利用菠蘿皮汁進行“二步法”發酵生產細菌纖維素的方法

專利名稱：利用菠蘿皮汁進行“二步法”發酵生產細菌纖維素的方法
技術領域：
本發明涉及細菌纖維素的生產及菠蘿皮的綜合利用，具體是指一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法。
背景技術：
細菌纖維素具有良好的透水、透氣性能、很強的親水性、非凡的持水性(吸收600-700倍于其干重的水分)并具有高濕強度，因此具有許多潛在的應用前景。細菌纖維素在音響、食品、日化、醫藥、造紙等工業中已經實現了商業化應用，被認為是目前世界上性能最好的纖維素。自該產品面市以來，在國際市場上一直暢銷不衰。現有細菌纖維素生產企業的生產能力遠無法滿足市場的對細菌纖維素的大量需求。因此改進細菌纖維素的發酵工藝得到理想的產量已成為當今的研究熱點。
現有的細菌纖維素的生產技術主要存在兩個問題(l)發酵周期長，長達7 12天；(2)采用淺盤發酵，菌體生長繁殖與發酵產纖維素的生產沒有分開進行，造成發酵周期長、生產效率低，大規模生產受到限制。
申請號為200710030072.0的中國發明專利申請公開了 "深層與淺層靜態偶聯發酵生產高纖椰果的方法"，該方法是將木醋桿菌接入20~100%的椰子水中進行84~13211 (3.5~5.5天)的深層靜態發酵，之后再裝入淺盤進行40 192h (1.7~8.0天)的產椰果的發酵，其優點是將木醋桿菌增值培養(非生產時間)與發酵產纖維素(生產時間)的兩個階段分開，在一定程度上可以縮短生產周期，提高生產效率。但是由于木醋桿菌是需氧菌，在菌體大量增殖期間需要大量的氧氣，而深層靜態培養會影響氧的傳遞，因此木醋桿菌增值不充分，耗費大量的增值培養時間；同時兩個階段使用的培養基相同，很難體現增菌培養的效果，增值培養階段是木醋桿菌細胞大量繁殖的階段，需要比較多的蛋白質，而發酵產纖維素的階段是大量利用碳源進行發酵生產細菌纖維素，需要比較多的碳水化合物(葡萄糖、果糖)，因此，兩個階段不僅要分開，而且培養基也要不同，才能滿足不同目的的需要。
申請號為200810022129.7的中國發明公開了 "一種動靜結合制備細菌纖維素的方法"，該發明的方法的細菌纖維素的產量僅為13.6g/L，由于培養基營養不充分，產量不高，沒有用到菠蘿皮作原料。
上述現有技術由于沒有將菌體生長繁殖與發酵生產分開，或選用的培養基、培養條件和發酵條件不合適，普遍存在細菌纖維素的生長周期長，產量低。菠蘿(Pineapple)是熱帶、亞熱帶特有的水果，在加工過程中有50 % 60 %的菠蘿皮、渣被加工廠丟棄(菠蘿皮薄多汁，不耐儲運)，這既浪費了大量的資源，又嚴重污染加工區的生態環境，研究表明菠蘿皮、渣含有的營養成分與果肉的基本成分相接近。用菠蘿皮、渣可制成低度果酒、白蘭地、果醋、果凍、酸乳飲料、酚類抗氧化劑、檸檬酸等。菠蘿加工中產生大量的菠蘿皮、渣，嚴重污染生態環境。Keshk和Sameshima研究表明碳源的種類對細菌纖維素的產量影響很大，單純用葡萄糖作碳源會產生大量的葡萄糖酸，使pH下降，不利于菌株生長從而降低產量，因此葡萄糖和果糖比例是生產細菌纖維素的關鍵因素。研究還表明，椰子水中天然含有K+、 Na+、 Ga2+、 Mn2+、 Mg2+、 Fe^和含有促生長的生長激素，若用其它營養成分替代椰子水，要仔細研究各成分之間的科學配比，才能盡可能多地發酵生產細菌纖維素。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述現有技術存在的不足，提供一種生產成本低廉，生長周期為3 7天、產量為17.5 g/L (干重)以上的利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法。
本發明以菠蘿皮榨出的汁(Juice of Pineapple by-Products，簡稱JPP)為原料，將木醋桿菌(Uc咖6"c加j^",)進行"二步法"發酵，"二步法"發酵是指將菌體"生長繁殖"與"發酵生產"兩個過程分開，在兩個過程中分別采用不同的培養基進行發酵，即是采用發酵罐進行通氣培養，經精確的可控發酵，使菌種在良好的培養條件下快速繁殖，將經過快速增長后的菌種分裝發酵盆進行產膜(細菌纖維素)發酵，有效控制雜菌的污染，大幅度縮短靜置培養時間，顯著提高生產效率，將發酵周期縮短至3 7天，得到產量17.5g/L(干基重)以上的細菌纖維素。
本發明的目的通過如下技術方案實現.-
1、 一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件
第一步活化菌種以重量百分比為0.01 0.50 %的比例將木醋桿菌(v4ceto6"cto"jqy/Zmw7)的菌種接入到100 200 ml的種子培養基中，于22 28。C， 100~200 rpm中培養8 12h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述種子培養基配方為蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0-99.5份，攪拌溶解均勻后調節pH至4.5 5.5，用0.08~0.10 MPa滅菌15 20 min，冷卻至22~28 。C備用；
第二步菌體大量增殖培養以體積比為4 20: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于22 28。C，發酵過程中在不斷通入無菌空氣，并在100 200rpm攪拌下培養24h 72h，木醋桿菌活菌數為10S 10、fu/ml，制成工作發酵劑；以重量份數計，所述工作發酵劑培養基原料配方為蛋白胨0.5~4.0份和椰子水96.0 99.5份，攪拌溶解均勻后調節pH至4.5 5.5，用0.08^0.10MPa滅菌15 20min，冷卻至22~28 。C備用；
第三步發酵生產細菌纖維素以體積比為10 30: IOO的比例，將所述工作發酵劑接入發酵培養基中，于25 35。C，淺盤靜止培養72h 168h,得到細菌纖維素膜；以重量份數計，所述發酵培養基原料配方為菠蘿皮清汁30 40份、椰子水20~40份、葡萄糖1.5~2.5份、果糖4.5~7.5份、醇0.02~1.00份、r-氨基丁酸0.0002 0.001份、檸檬酸三鈉0.01 0.30份、KH2P04 0.1~0.3份、硫酸鎂0.01 0.04份、FeSO40.0001 0.0005份、硫酸錳0.015~0.025份、CaCl2 0,020 0.075份和蒸餾水8 44份，攪拌溶解均勻后調節pH至3.5 5.0，用0.08~0.10MPa滅菌15 20 min，冷卻至25-35 。C備用；所述菠蘿皮清汁的制作將菠蘿皮搾汁，用100-300目的過濾網過濾后，清汁用0.08 0.10 MPa滅菌15 20 min，冷卻至25-35 。C備用，制得菠蘿皮清汁。
為進一步實現本發明目的，第一步、第二步和第三步中優選用醋酸調節培養基的pH值。第三步的淺盤厚度為40 50 mm。
第二步中母發酵劑與工作發酵劑培養基的體積比優選為10: 100， pH優選為5.5，發酵溫度優選為25。C。
第三步的發酵溫度優選為30。C,攪拌轉速優選150rpm，工作發酵劑培養基的葡萄糖與果糖的質量比為1: 3。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果
(1) 本發明的木醋桿菌工作發酵劑先經過第一步活化培養，再進行大量增殖培養，使木醋桿菌盡量被活化，處于同步生長狀態，并增殖到菌數最多，有利于后期的大量發酵生產細菌纖維素。
(2) 本發明所用的生產培養基，采用菠蘿皮清汁和椰子水的可控配方， 一方面可以降低生產成本，另外，還變廢為寶。
(3) 本發明采用木醋桿菌增菌培養與發酵生產兩步法的方法，充分利用木醋桿菌的生長特點，最大化地生產細菌纖維素，并大大縮短了生產時間，簡化了手工操作的勞動強度。發酵周期從7~12天縮短到3~7天。
(4) 由于考慮了葡萄糖和果糖比例是生產細菌纖維素的關鍵因素，因此發酵過程中不會產生大量的葡萄糖酸，而保證發酵產生大量的細菌纖維素。(5) 由于科學運用了K+、 Na+、 Ga2+、 Mn2+、 Mg2+、 F^+和促生長素各成分之間的科學配比，細菌纖維素的產量高達17.5 g/L (干基重)以上。
(6) 由于生產周期大大縮短，減少了操作過程中的污染環節，保證了產品質量的穩定性，符合規模化生產的需要。


圖1為木醋桿菌在實施例1中經過第二步大量增殖培養后的電子顯微鏡照片(放大3000倍)；
圖2為木醋桿菌在實施例l中培養5天后細菌纖維素的電子顯微鏡照片(放大10000倍)。
具體實施例方式
為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明做進一步地詳細說明，但是本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表示的范圍。實施例1
一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法，包括如下步驟第一步活化菌種以重量百分比為0.01 。/。的比例將木醋桿菌ATCC 23767(67〃co"acefa6acter"http://"wm，簡稱乂c"o6a"er "http://"wm，中國普通微生物保藏管理中心保藏，地址北京市朝陽區北辰西路l號院，郵編100101，電話86-10-64807596)菌種接入到100ml的種子培養基中，于25。C， 150rpm中培養10h，制成母發酵劑；所述種子培養基配方為蛋白胨20 g，椰子水980 g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為4.5，用O.IO MPa滅菌15min，冷卻至25。C備用。
第二步菌體大量增殖培養以體積比為10: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑
培養基中，于25T，在發酵過程中不斷通入無菌空氣，并用150rpm攪拌下培養72h，此時木醋桿菌活菌數為6.9xl(^cfWml，制成工作發酵劑；所述工作發酵劑培養基配方為蛋白胨3.0g，椰子水970g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為4.5，用O.IO MPa滅菌15min，冷卻至25 。C備用。
第三步發酵生產細菌纖維素以體積比為20: IOO的比例，將工作發酵劑接入發酵培養基中，于30。C，淺盤靜止培養120h(5天)，即得到細菌纖維素膜；發酵培養基配方為菠蘿皮清汁400 g，椰子水200 g,葡萄糖15 g，果糖45 g,乙醇0.5 ml, r-氨基丁酸0.002 g，檸檬酸三鈉0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.1g，硫酸亞鐵0.001 g，硫酸錳0.15g,氯化鈣0.20 g,蒸餾水338 g,攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為3.5，用0.10 MPa滅菌15 min，冷卻至30 。C備用。所述菠蘿皮清汁的制作將菠蘿皮榨汁，用300目的過濾網過濾后，清汁用0.10MPa滅菌15min，冷卻至30。C備用，為菠蘿皮清汁；
通過對木醋桿菌培養條件的深入研究，嚴格控制發酵劑的發酵 培養條件、發酵時間，選擇經過第一、二步的增殖培養，盡量使所有的細胞處于同步生長 時期，在線控制發酵pH和嚴格控制收獲時間，活細胞數達到10、10Scfu/g，通過大量增殖 培養后的菌體見圖1，從圖l可以看出，木醋桿菌經過大量增值后生長旺盛，菌體成團狀 分布，收獲時間以看不見可見纖維團為準，增菌培養時間過長，會使纖維素包裹住菌體肉 眼可見成團狀。研究表明利用菠蘿皮清汁進行生產的細菌纖維素質構緊密、均勻，見圖2。 實施例1中細菌纖維素膜的干重為20.5 g/L。由于木醋桿菌先經過第一步活化培養，再進 行大量增殖培養，且處于同步生長狀態，有利于后期的大量發酵生產細菌纖維素；而且由 于采用菠蘿皮清汁和椰子水的可控配方，降低了生產成本；本發明將木醋桿菌增菌培養與 發酵生產兩步法的方法，充分利用木醋桿菌的生長特點，最大化地生產細菌纖維素，大大 縮短了生產時間，簡化了手工操作的勞動強度，發酵周期從7~12天縮短到3~7天；葡萄 糖和果糖比例是生產細菌纖維素的關鍵因素，本發明發酵過程中不會產生大量的葡萄糖 酸，而保證發酵產生大量的細菌纖維素；本發明還科學運用了 K+、 Na+、 Ga2+、 Mn2+、 Mg2+、 F^+和促生長素各成分之間的科學配比，細菌纖維素的產量高達17.5 g/L (干基重)以上； 由于生產周期大大縮短，減少了操作過程中的污染環節，保證了產品質量的穩定性，符合 規模化生產的需要，使得生產細菌纖維素的成本大大降低，產量大大提高。
實施例2
一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法，包括如下步驟-
第一步活化菌種以重量百分比為0.50 n/。的比例將木醋桿菌ATCC 23767 (67〃co朋ceto^"er;^/,'"ww，簡稱Jc"o6flcfcr砂//""附，中國普通微生物保藏管理中心保 藏，地址北京市朝陽區北辰西路l號院，郵編100101，電話86-10-64807596)菌種接 入到200ml的種子培養基中，于22。C， 100rpm中培養8h，制成母發酵劑；以重量分數計， 所述種子培養基配方為蛋白胨5g，椰子水995g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為5.5， 用0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至22。C備用。
第二步菌體大量增殖培養以體積比為4: IOO的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑 培養基中，于22。C,在發酵過程中不斷通入無菌空氣，并用100rpm攪拌下培養24h,此時 木醋桿菌活菌數為8.7xl()Scfu/ml，制成工作發酵劑；以重量分數計，所述工作發酵劑培養 基配方為蛋白胨5g，椰子水995 g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為5.5，用0.08 MPa滅 菌20min，冷卻至22。C備用。
第三步發酵生產細菌纖維素 以體積比為10: IOO的比例，將工作發酵劑接入發酵培養基中，于25 。C，淺盤靜止培養168 h (7天)，即得到細菌纖維素膜；以重量分數計， 所述發酵培養基配方為菠蘿皮清汁300g，椰子水300g，葡萄糖25g，果糖75g，乙醇0.2 ml， r-氨基丁酸O.Ol g，檸檬酸三鈉3 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂0.4 g，硫酸亞鐵0.005 g， 硫酸錳0.25 g，氯化鈣0.75 g，蒸餾水292 g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為5.0，用0.08 MPa 滅菌20min，冷卻至25 。C備用。所述菠蘿皮清汁的制作將菠蘿皮榨汁，用100目的過濾 網過濾后，清汁用0.08 MPa滅菌20 min，冷卻至25。C備用，為菠蘿皮清汁；
實施例2中細菌纖維素膜的干重為17.9 g/L。
實施例3
一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方法，包括如下步驟 第一步活化菌種以重量百分比為0.25 e/。的比例將木醋桿菌ATCC 23767 (67"co/7ace"Zja"erx;;//www，簡稱^cetoZ^"er中國普通微生物保藏管理中心保 藏，地址北京市朝陽區北辰西路l號院，郵編100101，電話86-10-64807596)菌種接 入到150ml的種子培養基中，于28。C， 200rpm中培養12h，制成母發酵劑；以重量分數計， 所述種子培養基配方為蛋白胨40g，椰子水960g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為5.0， 用0.09MPa滅菌18min，冷卻至28 。C備用。第二步菌體大量增殖培養以體積比為20: 100 的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于28。C，在發酵過程中不斷通入無菌空氣， 并用200rpm攪拌下培養72h，此時木醋桿菌活菌數為1.6x109 cfb/ml，制成工作發酵劑；以 重量分數計，所述工作發酵劑培養基配方為蛋白胨40份，椰子水960 g，攪拌溶解均勻 后用醋酸調節pH為5.0，用0.09 MPa滅菌18 min，冷卻至28 。C備用。
第三步發酵生產細菌纖維素以體積比為30: IOO的比例，將工作發酵劑接入發酵培 養基中，于35。C，淺盤靜止培養72h G天)，即得到細菌纖維素膜；以重量分數計，所述 發酵培養基配方為菠蘿皮清汁200g，椰子水400g，葡萄糖20g，果糖60g，乙醇10ml， r-氨基丁酸0.004 g，檸檬酸三鈉1.5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.003g，硫 酸錳0.20g，氯化鈣0.48g，蒸餾水526g，攪拌溶解均勻后用醋酸調節pH為4.5，用0.09MPa 滅菌18 min，冷卻至35 。C備用。所述菠蘿皮清汁的制作將菠蘿皮榨汁，用200目的過濾 網過濾后，清汁用0.09MPa滅菌18min，冷卻至35。C備用，為菠蘿皮清汁； 實施例3中細菌纖維素膜的干重為17.5 g/L。
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權利要求
1、一種利用菠蘿皮汁進行“二步法”發酵生產細菌纖維素的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件第一步活化菌種以重量百分比為0.01～0.50％的比例將木醋桿菌(Acetobacterxylinum)的菌種接入到100～200ml的種子培養基中，于22～28℃，100～200rpm中培養8～12h，制成母發酵劑；以重量份數計，所述種子培養基配方為蛋白胨0.5～4.0份和椰子水96.0～99.5份，攪拌溶解均勻后調節pH至4.5～5.5，用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至22～28℃備用；第二步菌體大量增殖培養以體積比為4～20∶100的比例，將母發酵劑接入工作發酵劑培養基中，于22～28℃，發酵過程中在不斷通入無菌空氣，并在100～200rpm攪拌下培養24h～72h，木醋桿菌活菌數為108～109cfu/ml，制成工作發酵劑；以重量份數計，所述工作發酵劑培養基原料配方為蛋白胨0.5～4.0份和椰子水96.0～99.5份，攪拌溶解均勻后調節pH至4.5～5.5，用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至22～28℃備用；第三步發酵生產細菌纖維素以體積比為10～30∶100的比例，將所述工作發酵劑接入發酵培養基中，于25～35℃，淺盤靜止培養72h～168h，得到細菌纖維素膜；以重量份數計，所述發酵培養基原料配方為菠蘿皮清汁30～40份、椰子水20～40份、葡萄糖1.5～2.5份、果糖4.5～7.5份、醇0.02～1.00份、r-氨基丁酸0.0002～0.001份、檸檬酸三鈉0.01～0.30份、KH2PO40.1～0.3份、硫酸鎂0.01～0.04份、FeSO40.0001～0.0005份、硫酸錳0.015～0.025份、CaCl2 0.020～0.075份和蒸餾水8～44份，攪拌溶解均勻后調節pH至3.5～5.0，用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至25-35℃備用；所述菠蘿皮清汁的制作將菠蘿皮榨汁，用100～300目的過濾網過濾后，清汁用0.08～0.10MPa滅菌15～20min，冷卻至25-35℃備用，制得菠蘿皮清汁。
2、 根據權利要求l所述的一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方 法，其特征在于第一步、第二步和第三步中用醋酸調節培養基的pH值。
3、 根據權利要求l所述的一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方 法，其特征在于第三步的淺盤厚度為40 50mm。
4、 根據權利要求l所述的一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方 法，其特征在于第二步中母發酵劑與工作發酵劑培養基的體積為10: 100， pH為5.5，發 酵溫度為25 。C。
5、 根據權利要求l所述的一種利用菠蘿皮汁進行"二步法"發酵生產細菌纖維素的方 法，其特征在于第三步的發酵溫度為30 。C，攪拌轉速為150 rpm，工作發酵劑培養基的 葡萄糖與果糖的質量比為l: 3。
全文摘要
本發明公開了一種利用菠蘿皮汁進行“二步法”發酵生產細菌纖維素的方法。該方法將木醋桿菌菌體增殖與發酵生產細菌纖維素兩個階段分開，于22～28℃，在發酵過程中不斷通入無菌空氣，并用100～200rpm攪拌下培養24h～72h，此時木醋桿菌活菌數為10⁸～10⁹cfu/ml，經過菌體增殖培養，盡量使細胞處于同步生長時期，然后在菠蘿皮清汁的發酵培養基中，淺盤靜止培養72h～168h，得到細菌纖維素產量為17.5g/L以上。該方法使細菌纖維素的生產周期大大縮短，將菠蘿皮進行了綜合利用，保護了環境，生產出的細菌纖維素質構致密、均勻。
文檔編號C12P19/00GK101671708SQ200910193119
公開日2010年3月17日 申請日期2009年10月19日 優先權日2009年10月19日
發明者于淑娟, 劉冬梅, 暉 吳 申請人:華南理工大學