用于分離非常小的胚胎樣(vsel)干細胞的方法

專利名稱：用于分離非常小的胚胎樣(vsel)干細胞的方法
技術領域：
當前披露的主題總體上涉及從骨髓、臍帶血、和/或其它來源分離的干細胞(在本文中被稱為非常小的胚胎樣(very small embryonic-like) (VSEL)干細胞)群的鑒定、分離及應用。更具體地，當前披露的主題涉及分離所述VSEL干細胞并且(任選地在體外處理后)將其用于治療需要其的受試者中的組織和/或器官損傷。
背景技術：
干細胞和干細胞衍生物的應用已經在醫藥研究中，尤其在提供用于治療由于遺傳缺陷、創傷、和/或疾病過程的任何一個造成的組織損傷的試劑領域中獲得提高的興趣。理想地，能夠分化為受影響的細胞類型的細胞可以被移植入需要其的受試者中，其中它們將與器官微環境相互作用并供應必須的細胞類型以修復損傷。已經付出了相當多的努力以從大量不同的組織中分離干細胞用在再生醫藥中。例如，授予I^sukamoto et al.的美國專利No. 5，750，397披露了據報道能夠分化為淋巴細胞、 紅細胞(erythroid)、和髓細胞單核細胞(myelomonocytic)譜系的人類造血干細胞的分離和生長。授予Bruder et al.的美國專利No. 5，736，396披露了用于在合適的生長和/或分化因子的影響下分離的人類間充質干細胞的譜系定向分化的方法。隨后可以將所述得到的細胞引入宿主用于間充質組織再生或修復。強烈感興趣的一個領域涉及胚胎干(EQ細胞的應用，其已經在小鼠中顯示具有分化為動物的所有不同的細胞類型的潛能。小鼠ES細胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的內細胞群的細胞，并且其它多能和/或全能細胞已經從胚(germinal)組織(如原始生殖細胞；PGC)分離。這些多能和/或全能干細胞以未分化狀態在體外增殖、保持10正常核型、 以及保持分化為全部的三個胚層(內胚層、中胚層及外胚層)的衍生物的潛能的能力使得這些細胞作為細胞的潛在來源用在出生后受試者的再生治療中是有吸引力的。人類ES(hES)細胞的開發還不及對小鼠ES細胞進行的進展成功。Thomson et al.報道了來自低等靈長類(美國專利 No. 5，843，780 ;Thomson et al. (1995)92 Proc Natl Acad Sci USA 7844-7848)、以及來自人類(Thomson et al. (1998)282 Science 1145-1147)的多能干細胞。Gearhart et al.產生了來自胎兒性腺組織的人類胚胎生殖(hEG)細胞系(Shamblott et al. (1998)95 Proc Natl Acad Sci USA 13726-13731 ；及美國專利No. 6，090，622)。hES和hEG細胞均具有多能干細胞的理想特征，在于它們能夠在體外增殖而不分化，它們通常維持正常的核型，并且它們仍然能夠分化為多種不同的細胞類型。 無性(clonally)來源的人類胚胎干細胞系在培養中長期維持多能性和增殖潛能(Amit et al. (2000)227 Dev Biol 271—278)。ES細胞或其它多能細胞用于受試者中再生治療的一個重大挑戰是控制細胞生長和分化為受試者治療所需的特定細胞類型。已有許多生長因子對ES細胞分化的影響的報道。例如，Schuldiner et al.報道了八種生長因子對細胞從hES細胞分化為不同細胞類型的影響(參見khuldiner et al. (2000)97 Proc Natl Acad Sci USA 11307-11312)。如其中所披露的，在開始通過胚狀體樣(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、TGFPI、 活化素-A、BMP-4、HGF、EGF、PNGF、或視黃酸的存在下培養細胞。每種生長因子對分化途徑具有獨特的影響，但是沒有生長因子排他地指導分化為一種細胞類型。理想地，能夠從受試者分離和純化干細胞和/或前體細胞是有益的，所述細胞能夠在被再引入受試者用于治療目的之前被純化和/或體外處理。受試者的自身細胞的應用將消除采用輔助免疫抑制治療的需要，由此維持受試者免疫系統的能力。然而，用于分離ES 細胞系，尤其是hES細胞系的目前的策略排除了從受試者分離細胞并將它們再引入相同的受試者。因此，對于來自成年動物的其它干細胞類型的研究在繼續。例如，間充質干細胞(MSC)是一種這樣的細胞類型。已經顯示MSC具有分化為包括骨(Haynesworth et al. (1992) 13 Bone 81-88)、軟骨(Mackay et al. (1998)4 Tissue Eng 415-28 ；Yoo et al. (1998)80 J Bone Joint Surg Am 1745-57)、脂肪組織(Pittenger et al. (2000)251 Curr Top Microbiol Immunol-11)、腱(Young et al. (1998)16 J Orthop Res 406-13)、肌肉及基質(Caplan et al. (2001)7 Trends Mol Med 259-64)的多個譜系的潛能。另一細胞群，多能成年祖細胞(MAPC)也已經從骨髓純化(BM ；Reyes et al. (2001)98 Blood 25 261 5-2625 ；Reyes & Vetfaillie 0001) 938 Ann NY Acad Sci 231-23 。這些細胞已經顯示能夠在體外擴展為超過100次的群體倍增(100 population doubling)而沒有端粒縮短或核型異常的發生。已經顯示MAPC在限定的培養條件下能夠分化為各種間充質細胞30類型(如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞及骨骼成肌細胞)、內皮、神經外胚層細胞、以及更最近的，分化為肝細胞(Sctiwartz et al. (2000) 109 J Clin Invest 1291-130 。此外，已報道造血干細胞(HSC)能夠分化為多種細胞類型。已報道BM造血干細胞能夠“轉分化(transdifferentiate) ” 為表達早期心(Orlic et al. (2003)7 Pediatr Transplant 86-88 ；Makino et al. (1999) 103 J Clin Invest 697-705)、骨骼肌(Labarge & BlaiK2002) 111 Cell 589-601 ；Corti et al. (2002)277 Exp Cell Res 74-85)、神經(&inchez-Ramos^002)69 Neurosci Res 880-893)、肝(Petersen et al. (1999)284 Science 1168-1170)、或胰腺細胞(lanus et al. (2003) 111 J Clin Invest 843-850 ；Lee & Stoffel (2003) 111 J Clin Invest 799-801)標記物的細胞。在人類體內實驗中還表明 CD34+外周血(PB)干細胞的移植導致供體-來源的肝細胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、上皮細胞(Korbling et al. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、和神經元(Hao et al. (2003) 12 J Hematother Stem Cell Res 23-32)的出現。此外，已顯示人類BM-來源的細胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al. (2003)361 Lancet 45-46)。這些報道已經被解釋為成年干細胞的轉分化或可塑性現象存在的證據。然而， 成年組織特異性干細胞的轉分化的概念目前在科學和醫藥界內是廣泛爭議的主題(參見，如，Lemischka (2002) 30 Exp Hematol 848-852 ；Holden & Vogel (2002) 296 Science 2U6-2129)。試圖再生的研究結果表明借助神經干細胞的轉分化是不成功的(Castro et al. (2002)297 Science 1299)。還顯示肌肉組織中發現的造血干/祖細胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al. (2002)99 Proc Natl Acad Sci USA 1341-1346 ；Geiger et al. 100 Blood 721-723 ；Kawada & Ogawa(2001)98 Blood 2008-2013)。此外，借助涉及單獨的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合動物的研究表明循環HPSC和/或它們的子代的轉分化和/或可塑性(如果其確定存在)是極稀有的事件(Wagers et al. (2002)297 Science 2256-2259)。因此，持續存在產生適于多種應用(包括但不限于治療多個器官和/或組織的損傷和/或疾病)的可移植細胞群的新方法的需要。發明概述本概述部分列出了當前披露的主題的幾個實施方式，并且在許多情況下列出了這些實施方式的變體和改變。本概述部分僅是許多和改變的實施方式的示例。提及的給定實施方式的一個或更多個代表性特征同樣是示例性的。這樣的實施方式通常可以伴隨或不伴隨提及的特征而存在；同樣地，那些特征可以應用到當前披露的主題的其它實施方式，不管在本概述部分中是否列出。為了避免過多重復，本概述部分沒有列出或建議這樣的特征的所有可能組合。當前披露的主題提供了用于從非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞或其衍生物的群體形成胚狀體樣球體的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細胞或其衍生物的CD45_細胞群；以及(b)在包含誘導VSEL干細胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個或更多個因子的培養基中培養VSEL干細胞或其衍生物達足以使胚狀體樣球體形成的時間。在一些實施方式中，VSEL干細胞或其衍生物包含⑶34+/lin_/⑶45_或ka-1+/ IirT/⑶45_非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞。在一些實施方式中，VSEL干細胞的直徑約為 3-4 μ m，表達SSEA-I、0ct-4、Rev-l、和Nanog的至少一種，具有由細胞質的窄緣圍繞的大細胞核，并且具有開放型染色質(常染色質)。在一些實施方式中，包含VSEL干細胞或其衍生物的CD45_細胞群從人或從小鼠分離。在一些實施方式中，包含VSEL干細胞或其衍生物的 CD45—細胞群從人或小鼠中選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來源分離。在一些實施方式中，誘導VSEL干細胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個或更多個生長因子包括表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子-2及其組合。在一些實施方式中，通過將VSEL 干細胞或其衍生物與C2C12細胞共培養將所述一個或更多個因子提供給VSEL干細胞或其衍生物。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括通過下述方法分離包含VSEL干細胞或其衍生物的CD45_細胞群，所述方法包括下述步驟(a)提供懷疑包含CD45_干細胞的初始細胞群；(b)將所述初始細胞群與對于CD45特異的第一抗體和對于CD34或特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在初始細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合；(c)選擇為⑶34+或ka-Γ、并且⑶45_的細胞的第一亞群；(d)將所述細胞的第一亞群與對于一個或更多個細胞表面標記物特異的一個或更多個抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合，所述標記物選自 CD45R/B220、Gr-l、TCRa β、TCR γ δ、CDllb 及 Ter-119 ； (e)從所述細胞的第一亞群去除結合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細胞；以及(f)收集為0034+/1^/^045_或 ka-r/lirT/⑶45_的細胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細胞的亞群。在一些實施方式中， 每個抗體包含可檢測的標記。在一些實施方式中，所述可檢測的標記包括熒光標記或者可以通過包含熒光標記的試劑被檢測的部分。在一些實施方式中，所述分離包括FACS分類 (sorting)。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括分離為C-met+、C-kit+、和/或 LIF-R+的那些細胞。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括分離表達選自SSEA-1、 Oct-4、Rex-I及Nanog的一個或更多個基因的那些細胞。在一些實施方式中，細胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、或外周血樣品。在當前披露的主題的一些實施方式中，在用足以將包含VSEL干細胞的⑶45_干細胞從骨髓遷移到受試者的外周血的量的遷移劑處理受試者后，將所述細胞群從受試者的外周血分離。在一些實施方式中，所述遷移劑包括粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4 拮抗劑的至少一種。在一些實施方式中，CXCR4拮抗劑是T140肽。在一些實施方式中，所述受試者是小鼠。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括將干細胞的亞群與結合到CXCR4 的抗體接觸以及從干細胞的亞群分離為CXCR4+的那些細胞。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括分離為CXCR4+和/或AC133+的那些細胞。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括選擇為HLA_DR_、MHCI類_、⑶90_、 ⑶四―、⑶105—、或其組合的那些細胞。當前披露的主題還提供了包含多個非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞的胚狀體樣球體。當前披露的主題還提供了包含本文披露的胚狀體樣球體的細胞培養物。在一些實施方式中，本文披露的胚狀體樣球體在包含誘導VSEL干細胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個或更多個因子的培養基中提供。當前披露的主題還提供了將非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞分化為感興趣的細胞類型的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細胞或其衍生物的胚狀體樣球體；以及(b)在包含分化誘導量的一個或更多個因子的培養基中培養胚狀體樣球體直到培養基中出現感興趣的細胞類型，所述因子誘導VSEL干細胞或其衍生物分化為感興趣的細胞類型。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型是神經元細胞或其衍生物。在一些實施方式中，神經元細胞或其衍生物選自少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經膠質細胞及神經元。在一些實施方式中，所述神經元細胞或其衍生物表達選自GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl及01ig2的標記物。在一些實施方式中，所述培養持續至少約10天。在一些實施方式中，所述培養基包含約10ng/ml rhEGF、約20ng/ml FGF-2及約20ng/ml NGF0 在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為內胚層細胞或其衍生物。在一些實施方式中， 所述培養包括在包含活化素A的第一培養基中培養胚狀體樣球體；以及其后在包含N2補充物-A、B27補充物及約IOmM煙酰胺的第二培養基中培養胚狀體樣球體。在一些實施方式中， 在第一培養基中的培養持續約48小時。在一些實施方式中，在第二培養基中的培養持續至少約12天。在一些實施方式中，內胚層細胞或其衍生物表達選自Nkx6. 1、Pdxl及C-肽的標記物。在一些實施方式中，感興趣的細胞類型為心肌細胞或其衍生物。在一些實施方式中，所述培養持續至少約15天。在一些實施方式中，所述培養基包含堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子及轉化生長因子Dl的組合，數量足以造成胚狀體樣球體細胞的亞組分化為心肌細胞。在一些實施方式中，所述心肌細胞或其衍生物表達選自Nsx2. 5/Csx和 GATA-4的標記物。在當前披露的方法的一些實施方式中，所述胚狀體樣球體通過下述制備(a)提供包含VSEL干細胞的⑶45_細胞群；以及(b)在包含一個或更多個誘導VSEL細胞的胚狀體樣球體形成的因子的培養基中培養VSEL干細胞足以使胚狀體樣球體出現的時間。當前披露的主題還提供了包含在藥學上可接受的載體或賦形劑中的本文披露的分化的非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞的制劑。在一些實施方式中，所述藥學上可接受的載體或賦形劑用于人類中是可接受的。當前披露的主題還提供了用于治療受試者中組織損傷的方法。在一些實施方式中，所述方法包括給予受試者一種組合物，該組合物包含在藥學上可接受的載體中的多個分離的⑶45_干細胞，所述⑶45_干細胞包含VSEL干細胞，數量和經由的途徑足以允許 ⑶45_干細胞群的至少一部分移植入(engraft)所述組織并且在其中分化，由此治療損傷。 在一些實施方式中，所述損傷選自缺血性損傷、心肌梗塞及中風。在一些實施方式中，受試者為哺乳動物。在一些實施方式中，所述哺乳動物選自人類和小鼠。在一些實施方式中， 包含VSEL干細胞的分離的CD45_干細胞從選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來源分
1 O在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括分化分離的⑶45—干細胞以在給予受試者所述組合物之前產生預定的細胞類型。在一些實施方式中，所述預定的細胞類型選自神經細胞、內胚層細胞、心肌細胞及其衍生物。當前披露的主題還提供了用于產生嵌合動物的方法。在一些實施方式中，所述方法包括將一個或更多個包含VSEL干細胞的CD45_干細胞群添加到胚胎，從而一個或更多個 CD45—干細胞發育為胚胎的一個或更多個細胞類型。在一些實施方式中，所述添加包括將一個或更多個CD45—干細胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些實施方式中，所述添加包括聚集(aggregating)包含VSEL干細胞的一個或更多個⑶45_干細胞與桑葚胚期胚胎。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括在加入一個或更多個包含VSEL干細胞的⑶45_干細胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合動物。當前披露的主題還提供了從0045_干細胞群純化非常小的胚胎樣(VSEL)干細胞中感興趣的細胞類型的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細胞的⑶45_干細胞群；(b)鑒定表達VSEL干細胞的標記物的⑶45_干細胞的亞群；以及(c)純化所述亞群。在一些實施方式中，所述群和所述亞群除了為⑶45_外，均為⑶34+/CXCR4+/ 1土11_或^^-171111_。在一些實施方式中，包含VSEL干細胞的CD45_干細胞群從選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來源分離。在一些實施方式中，感興趣的細胞類型選自骨骼肌細胞、腸上皮細胞、胰腺細胞、內皮細胞、表皮細胞、黑色素細胞、神經元細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、胰腺細胞、內皮細胞、上皮細胞、視網膜色素細胞及內胚層細胞。 在一些實施方式中，所述標記物選自GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5, MyoD,成肌蛋白(Myogenin)、Nsx2. 5/Csx、GATA-4、甲胎蛋白(α -Fetoprotein)、CK19、 Nkx2-3、Tcf4、Nkx 6. l、Pdxl、VE-鈣粘蛋白、Krt 2-5,Krt 2_6a、BNC、DCT、TYR 及 TRP。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為心肌細胞，所述標記物選自Nkx2. 5/Csx、GATA-4、 MEF2C。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為內皮細胞，所述標記物選自VEGFR2、 VE-鈣粘蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor)及TIE2。在一些實施方式中， 所述感興趣的細胞類型為骨骼肌細胞，所述標記物選自Myf5、MyoD及成肌蛋白。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為肝細胞，所述標記物選自甲胎蛋白和CK19。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為神經細胞，所述標記物選自β III微管蛋白、Oligl、 01ig2、GFAP及巢蛋白。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為胰腺細胞，所述標記物選自Nkx6. 1和Pdxl。在一些實施方式中，所述感興趣的細胞類型為黑色素細胞，所述標記物選自DCT、TYR及TRP。當前披露的主題還提供了用于鑒定胚狀體樣球體形成的誘導劑的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)從已知包含誘導劑的細胞制備包含多個cDNA克隆的cDNA文庫；(b)用所述cDNA文庫轉化不包含所述誘導劑的多個細胞；(c)在足以造成VSEL干細胞或其衍生物形成胚狀體樣球體的條件下，在轉化的多個細胞存在下，培養多個VSEL干細胞或其衍生物；(d)分離包含所述誘導劑的轉化的細胞；(e)從轉化的細胞回收cDNA克隆；以及(f)鑒定由回收的cDNA克隆編碼的多肽，由此鑒定胚狀體樣球體形成的誘導劑。在一些實施方式中，已知包括誘導劑的細胞為C2C12細胞。在一些實施方式中，多個cDNA克隆包含位于克隆載體(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位點的至少一側的側翼的至少一個引物結合位點。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括利用雜交到位于cDNA克隆位點的兩側的側翼的引物位點的引物擴增轉化的細胞中存在的cDNA克隆。在一些實施方式中，所述鑒定是通過對cDNA克隆的測序。當前披露的主題還提供了從臍帶血或其部分(fraction)分離包含VSEL干細胞的CD45—干細胞的亞群的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)將臍帶血或其部分與對于CD45特異的第一抗體和對于CD34或特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合；(b)選擇為CD34+或 ka-Γ、并且為⑶45—的細胞的第一亞群；(c)將細胞的第一亞群與對于選自⑶45R/B220、 Gr-U TCRa β , TCR γ δ、⑶lib及Ter_119的一個或更多個細胞表面標記物特異的一個或更多個抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細胞群的每個細胞上的靶標(如果存在)結合；(d)從細胞的第一亞群去除結合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細胞；以及(e)收集為⑶34+/lin7⑶45_或ka-l+/lin7⑶45_的細胞的第二亞群，由此分離包含 VSEL干細胞的⑶45_干細胞的亞群。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括在低滲溶液中孵育臍帶血或其部分或所述任何亞群達到足以基本上裂解可能存在的所有紅細胞(erythocyte)的時間。在一些實施方式中，當前披露的方法進一步包括分離對于CXCR4、 c-met、c-kit、或LIF-R的至少一種為陽性的那些細胞。因此，當前披露的主題的一個目的是提供新的干細胞群，以及制備和應用其的方法。這個目的和其它目的全部或部分通過當前披露的主題實現。
當前披露的主題的一個目的已經在上面陳述，其他目的將隨著描述的繼續以及結合下述實施例和附圖而變得顯而易見。根據一些實施方式，提供了源自人類的成人(adult)器官或組織細胞的非常小的胚胎樣干細胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過就 ⑶133+CXCR4+⑶34+LirTCD45-細胞來選擇細胞以獲得靶(target) VSEL的富集群體。在一些實施方式中，所述VSEL源自血液(例如，臍帶血、外周血)。所述靶VSEL是Oct-4+、Nanog+ 和/或SSEA+。在一些實施方式中，所述靶VSEL在細胞核中表達Oct-4蛋白，并且在表面上表達SSEA抗原。在一些實施方式中，所述靶VSEL表達選自下列的原始生殖細胞(PGC)標志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。 在一些實施方式中，可以通過就大小為2至6μπι或大小為2至4μπι的細胞進行選擇而富集VSEL的富集群體。可以通過就含有原始的非結構化的(primitive unorganized)常染色質的細胞進行選擇而富集VSEL的群體。優選地，在VSEL的富集群體中，至少25% (例如 30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% )的細胞是革巴VSEL。根據一些實施方式，提供了產生細胞群體的方法，所述細胞群體就來自人類血液(例如，臍帶血、外周血)的靶非常小的胚胎樣干細胞(VSEL)進行了富集，包括裂解 (Iysing)血液以除掉紅細胞和制備LinTD45_CD133+細胞的富集群體。根據一些實施方式，提供了產生細胞群體的方法，所述細胞群體就來自人類血液 (例如，臍帶血、外周血)的靶非常小的胚胎樣干細胞(VSEL)進行了富集，包括i)裂解血液以除掉紅細胞；ii)制備⑶133+細胞的富集群體；和iii)制備LinTD45_CD133+的富集群體。可以通過使用免疫磁珠就CD133+細胞富集VSEL的群體。可以通過熒光激活的細胞分選就LinTD45_CD133+細胞富集VSEL的群體。在一些實施方式中，可以在低滲的氯化銨溶液中裂解血液以除掉紅細胞。


圖IA 和 IB 描繪了 Sca-l+/lin7CD45-和 Sca-l+/lin7CD45+ 細胞的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。圖IA顯示ka-r/lirT/⑶45_細胞較小并且測量的直徑為3_4 μ m。它們具有由細胞質的窄緣圍繞的較大細胞核。在超微水平上，細胞質的窄緣具有一些線粒體、分散的核糖體、內質網的小輪廓、以及一些囊泡。細胞核被包含在具有核孔的核膜內。染色質松散地壓縮并由常染色質構成。圖IB顯示與之相反，Sca-Γ/lirT/⑶45+細胞表現為異源形態并且較大。它們的平均測量直徑為8-10 μ m，并具有分散的染色質和突出的核仁。圖2描繪了熒光顯微圖像，描繪了對^^-171化7⑶45_細胞的表達研究的結果并表明Sca-l+/lin7CD45_細胞是SSEA-Γ并表達0ct_4和Nanog。如左側所示，通過FACS分離的ka-l7lin_/CD45_細胞被評估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表達。所有的圖像在Plan Apo 60XA/1. 40 油性物鏡(Nikon，Japan)下采集。右側示出了在 ADOBE PHOTOSHOP CS 軟件(Adobe System Incorporated, San Jose, California, United States of America) 中進行的代表性細胞(箭頭)的IOx放大的圖像。陰性染色對照未示出。對從四個獨立類別分離的細胞進行染色。示出了代表性數據。
圖3A-3C 描繪了對 ka-l+/lin7CD45-的 CXCR4、c-met 和 LIF-R 的表達研究的結果圖3A描繪了 RT-PCR產物在其上分離并用溴化乙錠染色的凝膠的圖像，并描繪了 Sca-l7lin7CD45"中對于 CXCR4 (泳道(lane) 1)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的 mRNA 的表達結果。RT-PCR進行30個循環。陰性RT-PCR反應(DNA代替cDNA 泳道2、4和6)。 示出了來自三個獨立的類別的代表性結果。圖:3B描繪了通過FACS分離并通過免疫組織化學染色評估CXCR4、c-Met和LIF-R的表達的ka-r/lirT/⑶45_細胞的熒光顯微圖像(在 Plan Apo 60XA/1. 40油性物鏡(Nikon, Japan)下采集圖像)。未示出陰性染色對照。示出了來自四個獨立的實驗的代表性結果。圖3C是描繪了通過包含SDF-I或不包含SDF-I (陰性對照)的MATRIGEL 滴狀物的ka-l+/lin7⑶45—細胞的化學引誘研究結果。示出了每 100 μ m的MATRIGEL 滴狀物周長的化學引誘的ka-l+/lin7⑶45—細胞的數量。從三個獨立的實驗收集數據。*與對照MATRIGEL 相比ρ < 0. 00001。圖4Α和4Β描繪了 FACS分類從不同年齡的動物分離的ka-l+/lin7CD45_細胞的結果。圖4A是從源自3周大(上側)和1歲大的小鼠(下側)的BMMNC分類的細胞的 FACS點圖。左側描繪了鼠BMMNC的點圖。作為ka-Γ/Ιin_ (中側)的來自淋巴門(lymphoid gate)的細胞通過對于CD45表達的FACS進行分類(右側)。進行三個獨立的分類實驗(對于每類8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性類別。圖4B是條形圖，描繪了在通過FACS 分離來自3周大和1歲大的小鼠的ka-r/lin7⑶45_細胞中PSC和VSEL干細胞標記物的 mRNA的表達，并通過相同數量的分類細胞之間的RQ-PCR進行比較。進行四個獨立的分類實驗(對于每類收集8只小鼠的BM)。數據是平均數士SD。*p<0.01 vs.來自年老動物的細胞。圖5是條形圖，描繪了來自具有相對長的生命期的小鼠品系(C57BL/6)的細胞數量與具有相對短的生命期的小鼠品系(DBA/2J)的細胞數量的比較結果。所述圖示出了與 C57BL/6小鼠相比，DBAAJ小鼠中ka-l+/lin7CD45_細胞的數量減少。通過相同數量的分類細胞之間的RQ-PCR比較通過FACS從三周大DBA/2J和C57BL/6小鼠分離的ka-l+/lin7 ⑶45—細胞中PSC和VSEL干細胞標記物的mRNA的表達。進行三個獨立的分類實驗(對于每類6只小鼠的BM被收集)。數據是平均數士 SD。*p<0.01vs.來自年老DBA/2J小鼠的細胞。圖6A和6B描繪了骨髓單核細胞(BMMNC)的側群(SP)的分類。圖6A是描繪BMMNC的SP的FACS分類的點圖。圖6B是條形圖，描繪了通過FACS 從 3 周大的小鼠分離的 BMMNC、SP、SP Sca-l+/lin7CD45\ SP Sca-Γ/1 irT/CD45+、Sca-1+/ lin_/CD45_和Sca-Γ/1 in7CD45+細胞中的PSC和VSEL干細胞標記物的mRNA的表達，并通過相同數量的分類細胞之間的RQ-PCR進行比較。進行三個獨立的分類實驗(對于每類，8 只小鼠的BM被收集)。數據以平均數士 SD表示。、<0.01 vs.來自年老動物的細胞。圖7是四個點圖，描繪了細胞的多個亞群的移植結果和這些細胞對長期血細胞生成的貢獻。Sca-r/lin7⑶45—細胞對長期血細胞生成沒有貢獻。Ly5. 2小鼠被移植以來自 Ly5. 1 小鼠的 IO4 個 Sca-l+/lin7CD45+或 2X104 個 Sca-l+/lin7CD45-細胞，并且與 IO6 個 BMMNC Ly5. 2細胞一起移植入Ly5. 2受體小鼠，在移植后8個月通過FACS評估Ly5. 1細胞的存在。上側描繪了來自外周血的MNC的分析。下側描繪了來自骨髓的MNC的分析。示出了代表性結果。圖8A和8B描繪了熒光顯微圖像，描繪了具有對于SSEA-I (圖8A ;4個圖板)或 0ct-4(圖8B)特異的抗體的ka-l7lin_/CD45_BM細胞的ES樣球體的染色。圖9A和9B描繪了在C2C12細胞上的GFP、ca-l+/lin7CD45-BM細胞的胚狀體樣球體的形成。圖9A描繪了在實施例20所述的條件下，共培養^^-171^1_/⑶45_BM細胞與 C2C12細胞后胚狀體(EB)-樣球體的顯微圖像。圖9B是描繪ka-l+/lin7⑶45_細胞中綠色熒光蛋白(GFP)表達的熒光顯微圖像，表明這些胚狀體源自從綠色免疫熒光陽性(GFP+) 小鼠(購自 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, United States of Americ 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) lOsb/J 小鼠)分離的純化 ka-l+/lin7CD45TM 細胞，并且不是 C2C12細胞。圖10是從鼠淋巴結分離的碘化丙啶(propidium iodide)染色的細胞、HSC(造血干細胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干細胞(Sca-l7lin_/CD45_)的一系列點圖。圖11A-11G是鼠骨髓細胞的FACS分析的系列點圖。圖IlA是低滲裂解后鼠骨髓MNC的點圖。圖IlB是示出了來自Rl門(R1 gate) 用于譜系標記物表達和⑶45抗原的細胞的染色的點圖。在這個圖中，R2示出了譜系-和 CD45陰性BM MNC0分析來自Rl和R2的細胞的Sca-I的表達和HLA_DR(參見圖11C)、MHC I類(參見圖11D)、^四(參見圖11E)、⑶90(參見圖11F)及⑶105(參見圖11G)抗原的
共表達。圖12是來自VSEL干細胞衍生的球體(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的細胞的系列點圖。示出了三個獨立的代表性實施例。圖13描繪了對從D3胚胎干細胞(ED-D3 ；頂側)形成的胚狀體和從VSEL干細胞 (底側)形成的胚狀體樣球體進行堿性磷酸酶(AP)染色的圖。圖14描繪了熒光顯微圖像，表明VSEL干細胞衍生的胚狀體樣球體表達早期胚胎發育標記物如 SSEA-I、GATA-6、GATA-4、F0XD1 及 Nanog。圖15描繪了在VSEL干細胞衍生的胚狀體樣球體中存在的細胞的透射電子顯微鏡圖，表明這些細胞在尺寸上大于它們來源的初始VSEL干細胞(圖15，上側)，但仍具有非常原始的包含常染色質的細胞核。圖15的中側描繪了在用SDF-I、HGF/SF及LIF刺激從VSEL 干細胞-衍生的胚狀體樣球體分離的細胞后MAPKp42/44的磷酸化研究結果，表明相應的受體(分別為SDF-1、HGF/SF及LIF)在這些細胞的表面表達。并且最后，圖15的下側描繪了從來自VSEL干細胞衍生的胚狀體樣球體的細胞的連續傳代分離的細胞的RT-PCR分析結果，其揭示了調節胚狀體的原腸胚形成的基因GnGATA-6、CdX2、SOX2、HNF3&AFP) WmRNA 的表達增加。圖16A-16C和圖17A-17D描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為少突膠質細胞(圖16A-16C)或神經元(圖17A-17D)。細胞用針對巢蛋白的抗體染色，其利用 Alexa Fluor 594-標記的山羊抗-小鼠IgG第二抗體檢測，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋白Alexa Fluor 488結合物檢測細胞中存在的GFP (綠色熒光)，并且細胞核用DAPI 染色(藍色熒光)。
圖18A-18C描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為表達胰腺細胞的標記物(C-肽)的內胚層細胞。圖19A-19C和20A-20D描繪了熒光顯微圖像，描繪了 ES樣球體分化為心肌細胞。 這些細胞表達綠色熒光蛋白(GFP)，表明心肌細胞源于由GFP+Sca-Γ/lirT/⑶45—BM細胞形成的胚狀體。細胞用針對肌鈣蛋白I或α橫紋肌輔肌動蛋白的抗體染色(分別為圖19和 20)，其利用Alexa Fluor 594-結合的第二抗體檢測，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋白Alexa Fluor 488結合物檢測細胞中存在的GFP (綠色熒光)，細胞核用DAPI染色(藍色熒光)。圖21A-21C描繪了對來自單VSEL干細胞衍生的球體的細胞進行RT-PCR的結果， 其表明這些細胞可以分化為心肌細胞(中胚層；參見圖21Α)、神經細胞和少突膠質細胞 (外胚層；參見圖21Β)及胰腺或肝細胞(內胚層；參見圖21C)。圖22Α-22Ι描繪了表明培養的細胞中心臟-特異性抗原的表達的免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡照片。圖22A-22C和22D-22F描繪了其中Sca-l+/lin7CD45TMMNC被培養的培養板的圖像。具有ka-r/lin7⑶45—細胞的板中的許多細胞對于心臟-特異的肌球蛋白重鏈是陽性的(圖22B、22C、22E及22F;綠色熒光)。這些心臟-特異性肌球蛋白重鏈-陽性的細胞中的許多對于心臟肌鈣蛋白I也是陽性的(圖22D和22F[箭頭]；紅色熒光)。圖22G-22I 是其中Sca-r/lirT/⑶45+細胞被培養的培養板的圖像。這些細胞對于前述心臟-特異性抗原的表達基本上是陰性的(參見圖22H)。通過DAPI染色鑒定圖22A-22I中的每個的細胞核(藍色熒光)。比例尺=20 μ m。圖23描繪了 ka-r/lin7⑶45_細胞的FACS分類結果，表明能夠被分類的這些細胞的產量隨著供體動物的年齡而降低。圖M是描繪作為年齡的函數的小鼠骨髓中存在的VSEL干細胞(左側)和HSC (右側)的百分數的兩幅圖。圖25是兩幅圖，描繪了從較老的小鼠分離的VSEL干細胞形成胚狀體樣球體的能力下降(左側)以及根據小鼠(細胞從其分離)的年齡的VSEL干細胞的培養物中CD45+細胞的百分數增加(右側)。圖沈為從5周大的小鼠(左側)與2.5歲大的小鼠(右側)分離的VSEL干細胞的不同表達模式。在左側中，示出了免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡圖像，表明來自5周大的小鼠的培養的細胞中不同造血抗原的表達。在右側中，示出了在從2. 5歲大的小鼠分離的 VSEL干細胞中，CD45被表達并且所述細胞能夠在甲基纖維素培養基中的第二培養基中生長造血集落。圖27A-27B描繪了人類臍帶血的FACS分類結果。圖 27A 示出了 人類 CB 包含表達 CXCR4 (0. 037 士 0. 02 %，η = 9)、 CD34(0. 118士0. 028%,η = 5)及 CD133(0. 018士0. 008%,η = 5)的 lin7CD4511NC 群。圖 27B 表明這些 CXCR47CD133+/CD;M7lin7CD45-細胞非常小(約 3-5 μ m ；圖 27B，上側)，而 CB-來源的lin7CD45+造血細胞較大(> 6 μ m ；圖27B,下側)。圖^A_28C描繪了對來自人類臍帶血的分類的細胞的基因表達研究結果。圖28A和286是條形圖，顯示通過FACS分類的CB-來源的CXCR4+/CD133+/0^4+/lin7CD45"細胞、以及 C)(CR47lin7CD45\CD347lin7CD45\ 以及 CD133+/lin7CD457 細胞高度富集由多能胚胎細胞表達的轉錄因子如Oct-4和Nanog的mRNA。圖28C示出了確認 FACS分析的RT-PCR結果。圖四描繪了 CB-VSEL干細胞的免疫熒光染色結果，表明高度純化的CB-來源的 CXCR4+/lin_/CD45_細胞在它們的表面上表達SSEA-4并且在細胞核內表達0ct_4和Nanog 轉錄因子。圖30描繪了三種不同的CB-VSEL干細胞的光學顯微圖片，表明這些細胞非常小 3-5 μ m,并包含相對大的細胞核和具有許多線粒體的細胞質的窄緣。這些細胞的細胞核中的DNA包含作為多能胚胎干細胞的特征的開放型常染色質。圖31A-31C描繪了光學顯微圖片，表明來源于GFP+小鼠的VSEL干細胞-DS如果被平鋪在補充有IL-3+GM-CSF的甲基纖維素培養基中可以形成小的第二球體(圖31A和 31B)。通過從初始甲基纖維素培養基的甲基纖維素溶解回收的這些第二球體制備的單細胞懸浮液，如果再次平鋪在甲基纖維素培養基(圖31B)或血漿凝塊(圖31C)中并由IL-3和 GM-CSF刺激，形成造血集落。這些為造血集落的證據通過FACS分析來自甲基纖維素中生長的溶解集落的細胞的CD45表達或通過免疫熒光染色來自血漿凝塊培養基中生長的集落的細胞的⑶45而獲得。圖32是用于從人類臍帶血分離VSEL干細胞的基于FACS的策略的略圖。圖33.流式細胞術分離源自骨髓的ka-l+/Lin-/CD45+造血干細胞和
Lin-/⑶45-VSEL。代表性的點圖顯示了來自淋巴門(A)(基于Sca-I (FITC)和譜系標記物 (PE) (C)以及⑶45 (APC)的表達)的小細胞的分類。圖板D顯示了區域3(R3)含有 Lin-/CD45-VSEL而區域4(R4)含有ka_l+/lin-/CD45+細胞。通過將BMC的分類與具有已知直徑的珠子的分類作比較，圖板B中的FSC軸確認了圖板A中的感興趣區域中的細胞的非常小的尺寸(2-10μ)。如(R3)所示，總BMC中只有0.02%是VSEL。FSC，前向分散特征；SSC，側向分散特征。圖34.心肌梗塞尺寸。從小組I-III中的Masson三色染色心臟檢測的心機梗塞面積分數([梗塞面積/LV面積]xlOO)，三個小組分別經載體、⑶45+造血干細胞和VSEL處理。〇，個體小鼠； ，平均數士 SEM。圖35.超聲心動描記術檢測LV的功能。冠狀動脈閉塞/重灌注后35天以載體處理(Α、B)、CD45+細胞處理(C、D)和VSEL處理(Ε、F)的小鼠的代表性的二維(Α、C、Ε)和 M-模式(B、D、F)圖像。箭頭代表梗塞壁(A、C、E)。與載體處理和⑶45+細胞處理的心臟相比，VSEL處理的心臟顯示出較小的LV腔，較厚的梗塞壁和改善的梗塞壁運動。圖板G-J證明VSEL的移植改善了 MI之后35天LV心臟收縮功能的超聲心動描記術檢測。數據為平均數 士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 組。*Ρ < 0. 05 vs.第；35 天時的小組 II ;#P < 0. 05 vs.第 35天時的小組I ； §P < 0. 05 vs.各個小組在96小時之時的數值。圖36. LV重塑的形態測量學檢測。來自于載體處理(A)、⑶45+造血干細胞處理 ⑶和VSEL處理(C)的心臟的代表性Masson三色染色心肌部分。分別以藍色和紅色鑒別出結痂組織和有活力的(viable)心肌層。注意在VSEL處理的心臟中LV腔較小，梗塞壁較厚。圖板D-H顯示了 LV結構參數的形態測量學檢測。數據為平均數士SEM。η = 11-14 只小鼠/組。< 0. 05 vs.小組II。
圖37.心肌細胞和左心室肥大的檢測。圖板A-C顯示了來自Masson三色染色的經載體處理(A)、⑶45+造血干細胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的有活力的心肌層中的心肌細胞的代表性圖像。比例尺=50pm。與⑶45+造血干細胞處理的心臟不同，VSEL處理的心臟未顯示出增加的肌細胞剖面面積(與非梗塞對照心臟(D)相比)。超聲心動描記術估計的LV質量在VSEL處理的心臟(E)中顯著較低。數據為平均數士SEM。η = 11-14 只小鼠 / 組。D 乍 < 0. 05 vs.小組 II ;#P < 0. 05 vs.對照；E :*P < 0. 05 vs.小組 II 和 IIK最終的);#P < 0. 05 vs各個基線值。圖38. VSEL移植和心肌細胞再生。通過EGFP (B、D，綠色)和α -橫紋肌 (sarcomeric)輔肌動蛋白(C、D，紅色)分別鑒別VSEL和肌細胞；圖板D顯示了合并區域。 顯示了對EGFP(箭頭，B，綠色)和α-橫紋肌輔肌動蛋白(箭頭，C，紅色)均為陽性的兩個肌細胞。細胞核以DAPI染色(A、D，藍色)。比例尺=40μπι。圖39.梗塞區域中的肌細胞面積分數的測定。圖板A-C顯示了 Masson三色染色的經載體處理(A)、⑶45+造血干細胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的結痂的代表性例子。放大倍率x600。圖板D中顯示了定量數據。數據為平均數士 SEM。η= 11-14只小鼠 / 組。D:*P<0. 05 vs.小組 II。圖40.外周血(PB)中循環的VSEL的流式細胞術分析。在急性MI之后M小時、 48小時和7天；在假性手術(假性對照)之后M小時；以及從未經處理的小鼠(對照)，收集PB樣品。使用ka-Ι、譜系標記物和⑶45將PB白細胞(PBL)的全部群體染色。在點圖中顯示PBL，代表它們的前向(FSC)vs.側向分散特征(SSC)，分別與細胞內容物的大小和粒度/復雜度相關。區域Rl(圖板A)中包括了無粒的、小的(大小為2-10μπι)事件，其包括 VSEL群體。進一步分析來自區域Rl的細胞的Sca-I和譜系標記物(Lin)的表達，在區域 R2(圖板B)中只包括^^-1+/1^11事件。然后基于⑶45的表達分析來自區域R2的細胞，將 ⑶45-和⑶45+亞群體顯示于柱狀圖(圖板C，分別為區域R3和R4)。百分率顯示了每個亞群體在總PBL中所占的平均含量。根據FSC，圖板D分別顯示了區域R5和R6中Sca-I+/ Lin-/CD45-細胞(VSEL)和ka_l+/Lin-/CD45+細胞(HSC)的大小。紅色圓圈代表每個亞群體中細胞的主要定位。圖41.急性MI之后VSEL運動的時間過程。顯示了 MI之后M小時、48小時和7 天，未處理的(對照)、假性操作(假性對照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環的Sca-I+/ Lin-/⑶45-VSEL的絕對數目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數據。 絕對數目是基于VSEL占外周血中PBL和總白細胞計數的百分含量計算的。數據為平均數 + SEM0 ，平均數；〇，個體小鼠；*P < 0. 0025 vs.對照以及假性對照。圖42.急性MI之后HSC運動的時間過程。圖形顯示了 MI之后M小時、48小時和 7天，未處理的(對照)、假性操作(假性對照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環的Sca-I+/ Lin-/⑶45+HSC的絕對數目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數據。絕對數目是基于HSC占PBL和總白細胞計數的百分含量計算的。數據為平均數士 SEM。眷，平均數；〇，個體小鼠；乍< 0.0025 vs.各個年齡小組中的對照以及假性對照。圖43.來自急性MI之后的6周齡和15周齡小鼠(分別為圖板A和B)的源自外周血的細胞中多能標記物(Oct-4、Nanog、Rexl、Rifl、Dppal)和造血干細胞標記物Gcl) 的mRNA水平。將從每個實驗小組的動物血液中收集的細胞匯集在一起以獲得每個時間點的平均mRNA含量。對于所有的樣品進行一式三份qRT-PCR。將mRNA含量的倍數增加與對照進行比較。基于三次反應計算平均值。數據顯示為平均數士SEM。PSC，多能干細胞。圖44.源自外周血(PB)的VSEL中的0ct_4的表達。MI之后M小時從PB分離的運動的VSEL(下端圖板)和HSC(上端圖板)的代表性的共焦顯微鏡圖像。通過FACS分離ka-l+/Lin-/CD45-VSEL和ka_l+/Lin-/CD45+HSC然后進行免疫染色。上端圖板顯示了 ka-l+/Lin-/CD45+細胞(HSC)，其對于CD45 (FITC，綠色熒光，造血細胞標記物)是陽性的，對于0ct-4(TRITC，紅色熒光)是陰性的。下端圖板顯示了 ka-l+/Lin-/CD45-細胞 (VSEL)，其對于CD45是陰性的，對于0ct-4(多能細胞標記物)是陽性的。細胞核以DAPI 染色(藍色熒光)。Tr，透射圖像。圖45.實驗方案。使用了三組WT小鼠(小組I-III，n = 11-14/組)。在基線超聲波心動描記術四天之后，小鼠進行30分鐘的冠狀動脈閉塞，然后進行重灌注。MI之后48 小時，小鼠接受心肌內注射載體(小組I)、ka-l+/Lin-/⑶45+造血干細胞(小組II)或 ka-l+/Lin-/CD45-VSEL(小組III)。在細胞移植后48小時和MI之后35天重復超聲波心動描記術。在MI之后35天，處死小鼠以進行形態測量學和組織學研究。圖46. LV重塑的超聲心動描記術檢測。圖板A和B顯示了 LV尺寸的超聲心動描記術測量。數據為平均數士SEM。η = 11-14只小鼠/組。圖47.心肌毛細血管密度的定量測定。梗塞邊界區域(A)和非缺血區域(B)中的心肌毛細血管密度。在載體處理的、⑶45+造血干細胞處理的和VSEL處理的心臟之間沒有顯著性差異。數據為平均數士 SEM。η= 11-14只小鼠/組。圖48Α-Β.圖板A-除掉RBC以獲得TNC或麗C成分(fraction)的實驗程序。通過FACS (熒光激活的細胞分選)對CB-VSEL進行計數。圖板B-代表性的設門策略，以對 CB-VSEL和造血干細胞(HSC)進行流式細胞術分析和FACS分選。百分率顯示了兩種細胞成分中的CB-VSEL和HSC的平均含量(平均值士SEM)。圖49.通過ImageMream系統獲得的源自CB的VSEL和HSC的圖像。每幅照片顯示了細胞的亮視野圖像，以7-氨基放線菌素D(7-AAD)染色后的細胞核圖像，以及與下列表面標志物的表達相關的圖像:Lin (綠色)、⑶45(橙色)和CD133(AC133 ；黃色)。比例尺表示 10 μ m。圖50A-B.圖板A-相對于新鮮的CB樣品，以兩種RBC消除程序進行分離之后，從1 毫升CB獲得的總細胞數目。圖板B-可以從分離自1毫升CB的TNC (RBC裂解后)和MNC (以 Ficoll-Paque分離后)獲得的CB-VSEL和HSC的絕對數目。數值顯示為平均值士SEM(P < 0. 05 ；N = 5)。圖51.通過ImageMream系統獲得的CB-VSEL和HCS的形態學特征，包括大小和 N/C比率。細胞的大小計算為基于細胞的亮視野圖像的較短細胞軸的長度，N/C比率顯示為細胞質和細胞核面積之比，它們分別是基于亮視野和細胞核圖像計算的。數字表示每個參數的平均值(平均值士SEM)。圖52A-B.圖板A和B顯示了從CB單元(通過用于儲存的常規程序制備并在其解凍之后)回收的CB-VSEL和HSC。數值表示從處理1毫升CB獲得的兩個群體的平均絕對數目(xl03)(平均值士SEM;N= 5 ；當與新鮮CB比較時，P <0.05)。置于柱形圖內的百分率是存在于最初的新鮮CB樣品中的CB-VSEL和HSC的最初數目的回收百分率。
圖53A-D.圖板A-D顯示了 CD133+/Lin7CD45TB_VSEL的原始亞群的百分含量和形態學特征，所述亞群的特征在于共表達⑶34、Oct-4和SSEA-4抗原。數值表示通過 ImageStream系統從10次獨立實驗計算的平均數(平均值士SEM)。圖由Imag必tream系統獲得的CB-VSEL亞群的代表性圖像。每幅照片顯示了細胞的亮視野圖像，以7-AAD染色后的細胞核圖像，以及表面和核內標志物的表達。比例尺表示10 μ m。圖55A-C. Annexin V (AnV)在CB-VSEL和HSC上的結合，這是由于RBC裂解過程中釋放的微囊泡轉移磷脂酰絲氨酸。圖板A-在RBC裂解之前和之后，CB-VSEL和HSC中的 AnV+細胞的含量。圖板B-在RBC裂解之前和之后，AnV+細胞成分中血型糖蛋白A+ (GlyA+) 細胞的含量。圖板C-RBC裂解之后分選的⑶34+/AnV+/GlyA+的純化的成分的集落生成潛力與通過FicolI-Paque分離的⑶34+細胞的對比。數字代表平均值(平均值士 SEM)。圖56A-G.通過FACS分選源自人類UCB衍生的VSEL的設門策略。通過FACS從人類UCB有核細胞(UCB-nucleated cells)的總成分(TNC)中分離UCB-VSEL。圖板A 標準直徑為1、2、4、6、10和15 μ m的預先確定大小的珠子顆粒。區域R2包括直徑介于2 μ m的所有物體。圖板B:通過顯示FSC vs. SSC信號的點圖顯示源自UCB的TNC。圖板C和D 來自區域Rl的細胞，分別就造血Lin標志物表達以及它們的存活性(通過7-AAD)對其進行分析。圖板E 基于⑶34和⑶45抗原表達顯示源自包括區域R2和R3的門的LirT存活事件。 包括并從區域R4分選CD133+/Lin7CD45XB-VSEL的群體。圖板F 新鮮分選的UCB-VSEL的純度和存活性分析。圖板G 固定并以7-AAD重新染色細胞之后，分選的UCB-VSEL成分中的有核細胞的含量分析。在區域R6中顯示了 7-AAD+有核的UCB-VSEL。百分率顯示了總 UCB-有核細胞中指明的細胞亞群的平均含量。圖57A-D.通過ISS獲得的UCB-VSEL和HSPC的代表性圖像。圖中顯示了 UCB-VSEL 及其造血對應物的形態學特征的比較，包括它們的大小和標志物表達。圖板A 用作大小標志物的預先確定大小的珠子的亮視野圖像。圖板B、C和D分別是表達⑶34、⑶133+和 CXCR4抗原的UCB-VSEL和HSPC的多通道圖像。每幅照片顯示了細胞的亮視野圖像，與指明的表面標志物的表達相關的熒光圖像，以及以7-AAD染色后的細胞核圖像。在每個圖板中， 造血Lin標志物和CD45的表達分別顯示為綠色(Lin ；FITC)和橙色(PE)，而⑶34、CD133 或CXCR4的表達顯示為黃色(PE-C0)。所有的圖像均以相同的放大倍數顯示。比例尺表示ΙΟμπι。數值反映了每個群體的平均大小(平均值士 SEM)，其由IDEAS軟件根據較短的細胞軸的長度計算。圖58A-F. UCB-VSEL的原始亞群的含量和形態學的ISS分析。圖板A-D顯示了 ISS 中UCB-VSEL的含量的分析。在分析之前將細胞固定并以7-AAD染色。圖板A 根據形態學參數(包括細胞核的面積和亮視野的長寬比)顯示所分析的物體。基于亮視野計算長寬比， 其為較短的細胞軸(寬度)與較長的軸(高度)之比。圓的、非長形的細胞具有接近1.0 的長寬比，而長形的細胞或細胞塊(clumps)具有較低的長寬比。包括了圓的、含有DNA的單個細胞以進行進一步分析(區域Rl)。圖板B 基于CD45和造血Lin標志物的表達在直方圖中顯示來自區域Rl的物體。在區域R2中包括LirT/⑶45_的物體。圖板C:根據0ct_4 的核內表達和⑶133抗原的表面表達分析來自區域R2的非造血成分。在區域R3中包括了具有兩種標志物的共表達的物體，其代表UCB-VSEL含量。圖板D 根據由IDEAS軟件計算的大小(計算為較短的細胞軸的長度)顯示來自區域R3的UCB-VSEL。在點圖中標出了 UCB-VSEL中的小于6和8 μ m的細胞的平均含量。所有圖板上的百分率表示每個區域中指明的成分占總UCB細胞的含量(平均值士 SEM)。圖板E-F 表格和圖形顯示了 UCB-VSEL亞群(根據表面存在CD34和SSEA-4抗原以及0ct_4的細胞核表達來區分)的含量和形態學特征，例如大小、N/C比率和小于6μπι的細胞的含量。平均值表示為平均值士SEM。代表性圖像顯示了共表達⑶133和Oct-4抗原的細胞。圖59A-E. RBC裂解和在Ficoll-Paque上離心后獲得的細胞成分中的UCB-VSEL和 HSPC回收和基因表達的分析。圖板A-B分別是以IxBD WmrmLyse緩沖液裂解RBC后獲得的TNC成分和Ficoll-Paque分離后獲得的MNC的成分中UCB-VSEL的含量分析。兩個細胞成分均就Lin標志物(FITC)、⑶45 (PE)以及原始SC的標志物之一，例如⑶34、⑶133 或CXCR4(APC)進行染色。圖板A和B顯示了根據CD45和指明的原始細胞標志物的表達而源自兩種細胞成分的Lin-細胞。區域R5中顯示了 UCB-VSEL，區域R4中顯示了其造血對應物。百分率表示每個成分的細胞中的亞群的平均含量(平均值士SEM)。圖板C-D:通過在低滲溶液中裂解RBC或通過在Ficoll-Paque梯度上離心而從1毫升UCB中分離的 UCB-VSEL和HSPC的絕對數目。數值表示來自5次獨立實驗的平均數(平均值士 SEM)。相對于在裂解RBC后獲得的TNC，P < 0. 05被認為是統計學上顯著的(#)。圖板E 裂解RBC 和在Ficoll-Paque上離心后分別獲得的TNC和MNC成分中與多能性相關的基因(0ct_4和 Nanog)和與組織定向相關的基因(Nkx2. 5/Csx、GATA-4和VE-鈣粘蛋白)的表達。數據顯示為所分析的成分與總CB細胞之間的平均(平均值士SEM)倍數差異。與總的未純化的 UCB細胞相比，P < 0. 05被認為是統計學上顯著的O。圖60A-B.以用于臨床應用的AXP AutoXpress平臺處理UCB單元之后的 UCB-VSEL和HSPC的回收。圖板A 可以從1毫升UCB中回收的總的⑶34+細胞以及具有 ⑶34表達的UCB-VSEL和HSPC的絕對數目。在下列新鮮的和經處理的UCB樣品中分析回收情況i)完全未經處理的UCB (灰色條柱)；ii)體積耗竭(volume depletion)之后獲得的 UCB的新鮮濃縮物(黑色條柱)；和iii)經歷冷凍/解凍程序之后的UCB的濃縮物(陰影條柱)。平均值表示為平均值士 SEM。與完全未經處理的UCB相比，P<0. 05被認為是統計學上顯著的O。圖板B:在每個UCB處理步驟中從1毫升UCB中回收的表達⑶133抗原的 HSPC的絕對數目的類似分析。平均值表示為平均值士SEM。與完全未經處理的UCB相比， P < 0. 05被認為是統計學上顯著的O。圖61A-B.以多種策略處理UCB之后的UCB-VSEL和HSPC的回收。圖板A 從1毫升完全/未經處理的UCB (白色條柱)以及從1毫升經過以下處理的UCB回收的UCB-VSEL的絕對數目:i)裂解RBC(灰色條柱)；ii)在Ficoll-Paque梯度上離心(陰影條柱)；和iii) 雙步驟處理，包括⑶133+的免疫磁性分離，然后進行FACS。圖板B 從1毫升UCB (按照對于UCB-VSEL回收的描述進行處理)回收的HSC的絕對數目。平均值表示為平均值士SEM。 與完全未經處理的UCB相比，P < 0. 05被認為是統計學上顯著的O。圖62.通過ISS獲得的代表多能性UCB-VSEL亞群的細胞的圖像。圖中顯示了表達CD34抗原和多能性標志物Oct-4和SSEA-4的UCB-VSEL的代表性圖像。每幅照片由亮視野圖像和與細胞核圖像(7-AAD ；紅色)和Lin標志物和⑶45 (FITC ；綠色)、Oct-4或 SSEA-4(PE ；黃色)和CD34或CD133(PE，黃色或PE-Cy5，紅紫色)的表達(如每幅照片上所示)相關的單獨的熒光圖像組成。組合照片顯示了細胞核(7-AAD)和指明的標志物的復合。數值顯示了所示細胞的直徑。比例尺表示10 μ m。圖63A-B.含有UCB-VSEL的UCB亞群的絕對數目。圖板A 表達CD34、CD133和 CXCR4抗原的UCB的非造血成分的含量，其富含UCB-VSEL。圖板B 表達⑶34抗原以及PSC 的標志物(Oct-4和SSEA-4)的UCB-VSEL的亞群的含量。數值表示可以從1毫升UCB中分離的細胞的平均絕對數目(平均值士SEM)。圖64A-D.通過FACS分選VSEL的設門策略。通過FACS從免疫熒光染色的鼠BM有核細胞分離源自BM的VSEL。圖板A 與具有1、2、4、6、10和15 μ m的標準直徑的6種大小不同的珠子顆粒(Flow Cytometry Size beads, Invitrogen ；Molecular Probes, Carlsbad, Calif.，USA)比較之后，在門Rl中包括了介于2-10μπι的無顆粒的(agranular)小的事件。 圖板B 通過顯示正向分散(FSC)相對于側向分散(SSC)信號(它們分別與細胞的大小和粒度/復雜性相關)的點圖顯示BM有核細胞。圖板Dj^ka-l和Lin的表達進一步分析來自區域Rl的細胞，僅將ka-r/LirT的事件包括在區域R2中。基于⑶45標志物的表達， 進一步將來自區域R2的群體分選進入CD45_和CD45+亞群，顯示于直方圖中(圖板C，分別為區域R3和R4)。Sca-l+/Lin7CD45-細胞(VSEL)分選為包括在包含區域RU R2和R3的邏輯門中的事件，而ka-l7Lin/⑶45+細胞(HSC)來自包括區域R1、R2和R4的門。百分率顯示了總的BM有核細胞中每個細胞亞群的平均含量(士 SEM)。圖65A-D.源自胸腺的VSEL的ImageMream系統分析。圖中顯示了就ka_l、CD45 和造血譜系標志物(Lin)染色之后，從胸腺分離的細胞的完整群體的分析。圖板A顯示了根據形態學參數(包括細胞核的面積和亮視野的長寬比)所獲取的所有物體。基于每個細胞的亮視野圖像計算長寬比，其為較短的細胞軸(寬度)與較長的軸(高度)的比。圓的、 非長形的(non-elongated)細胞具有接近1. 0的長寬比，而長形的細胞或細胞塊具有小于 1.0的長寬比。在區域Rl中包括了圓的、含有DNA的單個細胞以進行進一步分析。隨后，基于Lin(圖板B)和CD45(圖板D)的表達在直方圖中顯示來自區域Rl的物體。來自包括區域R2和R3的邏輯門的LirT/⑶45_物體顯示于點圖中，其中顯示了它們的側向分散特征和 Sca-I 表達(圖板 C)。區域 R4 中包括了 Sca-l+/Lin7CD45_ 細胞。Sca-l+/Lin7CD45_ 細胞在源自胸腺的總細胞中的百分含量顯示為平均值士SEM。圖66A-B.通過ISS獲得的鼠VSEL、HSC、紅細胞和血小板之間的形態學比較。圖板 A顯示了就Sca-1(FITC，綠色)、Lin(PE，橙色)和CD45 (PE_Cy5，紅紫色)染色的鼠VSEL以及就Ter 119 (PE，橙色)和⑶41 (FITC，綠色)染色的源自血液的紅細胞和血小板。在固定之后，所有的樣品以7-AAD(紅色)進行染色以顯示細胞核。紅細胞和血小板沒有細胞核， 而VSEL顯示出含有細胞核的細胞結構。顯示了每個群體的平均大小(平均值士SEM)。比例尺表示10 μ m。圖板B顯示了當與相同級別的大小預先確定的珠子相比較時，來自所有3 個群體的細胞(VSEL、RBC和血小板)。圖67A-D.以Imag必tream系統檢測到的人工假象。圖板A顯示了就ka-Ι染色為陽性的正常的有核的Lin7CD45_細胞。在下面的圖板上顯示了假“陽性”的人工假象的選擇的圖像(圖板B)，被破壞的、降解的細胞(圖板C)和細胞碎片(圖板D)。每幅照片顯示了亮視野圖像以及與細胞核圖像(7-AAD;紅色)和^^-1爾11^;綠色)、1^11腫；橙色) 和⑶45 (PE-Cy5 ；黃色)的表達相關的單獨的熒光圖像。比例尺表示10 μ m。
圖68.通過ISS在鼠組織中分析的0ct-4+/Sca-l7Lin7⑶45_細胞的圖像。圖中顯示了在骨髓、肺、腦、腎、胰腺和骨骼肌檢測的此類細胞的代表性圖像。就多能性標志物 0ct-4(FITC ；綠色)、CD45和Lin(PE ；橙色)以及Sca-I (PECy5 ；紅紫色)染色分離自器官的細胞。以7-AAD(紅色)染色細胞以顯示細胞核，并通過ISS分析以檢測Oct-4的核內表達，如在放大的組合的圖像中所示。比例尺表示10 μ m。圖69A-B.存在于鼠器官中的0ct-47Sca-r/Lin7⑶45_細胞的絕對數目。圖板 A顯示了通過使用由ISS獲得的百分含量和分離自每種器官的總細胞數而計算的每個器官中Oct-4+VSEL的含量[xl03]。數值表示為平均值士SEM。圖板B顯示了所分析的所有器官中Oct-4+VSEL的總數目的百分率分布的估計。數值顯示為平均值士SEM。圖70.在成體器官中檢測到的Oct-4+VSEL的共聚焦顯微鏡圖像。圖中顯示了在骨髓、腦和腎中檢測到的Oct-4+VSEL的代表性圖像。就Oct-4 (TRITC ；紅色)、CD45 (Cy5 ；紅紫色)和Sca-I (FITC ；綠色)染色分選的Sca-I+LirT/⑶45_細胞。細胞核以DAPI (藍色) 進行染色。圖像顯示了對⑶45為陰性而對0ct_4(其為多能性細胞的標志物)和Sea-I為陽性的0ct-47Sca-rLin7CD45_細胞(VSEL)。合并的圖像顯示了 0ct_4的核內染色以及 Sca-I抗原的表面存在。比例尺表示5 μ m。序列表的簡單描述SEQ ID Nos :1_64是可以用于擴增多個鼠核酸序列的32個引物對的核苷酸序列， 總結于表1中。^t 1 用于實時RT-PCR的鼠引物的序列
基因 (GENBANK 登記號 )序列(以5，-3'順序表示)召2微球蛋白 (NM_009735)CATACGCCTGCAGAGTTAAGCA (SEQ ID NO: 1) GATCACATGTCTCGATCCCAGTAG (SEQ ID NO: 2)Oct4 (X52437)ACCTTCAGGAGATATGCAAATCG (SEQ ID NO: 3) TTCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCT (SEQ ID NO: 4)Nanog (AY278951)CGTTCCCAGAATTCGATGCTT (SEQ ID NO: 5) TTTTCAGAAATCCCnCCCTCG (SEQ ID NO: 6)
權利要求
1.源自人類的成人器官或組織細胞的非常小的胚胎樣干細胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過就⑶133+CXCR4+CD34+LinTD45-細胞來選擇細胞以獲得靶VSEL 的富集群體。
2.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
3.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是SSEA+。
4.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL在細胞核中表達Oct-4蛋白，并且在表面上表達SSEA抗原。
5.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是Nanog+。
6.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL表達選自下列的原始生殖細胞 (PGC)標志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-U CXCR4、Mvh、Stella, Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
7.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就大小為2至6μπι的細胞進行選擇而富集的。
8.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就大小為2至4μπι的細胞進行選擇而富集的。
9.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就含有原始的非結構化的常染色質的細胞進行選擇而富集的。
10.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述群體中至少30%的細胞是靶VSEL。
11.源自人類血液的非常小的胚胎樣干細胞(VSEL)的富集群體，其中所述群體這樣富集通過就⑶133+CXCR4+⑶34+LinTD45_細胞來選擇細胞以獲得靶VSEL的富集群體。
12.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述血液是臍帶血。
13.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述血液是外周血。
14.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是0ct_4+。
15.權利要求1的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是SSEA+。
16.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL在細胞核中表達0ct_4蛋白，并且在表面上表達SSEA抗原。
17.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL是Nanog+。
18.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述靶VSEL表達選自下列的原始生殖細胞 (PGC)標志物胎兒型堿性磷酸酶、OctA, SSEA-1、CXCR4、Mvh、Stella、Fragilis, Nobox 和 Hdac6。
19.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就大小為2至6μ m的細胞進行選擇而富集的。
20.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就大小為2至4μm的細胞進行選擇而富集的。
21.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體是通過就含有原始的非結構化的常染色質的細胞進行選擇而富集的。
22.權利要求11的VSEL的富集群體，其中所述群體中至少30%的細胞是靶VSEL。
23.產生細胞群體的方法，所述細胞群體就來自人類血液的靶非常小的胚胎樣干細胞 (VSEL)進行了富集，所述方法包括裂解血液以除掉紅細胞和制備LirT/⑶457⑶133+細胞的富集群體。
24.權利要求23的方法，其中所述血液是臍帶血。
25.權利要求23的方法，其中所述血液是外周血。
26.產生細胞群體的方法，所述細胞群體就來自人類血液的靶非常小的胚胎樣干細胞 (VSEL)進行了富集，所述方法包括i)裂解血液以除掉紅細胞；ii)制備CD133+細胞的富集群體；和iii)制備LirT/⑶457⑶133+的富集群體。
27.權利要求沈的方法，其中所述血液是臍帶血。
28.權利要求沈的方法，其中所述血液是外周血。
29.權利要求沈的方法，其中所述LirT/⑶457⑶133+的富集群體是通過熒光激活的細胞分選來富集的。
30.權利要求沈的方法，其中在低滲的氯化銨溶液中裂解血液以除掉紅細胞。
31.權利要求沈的方法，其中通過使用免疫磁珠來富集CD133+細胞。
全文摘要
當前披露的主題提供了分離干細胞群的方法，所述干細胞群來自骨髓、外周血和/或其它來源。還提供了使用干細胞治療受試者中的組織和/或器官損傷的方法。
文檔編號C12N5/071GK102333861SQ200980148102
公開日2012年1月25日 申請日期2009年9月30日 優先權日2008年9月30日
發明者E·K·祖巴-敘爾馬, J·拉塔查克, M·庫恰, M·拉塔查克 申請人:尼奧斯泰姆公司, 路易斯維爾大學研究基金會有限公司