應答H₂O₂的miRNA-528及其應用的制作方法

專利名稱：應答H₂O₂的miRNA-528及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種應答H2O2的miRNA-528及其應用。
背景技術：
過氧化氫(H2O2)是一種雙功能分子，在植物體內起雙重作用，既是一種毒性分子 能導致細胞氧化損傷，又是一種信號分子在信號轉導中發揮作用(Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. ,2002,7 405-410.； Mittler R, Vanderauwera S, Gollery Μ, Breusegem F V. Reactiveoxygen gene network of plants. Trends Plant Sci. ,2004,9 =490-498.) H2O2 的雙功能性決定了植物體內必 然存在著H2O2相關的復雜網絡，使它的濃度處于相對穩態。在H2O2引起氧化脅迫的條件 下，網絡中許多基因或蛋白都會對H2O2產生應答，自身的表達發生變化從而影響植物多種 生理活動，最終使植物對H2O2脅迫產生適應。目前，轉錄組和蛋白質組的數據已經揭示 出植物中相當多的應答H2O2的基因和蛋白，主要集中在細胞防御、氧化還原平衡等功能 (Vanderauwera S，Van Der Kelen K，Dat J，Gadjev I，Boonefaes T，Morsa S，Rottiers P，Slooten L，Van Montagu M，ZabeauM. et al. A comprehensive analysis of hydrogen peroxide-regulated geneexpression in tobacco.Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2003，100 16113-16118. ；Wan X Y,Liu J Y. Comparative proteome analysis reveals an intimate proteinnetwork provoked by hydrogen peroxide stress in rice seedling leaves. Mol. CellProteomics，2008，7 1469-1488. )。Wan等通過比較蛋白質組學方法鑒定出144個 在H2O2處理的水稻幼苗葉片中差異表達的蛋白，這些蛋白大多與細胞防御、氧化還原平衡、 信號轉導、蛋白合成和降解、光合成和光呼吸以及能量代謝相關，通過這些差異表達的蛋白 以及它們的功能和參與的生理過程，構建了水稻幼苗應答H2O2的蛋白網絡，該網絡闡明了 水稻幼苗葉片通過提高抗氧化相關蛋白的表達和抑制代謝相關蛋白的表達來適應氧化脅 迫(Wan X Y, Liu J Y. Comparative proteome analysis revealsan intimate protein network provoked by hydrogen peroxide stress in riceseedling leaves. Mol. Cell Proteomics,2008,7 :1469_1488.)。miRNA(microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內源單鏈非編碼小分子 RNA，在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004,116 :281_297.)。近年來大量研究表明，miRNA參與調控植物生長 發育以及應答生物和非生物脅迫等許多重要生物學過程(Bushati N,Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.，2007，23 175-205.；金龍國，王川，劉進元.植物 MicroRNA.中國生物化學與分子生物學報，2006，22 =609-614.)。因此，有理由相信miRNA — 定在植物應答H2O2的過程中起著關鍵作用。但是，目前的植物應答H2O2的相關研究主要集 中在基因和蛋白，還很少涉及到植物小分子RNA、特別是miRNA領域。植物中是否存在著應 答H2O2的miRNA，這些miRNA的作用是什么，目前還沒有明確的答案。尋找和鑒定植物體內 應答H2O2的miRNA，對于完善植物H2O2相關的調控網絡，全面解析植物應答H2O2的分子機制具有重要意義。水稻不僅是世界最重要的糧食作物之一，同時也是一種重要的模式生物，在植物 研究特別是單子葉植物研究中占有重要地位。

發明內容
本發明的目的是提供一種應答H2O2的miRNA-528及其應用。本發明保護的miRNA-528的序列如下(5，一 3，)UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG (序列表的序列 1)。本發明還保護miRNA-528在抑制IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因(0s08g0467400)表 達中的應用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。所述IAA-丙氨酸抗性 蛋白1基因可如序列表的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。所述IAA-丙氨 酸抗性蛋白1基因也可如序列表的序列3所示。本發明還保護miRNA-528在促進IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因(0s08g0467400)的 mRNA降解中的應用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。所述IAA-丙氨酸 抗性蛋白1基因可如序列表的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。所述IAA-丙 氨酸抗性蛋白1基因也可如序列表的序列3所示。序列1所示miRNA-528可用于水稻種質改良。本發明采用國際上先進的Solexa高通量測序技術結合生物信息學分析、 Northern雜交、實時定量PCR等多種生物學手段，首次從基因組水平鑒定到應答H2O2的 miRNA-528,并且證實該miRNA在植物體內調控的靶基因。miRNA-528可以通過改變IAA-丙 氨酸抗性蛋白I(IARl)基因表達量調節IAA平衡。植物細胞內游離的IAA極易受到H2O2氧 化而降解，而IAA對于植物維持生理活動是必需的，在這種情況下，植物體內的miR528表達 受到抑制，從而增加了其靶基因IARl的表達，IARl的表達升高能促進更多的結合態IAA水 解成游離態IAA，釋放出更多的游離態IAA來補充體內被破壞的IAA，維持植物必需的生理 活動。本發明揭示了應答H2O2的miRNA-528在植物應對氧化脅迫所起的重要作用。將 miRNA-528基因轉入水稻中過量表達或將miRNA-528基因缺失，就可能獲得在耐受氧化脅 迫能力方面有明顯變化的轉基因植株，并有望通過改造獲得對氧化脅迫、干旱、高鹽等有較 強耐受性的植株，造福于農業生產。


圖1為Northern雜交檢測不同濃度H2O2處理的水稻幼苗中miRNA-528的表達。圖2為miRNA-528的的靶基因5’ RACE驗證；序列上方的箭頭表示發生切割的位 點，數值表示該切點處發生切割的克隆數與克隆總數比值。圖3為實時定量RT-PCR檢測靶基因的表達；誤差桿表示相對標準偏差。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中所用水稻品種均為秈稻品種93-11 (Oryza sativa L. ssp indica cv. 93-11)，水稻種子購自國家農作物種質保存中心(中國農業科學院作物科學研究所，郵 編100081聯系電話010-68919715)。該水稻品種已經由中國北京基因組研究所完成基因
組測序工作。實施例1、miRNA-528的發現一、H2O2 處理水稻種子經表面消毒后，37°C浸泡24h，然后催芽萌發45h。萌發后將水稻轉移 到光照培養箱中，培養箱條件設定為溫度28°C /21 V (白天16h/夜晚8h)，光照強度 400μ mol/m2 · s，相對濕度70%，由Hogland營養液提供水稻生長所需的全部營養，營養液 每2天更換一次。12天齡的水稻幼苗采用H2O2處理分別浸泡在0. 6mM、3. OmM和15. OmM H2O2水溶 液中，將浸泡在蒸餾水中的水稻幼苗作為對照；各種處理的幼苗同時置于25°C搖床中處理 6h。處理完畢后，將各個處理的水稻樣品按0. 5g分裝，液氮速凍后保存于-80°C備用。二、miRNA-528 的發現1、RNA 提取將水稻樣品在液氮中研磨，用TRIZOL試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，操作步驟 按TRIZOL試劑盒自帶的說明書進行。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(Amersham Biosciences)測定提取的RNA在260nm(OD26tl)和280nm(OD28tl)波長的吸光度值以確定RNA 的純度和濃度。質量合格的RNA濃度應在1 μ g/ μ 1以上，OD260/OD280的比值在1. 8-2. 0之 間，且經電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA污染。2、小RNA文庫的構建將質量檢驗合格的水稻幼苗總RNA用于構建小RNA文庫。3種濃度(0. 6mM、3. OmM 和15. OmDH2O2處理的水稻樣品提取的RNA各取10 μ g等量混合，總共30 μ g用于構建水 稻幼苗H2O2處理的小RNA文庫。對照樣品提取的RNA取30 μ g，用于構建水稻幼苗對照小 RNA文庫。小RNA文庫的構建按照Illumina Sample Preparation Protocol文庫構建方 法進行，構建好的文庫采用Solexa高通量測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質量的 18-30nt的小RNA序列(兩個小RNA文庫均獲得了五百多萬條序列)。3、兩個小RNA文庫中應答H2O2的miRNA的鑒定參考之前國外文獻對高通量測序數據分析的成功方法(Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14 :787_799.)，建立一套計算機 分析方法用來發現和鑒定測序數據中的水稻miRNA。①將獲得的兩個小RNA文庫中的 原始序列通過計算機方法去掉3’接頭，并過濾掉序列長度在18nt以下的序列；②通過 SOAP 禾呈序(Li R, Li Y, Kristiansen K, Wang J. SOAP short oligonucleotidealignment program. Bioinformatics, 2008, 24 :713_714.)將序列與水稻 93-11 基因組(http //rice, genomics, org. cn/rice/)進行匹配，保留能與基因組完全匹配的序列，進行后續分析；③ 將與基因組匹配的序列與國際權威的miRNA數據庫miRBase (http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)中公布的水稻miRNA成熟序列及前體序列進行BLAST，從而發現哪些序列來自于已知的水稻miRNA。鑒定出近300個水稻miRNA序列，分屬于100余個miRNA家族。由于高通量測序能給出每個miRNA的測序次數，通過比較水稻幼苗H2O2處理小RNA 文庫和對照小RNA文庫中miRNA的測序數(測序數已經根據小RNA文庫測序總數進行了標 準化)，可以從中發現兩個庫中測序數相差較大的miRNA，這部分miRNA可能就是應答H2O2 的miRNA。基于此方法，比較了兩個小RNA文庫中miRNA的測序數，并采用以下兩個限制條 件來提高發現應答H2O2的miRNA的成功率①miRNA在H2O2處理小RNA文庫或對照小RNA 文庫中測序數要大于100，從而可以保證比較的可靠性；②miRNA在H2O2處理小RNA文庫和 對照小RNA文庫中測序數相對差異要大于30%。發現有7個miRNA家族的測序數存在顯著 差異，可能是應答H2O2的miRNA家族,其中一個為osa_miR528 (miRNA_528 ；miR528)。osa-miR528 的序列如下(5，— 3，) :UGGAAGGGGCAUGCAGAGGAG (序列 1)。H2O2處理小RNA文庫的測序次數(Q11202)為1915，對照小RNA文庫的測序次數(Q5iffi) 為2953，相對差異(0腦2/0對照-1)\100%為-35· 2%0三、miRNA Northern 雜交為了進一步驗證osa_miR528具有應答H2O2的表達模式，采用miRNA Northern雜 交檢測幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. 0,15. 0mM)miRNA的表達情況。1、制備探針檢測osa-miR528 的探針(5，一 3，)的序列CTCCTCTGCATGCCCCTTCCA。采用T4多聚核苷酸激酶(New England Biolabs)對上述序列末端磷酸基團進行 同位素(Y -32P ATP)標記，得到探針，用Microspin G-25柱(GE Healthcare)純化探針，去 除未標記的同位素，純化后的探針用于Northern雜交。2、miRNA Northern 雜交Northern雜交中，每個泳道上樣量為20 μ g低分子量RNA，TO基因作為內參，與 miRNA在同一張膜上檢測。TO基因的探針序列為TATGCGTGTCATCCTTGCGCAG。(1)分別提取步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。(2)采用 Park 等報道的 PEG8000/NaCl 沉淀法(Park W, Li J, Song R, MessingJ， Chen X. CARPEL FACTORY,a Dicer homolog, and HENl, a novel protein,act inmicroRNA metabolism in Arabidopsis thaliana. Curr. Biol.，2002，12 :1484_1495.)從總 RNA 中富 集低分子量RNA (有利于提高miRNA的檢測能力)。(3) miRNA Northern 雜交①富集的低分子量RNA溶于DEPC水，再加入等體積的2 X RNA上樣緩沖液(95%甲 酰胺，18mM EDTA, 0. 1 %溴酚藍和0. 1 %二甲苯青)，混合后95°C變性5min，得到RNA樣品。②RNA樣品用15%尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后用電轉移裝置 (BIO-RAD)轉移到 Hybond N+尼龍膜(Amersham Biosciences)上。③轉移有RNA樣品的尼龍膜經6XSSC溶液短暫漂洗，紫外交聯 (Stratagene) 5min,再80°C烘烤2h，使RNA完全固定在尼龍膜上。④將轉移了 RNA的尼龍膜放入雜交管中，加入5ml ULTRAhyb-Oligo雜交液 (Ambion)在雜交爐中42°C預雜交2h，然后加入探針，混勻，42°C雜交過夜。⑤雜交結束后，小心倒出雜交液，加入含0. 5% SDS的2XSSC溶液，42°C洗滌三次，每次IOmin。⑥洗膜結束后，將膜用保鮮膜包裹，平整壓于X光片下，附加增感屏，-70°C曝光1 周。⑦曝光結束后，沖洗X光片，進行光密度掃描，以對照組的雜交信號為1，計算各個 處理組雜交信號的相對強度。結果見圖1。Northern雜交結果和測序數據很吻合，OSa-miR528受H2O2抑制表達。實施例2、應答H2O2的miRNA的靶基因預測與驗證由于植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學方法預測 osa-miR528的靶基因。采用Schwab等描述的方法預測miRNA的靶基因(Schwab R，Palatnik J F, Riester Μ,Schommer C, Schmid Μ,Weigel D. Specific effects ofmicroRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell, 2005,8 :517_527.)。使用 Patscan程序在水稻 93-11 全長 cDNA和基因庫(http://rice. genomics, org. cn/rice/)中尋找能與miRNA序列近乎完全互 補的cDNA或基因，即為miRNA的靶標；參數設置為=Patscan程序參數為默認設置，允許最 大錯配數為3個，miRNA的第10和11位堿基不允許有錯配，靶標的功能通過NCBI (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。預測結果見表1。表losa-miR528的靶基因及功能 注(丨)表示在H2O2處理下表達量下調；bNB，Northern雜交分析得出的結果。osa-miR528 的革巴標是 IAA-丙氨酸抗性蛋白 1 (IAA—alanine resistance proteinl ；IAR1)基因 0s08g0467400 (GENBANK ACCESSION NO. 0s08g0467400 ；見序列表的 序列3;0s08g0467400編碼的蛋白質如序列表的序列2所示)。IAA(吲哚乙酸)是植物 重要的生長激素，在植物體內，大多數IAA是以結合態的形式存在，結合態的IAA比較有 利于儲存、運輸以及避免受到氧化破壞(Bartel B. Auxin biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.，1997,48 :51_66· )。IARl 則在調節游離態和結合態 IAA 的平 衡中起重要作用，IARl能夠促進結合態的IAA水解，釋放出游離態ΙΑΑ，從而調節植物的生 長以及維持植物重要的生理活動(Lasswell J，Rogg L E，Nelson DC, Rongey C，Bartel B. Cloning and characterization of IARl, a gene requiredfor auxin conjugate sensitivity in Arabidopsis. Plant Cell, 2000，12 :2395_2408.)。實施例3、miRNA對靶基因mRNA的切割osa-miR528對靶基因0s08g0467400 (見序列表的序列3)mRNA的切割用5，RACE TjfeiHiT^ilH (Jones-Rhoades M W, Bartel D P. Computational identification ofplant miRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 2004,14 787-799.)。靶基因mRNA被miRNA切割后，其較為穩定的3’切割產物5’端核苷酸磷酸集團暴露，用T4RNA連接酶在該切割產物5’端連接上5’ RACE專用接頭；通過反轉錄反應合 成cDNA ；通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進行第一輪PCR，靶基 因特異的巢式內引物和試劑盒所帶的巢式內引物進行第二輪PCR;將5’RACE獲得的PCR產 物連接到PMD 19-T載體后測序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點。1、分別提取實施例1的步驟一制備的各水稻樣品的總RNA。2、按 Firstchoice RLM-RACE 試劑盒(Ambion)操作說明進行 5，RACE。靴基 因0s08g0467400特異的巢式外引物的序列為GCGTGATTCAACTTGGCCTTGTCG，靶基因 0s08g0467400 特異的巢式內引物的序列為ATGATCATGTGTATGAGAATGCCCTCC。3、PCR產物進行瓊脂糖電泳，回收540bp左右的特異條帶(圖2中泳道1所示)。4、將回收的PCR產物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，并轉化大腸桿菌 DH5α (TaKaRa)。5、挑單克隆測序，根據測序結果確定靶基因mRNA的切割位點。測序結果顯示的切割位點見圖2。osa-miR528的靶基因在與其互補的區域發生了 切割，這個結果強有力的證明了 0s08g0467400確實是OSa-miR528體內真正調控的靶基因。 (圖2中，有三個切割位點，切割概率比為1 1 8)。實施例4、靶基因的表達量分析為了進一步考察OSa-miR528的功能，用實時定量RT-PCR分別檢測靶基因 0s08g0467400在幾種H2O2處理濃度下(0、0. 6,3. O、15. OmM)的水稻幼苗中的表達情況。1、分別提取實施例1的步驟一制備的各水稻樣品(2g)的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa)，室溫放置30min以除去基因組DNA的污染。3、加入終止緩沖液(50mM EDTA)后，70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、采用TaKaRa RNA PCR Kit，用RNA合成cDNA模板，操作按試劑盒說明書進行。Power SYBR Green PCR Master Mix(Appl ied Biosystems) ^t iCycler iQ5Multicolor實時定量PCR檢測儀(Bio-Rad)上進行PCR擴增反應，通過比較Ct值 法(Δ Δ Ct {t ^ )(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR. Methods,2001,25 383-385.)計算靶基因在不同樣品中的相對表達量(對照組基因的表達量設定為1)。靶 基因的檢測設置3個重復，結果取平均值。以水稻β-tubulin基因作為內參(Zhao B， Ge L, LiangR, Li W, Ruan K, Lin H, Jin Y. Members of miR-169 family are induced by highsalinity and transiently inhibit the NF-YA transcription factor. BMC Mol. Biol. ，2009，10 :29·)。擴增靶基因0s08g0467400的引物如下(5，— 3，)上游引物GCGGTCGCTAGCCCTAATGCGC；下游引物CTCCGCGAGCTCCTCGGGGAGA。擴增β -tubulin基因引物如下(5，— 3，)上游引物CCTCCAAGGATTTCAAGTCTGC；下游引物TTGTAAGGTTCCACCACGGTA。結果見圖3。靶基因0s08g0467400在H2O2處理下表達量發生了明顯的變化，通過 和osa-miR528的表達(圖1)進行比較，發現0s08g0467400的表達和osa_miR528的表達 呈現出明顯的負相關性，即oSa-miR528表達上調的時候，0s08g0467400的表達就相應下調，這與miRNA對靶基因的負調控作用是完全一致的。實時定量PCR的結果進一步證明了 0s08g0467400 確實是 osa_miR528 的靴基因。
權利要求
序列表的序列1所示的RNA。
2.序列1所示RNA在抑制IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因表達中的應用；所述IAA-丙氨 酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3所示。
5.序列1所示RNA在促進IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因的mRNA降解中的應用；所述 IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3自5’末端第126至1622位核苷酸所示。
7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表 的序列3所示。
8.序列表的序列1所示的RNA在水稻種質改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種應答H2O2的miRNA-528及其應用。本發明保護的miRNA-528是序列表的序列1所示的RNA。本發明還保護序列1所示RNA在IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因表達和/或促進IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因的mRNA降解中的應用；所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1如序列表的序列2所示，所述IAA-丙氨酸抗性蛋白1基因如序列表的序列3所示。應用miRNA-528有望獲得對氧化脅迫、干旱、高鹽等有較強耐受性的植株，造福于農業生產。
文檔編號C12N15/113GK101892234SQ201010221440
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月29日 優先權日2010年6月29日
發明者劉進元, 李甜 申請人:清華大學