低了成本。適用于實現本發明的方法的生物反應器還具有操作簡單、靈活性好、換液比例容易提前控制和設定、連續工作周期長、密封性能好、不易污染的特點。
文檔編號C12M3/02GK101870951SQ200910082960
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月27日 優先權日2009年4月27日
發明者劉俊生, 張韌, 王建超, 陳文慶 申請人:北京清大天一科技有限公司