專利名稱：：一種大規模生產豬藍耳病病毒的方法
技術領域：
：本發明屬于獸用生物制品
技術領域：
，涉及動物病毒培養技術，更具體涉及生產豬藍耳病病毒的方法。
背景技術：
：豬藍耳病又稱豬繁殖與呼吸綜合征，是一種危害養豬業的病毒性傳染病。2006年夏秋季，我國南方部分省份發生豬“高熱病”疫情，農業部積極組織科研人員聯合攻關，確定豬藍耳病變異病毒為主要病原，定名為“高致病性豬藍耳病”。直至今日，疫病形勢依然嚴峻，同其他病毒性疾病一樣，目前尚無有效的治療性藥物用于藍耳病的治療，免疫接種是防制該病的最有效方法，目前商品化的藍耳病疫苗主要是由經典株制備的弱毒苗和由變異株制備的滅活苗。而這兩種疫苗生產的關鍵點就是作為抗原的病毒的生產。病毒株生長的培養條件對于獲得該株系的所希望的高產量來說具有重大意義。為了最大化所想要的病毒的產量，系統和培養條件都必須特定地適合于提供對于產生所想要的病毒來說有利的環境。現有的藍耳病病毒大規模生產多采用轉瓶工藝，但是生產過程中手工操作密集，病毒株受限，細胞維持時間短，密度及活性低等問題，限制了產品的產量、質量的提高和生產成本的降低。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種大規模生產藍耳病病毒的方法。該方法具有生產工藝簡單穩定、易操作的特點，病毒產量高，批間差異小，質量易控制等特點，可顯著提高疫苗產量和質量。為達到上述目的，本發明利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬藍耳病病毒，包括下列技術步驟(1)培養制備病毒用細胞將制備病毒用宿主細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐，并將上述細胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的540倍。(2)毒液的接種與繁殖換用細胞維持培養液，將藍耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；連續培養23日后，收獲病毒液，(3)經檢驗合格后，將收獲的病毒液于-20°C凍融兩次，滅活純化得到藍耳病病毒液。病毒液檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關規定進行檢驗，完全符合，安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。通過接種細胞，觀察致細胞病變作用，根據Reed-Muench法計算病毒含量，每1.Oml病毒含量彡IO8-5TCID50；上述技術方案中，所述的宿主細胞為可增殖藍耳病病毒的細胞系，如猴腎細胞系(Marc-145)等。本發明方法中所述的培養液最好是90%99%MEM與10%牛血清的混合液，PH值為6.58.0較好，加適量抗生素。上述技術方案中，所述的適宜本發明的微載體可以為具有網狀結構的纖維，如聚酯纖維等。本發明方法中細胞獲得氣體交換的方式可以通過培養液液面升降的方式實現。上述技術方案中，步驟(1)中，一般啟動貼附程序后4h換成細胞培養程序。所述細胞貼附程序最佳參數為up:2500mL/minholdlmin、Down:2500mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL；細胞培養程序最佳參數為up:1900mL/minholdlmin、Down1900mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL。上述技術方案中，步驟(1)中所述微載體用量為每500ml培養液添加5.5g微載體較好，細胞的初始接種量為3.04.OX107cellS/g微載體較好。上述技術方案中，步驟(2)中所述接種病毒時細胞密度一般為1.5X1082.0X108cells/g微載體。上述技術方案中，步驟(2)中所述接種病毒時按病毒感染復數(M.0.I.)為0.0011.5的比例。上述技術方案中，步驟(2)中，一般啟動吸附程序后4h換成病毒培養程序，所述病毒吸附程序最佳參數為up:1700mL/minholdlmin、Down:1700mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL；病毒培養程序最佳參數為up:1200mL/minholdlmin、Down1200mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL。上述技術方案中，細胞與病毒培養溫度36.5°C37.5°C，培養環境中含有2.5%5%的C02。本發明方法中，潮汐式微載體懸浮培養技術采用的生物反應器主要由載體罐、儲液罐、PH控制器、DO監測器、輸入和輸出系統組成。工作過程如下細胞貼附在載體罐中的載體上生長，當儲液罐的培養液被泵入載體罐時，培養液液面上升向細胞供給養分并促進細胞新陳代謝產物的去除；當載體罐的培養液泵入儲液罐時，培養液面隨之下降，使細胞進行通風，促進呼吸，減小細胞切向壓力，無O2供應限制，無泡沫煩惱。這個重復的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養和02，同時產生的代謝廢物如CO2能夠有效的被排出去，從而能夠大量的擴增細胞并增值病毒，此種技術稱之為潮汐式微載體懸浮培養技術。本發明所提供的一種以潮汐式細胞微載體懸浮培養系統生產動物用狂犬病毒抗原的方法，與傳統轉瓶傳代細胞培養技術相比，更具有以下優點1.采用本發明方法，解決了傳統轉瓶生產時單批產量不高、批間差異大、產品質量不穩定、勞動強度大、生產成本高等問題。2.本發明方法中采用的載體為網狀的聚酯纖維，具有親水性和生物無害性，Ig載體約占15ml的空間，可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內極大的增大了細胞的貼壁面積，增加了細胞生長的密度，細胞數可達到1.0X109以上，其效能為傳統轉瓶培養系統的數十倍，可以節省許多成本及人力。3.本發明方法制備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，得到的高滴度的抗原可以大大提高疫苗的免疫能力。4.制備的病毒毒價高傳統的轉瓶工藝生產的藍耳病病毒效價僅為IO65TCID5tl/ml，而本發明采用新的技術參數，運用潮汐式微載體懸浮培養技術高密度培養生產的病毒效價可以達到1085TCID5Q/ml，其毒價要高出100倍。具體實施方式實施例中所使用的生物反應器為美國CESCO公司的TideCell-020型，所使用的載體為美國CESCO公司的BioNocII聚酯纖維，寬5mm，長10mm，Ig載體約占15ml的空間，提供2400cm2的貼壁面積，可提供1.0X109以上數量的細胞生長。實施例11.病毒與細胞株用于制備藍耳病病毒抗原的病毒株為NVDC-JXAl毒株，經過致病性測試，該毒株病毒不具有致病性。以對該病毒株具有良好敏感性的細胞系猴腎細胞(Marc-145)，作為制苗用細胞系，藉以感染并大量繁殖藍耳病病毒。2.制備方法(1)將制備抗原用細胞系猴腎細胞(Marc-145)接種到加有MEM液體培養基(包括10%牛血清、0.01mol/LNaHC03>0.lmg/ml硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)、100，000IU青霉素G鈉鹽(PenicillinGSodium)、pH值為7.2)與BioNocII聚酯纖維的載體罐內；微載體用量為每500ml培養液添加5.5g微載體，細胞初始接種量為8.0X109cells/g微載體。(2)于37°C、5%CO2培養環境下，細胞貼附4h，使上述制備抗原用細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附在微載體上。貼附程序參數為up:2500mL/minholdlmin.Down2500mL/minhold30s、設定最大換液量17500mL;4h后切換為細胞培養程序，細胞培養程序參數為up:1900mL/minholdlmin、Down:1900mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL。(3)于37°C、5%CO2培養環境下，使細胞在上述微載體上生長，待細胞達到4.OXIO10Cell時，換用添加1%牛血清的MEM細胞維持培養液，按病毒感染復數(M.0.1.)為0.001的比例接種藍耳病病毒NVDC-JXAl毒株，并使之感染細胞，使病毒增值，病毒吸附程序為up:1700mL/minholdlmin、Down:1700mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL；病毒培養程序up:1200mL/minholdlmin,Down1200mL/minholdlmin、設定最大換液量17500mL；(4)于37°C、5%C02培養環境下繼續培養；培養2日后收獲病毒液，于_20°C凍融兩次并進行以下檢驗；(a)純凈性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005版附錄15、19、20頁相關規定進行檢驗，結果無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染；(b)病毒含量測定將病毒用含牛血清細胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從IO-1到10_9。每個稀釋度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養。在倒置顯微鏡下逐孔觀察致細胞病變作用(CPE)，每天觀察一次，并將觀察結果記入專用登記表內。觀察天數為直至出現CPE終點，即看到能夠引起病毒增殖的病毒最高稀釋度。對照細胞應始終保持良好形態和特征。并根據Reed-Muench法計算病毒含量，每1.0ml病毒含量彡IO85LD50;(c)特異性用間接免疫熒光抗體(IFA)方法測定。將病毒接種于96孔細胞板Marc-145細胞，每個樣品4孔，每孔200μL，同時設立陰性對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養6068h；棄去培養液，用0.01mol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌細胞4次，然后加入100μL預冷的80%丙酮水溶液，4°C固定30min；然后用PBS洗滌4次，每次3min，然后每孔加入100μL工作濃度的豬抗藍耳病病毒血清，置于37°C恒溫箱中感作45min；用PBS洗滌4次，每次3min后；加入工作濃度的兔抗豬FITC結合物100μL，37°C作用45min；用PBS洗滌4次，每次3min，在熒光顯微鏡下觀察。細胞對照孔無特異性黃綠色熒光出現，而病毒接種細胞孔有大量特異性黃綠色熒光出現。對比例懸浮培養工藝與傳統轉瓶培養技術比較通過對大規模潮汐式細胞微載體懸浮培養系統與常用轉瓶培養系統相關生產性能指標進行對比，結果如表1所示。表1不同培養系統增殖藍耳病病毒的相關比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>風險暴露點<20個423個耗材成本低高清洗成本低高收獲病毒500L423x300ml=126.9L病毒毒價IO85LDWml1065LD50/ml操作工藝_全自動微電腦控制_程序繁瑣_備注BioN0CII載體貼壁面積Ig=2400cm2,1個TideCell-020微載體懸浮培養系統需要加入BioNOCII載體220g。結論上列詳細說明系針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例并非用以限制本發明之專利范圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含于本案之專利范圍中。權利要求一種大規模生產豬藍耳病病毒的方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬藍耳病病毒，包括下列技術步驟(1)培養制備病毒用細胞將可增殖藍耳病病毒的細胞系接種到含有培養液與微載體的載體罐，并將上述細胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；(2)毒液的接種與繁殖待細胞達到一定密度時，換用細胞維持培養液，將藍耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；連續培養2～3日后，收獲病毒液；(3)經檢驗合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化得到藍耳病病毒液。2.根據權利要求1所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于，所述細胞微載體懸浮培養系統為潮汐式。3.根據權利要求2所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于步驟(1)中啟動貼附程序4h后切換培養程序；所述的細胞貼附程序參數為up23002700mL/minhold40120s、Down:23002700mL/minhold4090s、設定最大換液量17500mL；細胞培養程序參數為up17002100mL/minhold40120s、Down17002100mL/minhold40120s、設定最大換液量17500mL。4.根據權利要求2所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于步驟(2)中啟動吸附程序后4h換成病毒培養程序，所述病毒吸附程序參數為up15001900mL/minhold40120s、Down:15001900mL/minhold4090s、設定最大換液量17500mL；病毒培養程序參數為:up10001400mL/minhold40120s、Down10001400mL/minhold40120s、設定最大換液量17500mL。5.根據權利要求2所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于所述可增殖藍耳病病毒的細胞系為猴腎細胞系；培養液為90%99%MEM，加10%牛血清，加適量抗菌素，PH值為6.58.0；所述微載體為聚酯纖維。6.根據權利要求2所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于細胞培養溫度36.537.5°C，培養環境中含有2.5%5%二氧化碳。7.根據權利要求2所述的大規模生產豬藍耳病病毒的方法，其特征在于微載體用量為每500ml培養液添加5.5g微載體，細胞初始接種量為3.04.0X107cellS/g微載體。8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的接種藍耳病病毒時的細胞密度為1.5\1082.0\10806118/8微載體。9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)按病毒感染復數(M.0.I.)為0.0011.5的比例接種病毒。全文摘要本發明公開了一種大規模生產豬藍耳病病毒的方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬藍耳病病毒，將制備病毒用宿主細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；換用細胞維持培養液，將藍耳病病毒制成病毒懸液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；連續培養2～3日后，收獲病毒液；經檢驗合格后，將收獲的病毒液于-20℃凍融兩次，滅活純化得到藍耳病病毒液。該方法生產規模大、單批次產量高、生產成本相對較低。文檔編號C12N7/02GK101831412SQ201010135139公開日2010年9月15日申請日期2010年3月30日優先權日2010年3月30日發明者喬榮岑,習向鋒,孫進忠,張海洋,張許科,李三,陶家權,駱愛芳申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司