專利名稱：一個定向突變及遺傳改造的重組質粒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術，涉及利用位于該質粒上一段基因片段來制作耐輻射球菌基因
突變株及轉基因遺傳改造耐輻射球菌成為工程細菌的篩選標記。
背景技術：
目前，耐福射球菌屬(Deinococcaceae)已經發現八個禾中，D. radiodurans， D. proteolyticus， D. radiopugnans， D. grandis， D. geothermalis， D. murrayi， D. radiophilus，D. radiotolerance。盡管它們形態各異，但都有一個共同的生理特性，就是 顯示出極強的電離輻射抗性。其中Deinococcus radiodurans (DR)是1956年由美國科學 家Anderson等從X-射線滅菌處理后的肉罐食品中發現的一種紅色的非致病性球菌，最適 生長溫度為30°C。耐輻射球菌是最具輻射抗性的生物體之一，在5kGy的電離輻射下，對數 生長期的耐輻射球菌細胞不受任何影響，它可以長期正常生長于60Gy/h高輻射背景的環 境之中。穩定生長期的耐輻射球菌可以耐受15kGy的輻射劑量，是大腸桿菌的100多，是人 類的1000倍。1999年D. radiodurans的基因組測序完成。該細菌除了對抗由電離輻射，對 亞硝基胍、羥胺、甲基硝基亞硝基胍和氧基硝基喹啉等化學毒劑也具有相當抗性。因此，自 從耐輻射球菌被發現以來，倍受微生物學家、放射生物學家和腫瘤研究人員的重視。有人已 經開展研究使其成為核爆地區等高輻射污染地區的生物修復候選人，也有人研究使其某些 特定基因用于生產物種的轉基因改良，比如作物的抗干旱。 該菌的生物學特征是，與其他物種比較，它具有超強的耐輻射能力和DNA修復能 力。該生物已經成為研究DNA損傷修復的模式生物，也有學者認為該生物DNA損傷修復方式 可以為癌癥的研究提供模型。基因突變尤其定向的基因敲除是研究功能基因的重要手段， 利用本發明的質粒所搭載的卡那霉素抗性篩選標記來構建功能基因的突變株。另外，由于 耐輻射球菌具有相當強的抗輻射、抗化學毒劑的能力，很多生物工程的研究者已經試圖將 該細菌改造成為在核實驗基地等高輻射背景下開展生物修復的工程細菌。由美國國防部資 助的項目已取得不錯的進展，由該細菌改造成的工程菌可以富集鈾等放射性原素。而在工 程菌遺傳改造過程，合適篩選標記是其中重要的因素。 研究某些特定基因時，對目標基因進行突變從而試圖研究其生物學特性是常用手 段，現在也有商業化的包含篩選標記的質粒。用于該細菌基因突變有特殊轉座子隨機插入 基因，該方法是隨機的，實際操作中不適于基因的定向突變。而利用篩選標記基因結合特殊 啟動子根據同源重組的原理進行目標基因的靶向突變和基因組遺傳改造是一種重要技術。 在此方法中，選擇合適的篩選基因以及合適的啟動子部是其中的重要環節。
發明內容
本發明的目的是提供一個定向突變及遺傳改造的重組質粒，是用于耐輻射球菌目 的基因定向突變和染色體遺傳改造的重組基因，具有SEQ IDN2 :1的核苷酸序列，是表達耐 輻射球菌熱激蛋白GroEL基因的啟動子PgroEL與卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段。本發明中耐輻射球菌的菌株分類為Deinococcus radiodurans，保藏號為ATCC NO. 13939， 菌種編號為Rl，購于國家菌種保存中心；質粒名稱pRADK，篩選基因卡那霉素抗性基因 (KanR)，啟動子表達耐輻射球菌熱激蛋白GroEL基因(DR0607)啟動子PgroEL。
所述質粒通過以下步驟獲得構建PgroEL啟動子與卡那霉素結構基因的緊 密融合，并在接合位點作了變動，PgroEL啟動子核糖體結合位點(RBS)后的CACATG替 換成CATATG(即Ndel酶切位點)，該酶切位點的后三個堿基ATG作為卡那霉素抗性基 因起始翻譯位點。利用以D. radiodurans Rl基因組為模板，設計克隆GroEL啟動子 PgroEL的引物上游引物P1 :5' CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATA T3'，下游引物P2 : 5' GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3' ， PCR擴增GroEL的啟動子片段SI ;同時以pET_29b質 粒為模板，上游引物P3 :5' TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGG AAACGTC 3'，下游引物P4 :5' ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA TG 3'，克隆卡那霉素抗性基因S2。兩段PCR產 物SI與S2經Ndel酶切后連接，以連接產物作模板，PI與P4為引物進一步擴增得PCR產 物S3，即為含有GroEL啟動子的卡那霉素抗性基因的DNA片段。 本發明的另一個目的是提供所述的重組質粒在構建耐輻射球菌以及耐輻射球菌 屬其它菌株的目的基因突變株的篩選標記中的應用。利用同源重組的原理，可以SEQ ID N2 :1序列替代耐輻射球菌基因組的目標基因，并利用卡那霉素對突變株進行篩選，進而得 到目標基因的基因敲除突變株。 本發明的再一個目的是提供所述的重組質粒在構建耐輻射球菌以及耐輻射球菌 屬其它菌株遺傳改造成工程菌的篩選標記。耐輻射球菌具有抗極端環境的能力，尤其高輻 射背景下可以正常生長的特性使其成為在高輻射背景下進行生物修復的良好候選生物。現 在有相關文獻報道利用質粒將可以重金屬還原的基因轉化到耐輻射球菌中進行污染環境 的生物修復。然而，質粒在沒有選擇壓力下，可能容易丟失，導致整個系統失效。因此，將修 復基因整合到細菌基因組中的方法可使得重組細菌更加穩定。利用同源重組的原理，可以 SEQ ID N2 :l序列以及生物修復基因整合到細菌基因組中，并用卡那霉素進行篩選，得到重
組細菌。這種重組細菌具有很好遺傳穩定性。 本發明的基因片段位于質粒pRADK，該質粒可以在耐輻射球菌中正常復制并遺傳， 而且在大腸感覺中也有較高的拷貝數，因而可以有較高產量，很容易得到大量質粒，進而可 以從該質粒到得到SEQ ID N2 :1的序列，用于上述多種用途。 本發明中的目標微生物是耐輻射球菌(Deinococcus radiodurans), —類廣泛 生活在自然界，能忍受紫外線、放射線、干旱等極端環境的原核微生物，該菌的生物學特征 是，與其他物種比較，它具有超強的耐輻射能力和DNA修復能力。該生物已經成為研究DNA 損傷修復的模式生物，也是成環境生物修復的工程菌的重要候選物種。借助本發明的GroEL 啟動子驅動下卡那霉素抗性基因，可以有效篩選基因突變株或者DNA重組工程菌。
圖1是用pRADK構建耐輻射球菌基因缺陷性突變株流程圖。
圖2是耐輻射球菌pprl基因功能缺陷性突變株YR1的構建。
圖3是耐輻射球菌卯rl基因突變株的PCR驗證。
圖4是基于耐輻射球菌的汞還原工程菌構建。
具體實施例方式
本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
實施例1 —種用于耐輻射球菌目的基因定向突變和染色體遺傳改造的質粒pRADK的構建。 耐輻射球菌的菌株分類為Deinococcus radiodurans，保藏號為ATCC NO. 13939，菌種編號 為Rl，購于國家菌株保存中心；質粒名稱pRADK，篩選基因卡那霉素抗性基因(KanR)，啟 動子表達耐輻射球菌熱激蛋白GroEL基因(DR0607)啟動子PgroEL。
為了卡那霉素抗性基因能夠在耐輻射球菌中正常表達，我們構建了 PgroEL啟動 子與卡那霉素結構基因的緊密融合，并在接合位點作了變動，PgroEL啟動子核糖體結合位 點(RBS)后的CA￡ATG替換成CAIATG(即Ndel酶切位點)，該酶切位點的后三個堿基ATG 作為卡那霉素抗性基因起始翻譯位點。以D. radiodurans Rl基因組為模板，設計克隆 GroEL啟動子PgroEL的引物上游PI :5' CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATAT3',下游P2 : 5' GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3'(劃線部分分別為Hindlll和Ndel位點)，PCR擴增 GroEL的啟動子片段Sl。同時以pET-29b質粒為模板，上游引物P3 :5' TCATCACATATGAGCC ATATTCAACGGGAAACGTC3 ，， 下游引物P4 :5 ， ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG 3'(劃線部分分別為Ndel和BamHI位點)，克隆卡那霉素抗性基因S2。兩段PCR產物Sl 與S2經Ndel酶切后連接，以連接產物作模板，PI與P4為引物進一步擴增得PCR產物S3， 即為含有GroEL啟動子的卡那霉素抗性基因的DNA片段。上述PCR產物S3與穿梭質粒 pRADZ3 (pRADZ3具體信息參考文獻Meira， 2001)分別經Hindlll和BamHI酶切后連接得到 表達質粒pRADK。參見圖1。 實施例2 :用pRADK構建耐輻射球菌DR0167基因缺陷性突變株
參見圖2，以耐輻射球菌基因組為模板，設計引物P5 : 5， CAGGGCAGCGCGGGCGACGTGGACGG3，， P6 :5' ATGATGGATCCGGAGGCTT CAGCTTTAGCTTTTGGCC 3'(劃線部分為BamHI位點)；擴增產物PCR1 ;引物P7 :5' CATCTAAGCTTTGCCCGGACGCGACAC CCACAGCC 3'(劃線部分為Hindlll位點)，P8 :5' GGGCACGTAGCTTTCCTCGCGCACTTCC 3'，擴 增產物PCR2，PCR1與PCR2分別經Bam HI和Hindlll雙酶切后與同樣雙酶切的上述pRADK 片段連接，以此三段連接產物為模板，P5與P8引物擴增得到PCR產物S4，通過同源重組方 法將PCR產物S4重組進入耐輻射球菌Rl基因組中，以30 g/ml卡那霉素篩選得到卯rl 基因功能完全破壞的突變株YR1。以耐輻射球菌野生株Rl和卯rl突變株YR1的基因組為 模板，用引物P5和P8進行PCR擴增。PCR產物分別經1%瓊脂糖電泳進行分離并溴化乙錠 染色后在凝膠成像系統拍照。結果發現，來自突變株YR1的產物要比來自野生株R1的產物 大1100bp左右(圖3)，表明卯rl基因被SEQ ID N2 :1DNA片段所替代，進而被成功敲除突 變。 實施例3用pRADK構建耐輻射球菌遺傳改造成工程菌 參見圖4，用PCR方法將汞還原操縱子mer克隆，然后與從pRADK質粒切下來到 PgroEL-KanR融合DNA片段連接，之后，用PCR分別從耐輻射球菌基因組DNA中克隆要將 mer插入位置上下游各1000堿基對，酶切后分別連接到mer操縱子上游和PgroEL-KanR融 合DNA片段下游，最后將該重組DNA片段轉化到耐輻射球菌細胞，用30 g/mL的卡那霉素
5進行篩選。 本發明涉及的序列
〈120〉 一個定向突變及遺傳改造的重組質粒及應用 〈160>9 〈210>1 〈211>1231 〈212>DNA
〈213>耐輻射球菌屬(Deinococcaceae) 〈220>groEL、 kan咖ycin resistance 〈400>1
TTCTAA 〈210>2 〈211>31 〈212>DNA
〈213>而f輻身寸球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>2
CATAGAAGCT TCGTATTGTC GCCCTACATA T
〈210>3
〈211>26
〈212>DNA
〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>3 GATCAAGCAT ATGGGGTCCT CCTGTG 〈210>4 〈211>35 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>4 TCATCACATA TGAGCCATAT TCAACGGGAA ACGTC 〈210>5 〈211>38 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>5 ACAGACGGAT CCTAGAAAAA CTCATCGAGC ATCAAATG 〈210>6 〈211>26 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>6 CAGGGCAGCGCGGGCGACGT GGACGG 〈210>7 〈211>37 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>7 ATGATGGATC CGGAGGCTTC AGCTTTAGCT TTTGGCC 〈210>8 〈211>35 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>8 CATCTAAGCT TTGCCCGGAC GCGACACCCA CAGCC 〈210>9 〈211>28 〈212>DNA 〈213>而拖射球菌(Deinococcus radiodurans) 〈400>9 GGGCACGTAG CTTTCCTCGC GCACTTCC
權利要求
一個定向突變及遺傳改造的重組質粒，其特征在于，具有SEQ ID No1的核苷酸序列，是表達耐輻射球菌熱激蛋白GroEL基因的啟動子PgroEL與卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段，通過以下步驟獲得構建PgroEL啟動子與卡那霉素結構基因的緊密融合，并在接合位點作了變動，PgroEL啟動子核糖體結合位點(RBS)后的CACATG替換成CATATG(即NdeI酶切位點)，該酶切位點的后三個堿基ATG作為卡那霉素抗性基因起始翻譯位點。
2. 根據權利要求1所述的一個定向突變及遺傳改造的重組質粒，其特征在于，設計克 隆GroEL啟動子PgroEL的引物上游引物P1 :5' CATAGAAGCTTCGTATTGTCGCCCTACATA T3，， 下游引物P2 :5' GATCAAGCATATGGGGTCCTCCTGTG 3'， PCR擴增GroEL的啟動子片段Sl，同時以pET_29b質粒為模板， 上游引物P3 :5' TCATCACATATGAGCCATATTCAACGGG AAACGTC 3，，下游引物P4 :5' ACAGACGGATCCTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG 3'，克隆卡那霉素抗性基因S2。
3. 根據權利要求1所述的一個定向突變及遺傳改造的重組質粒在作為構建耐輻射球 菌以及耐輻射球菌屬其它菌株的目的基因突變株的篩選標記中的應用。
4. 根據權利要求1所述的一個定向突變及遺傳改造的重組質粒在作為構建耐輻射球 菌以及耐輻射球菌屬其它菌株遺傳改造成工程菌的篩選標記中的應用。
全文摘要
本發明提供一個用于耐輻射球菌目的基因定向突變和染色體遺傳改造的重組基因，具有SEQ ID №1的核苷酸序列，是表達耐輻射球菌熱激蛋白GroEL基因的啟動子PgroEL與卡那霉素抗性基因KanR的融合DNA片段。本發明的基因片段位于質粒pRADK，該質粒可以在耐輻射球菌中正常復制并遺傳，而且在大腸桿菌中也有較高的拷貝數，因而可以有較高產量，很容易得到大量質粒，進而可以從該質粒到得到SEQ ID №1的序列，可在構建耐輻射球菌以及耐輻射球菌屬其它菌株的目的基因突變株的篩選標記中應用；也可在構建耐輻射球菌以及耐輻射球菌屬其它菌株遺傳改造成工程菌的篩選標記中應用。
文檔編號C12Q1/04GK101768598SQ20101010116
公開日2010年7月7日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者華躍進, 陸輝明, 高冠軍, 黃麗芬 申請人:浙江大學