專利名稱：一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17 及其基因和應用。
背景技術：
α -半乳糖苷酶或蜜 二糖酶(a -D-galactoside galactohydrolase, EC 3. 2. 1. 22)是一種外切型糖苷酶，能夠催化α _D_半乳糖苷類化合物中的α _D_半乳糖殘基 的水解。這類糖苷包括半乳糖寡糖(如蜜二糖、棉子糖和水蘇糖)、分支多糖(如半乳甘露 聚糖)和半乳糖脂(Margolles-Clark E, et al. Eur J Biochem, 1996,240(1) :104_11·)。目前，已通過多種純化技術從真菌、細菌、酵母、植物和人中分離得到α-半乳糖 苷酶。不同來源的α-半乳糖苷酶其理化性質存在極大的差異。植物來源的α-半乳糖苷 酶根據其作用PH的不同分為酸性α-半乳糖苷酶和堿性α-半乳糖苷酶。真菌和酵母來 源的α-半乳糖苷酶的作用最適ρΗ在3. 0-6.0之間，而細菌來源的α-半乳糖苷酶則比真 菌有更高的最適PH(5. 0-7. 5)(李孝輝等，微生物學通報，2002，29 :71_74.)。根據氨基酸序 列相似性，α-半乳糖苷酶被劃分到四個不同的糖苷水解酶家族中，即4家族，27家族，36 家族和57家族。研究最多的α -半乳糖苷酶分布于27家族和36家族，真菌來源的α -半 乳糖苷酶多數屬于27家族，而36家族的α-半乳糖苷酶多數來源于細菌(Henrissat，et al.Biochem J,1993，293 :781_788·)。棉籽糖家族寡糖(RFOs，主要是棉籽糖和水蘇糖)是食品和飼料中(特別是豆類) 的抗營養因子。外源α-半乳糖苷酶的添加可以經濟有效地去除這種抗營養因子。此外， 食品及飼料工業中還要求添加的α-半乳糖苷酶對各種α-半乳糖苷類寡糖都要具有較高 的水解能力，而以前報道的α-半乳糖苷酶不能水解多種底物，在應用上各具有其局限性。 不同來源的微生物α“半乳糖苷酶根據其性質特性的不同被應用于不同的領域。本發明得到了一個來源于天牛胃腸道共生菌Flavobacterium sp. TW7的α -半 乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶具有低溫特性，作用ρΗ范圍較廣，良好的抗蛋白酶 能力，較好的水解各種底物的能力，該酶作為一種新型的酶制劑，可廣泛的應用于飼料、食 品、醫藥等行業。
發明內容
本發明的目的是提供一種能高效應用的低溫α -半乳糖苷酶。本發明的再一目的是提供編碼上述低溫α -半乳糖苷酶的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明的另一目的是提供一種制備上述耐低溫α “半乳糖苷酶的基因工程方法。本發明的另一目的提供上述低溫α-半乳糖苷酶的應用。本發明從天牛腸道分離菌(Flavobacterium sp. TN17,其保藏號為CGMCCNo. 4009)中分離得到一種新的低溫α -半乳糖苷酶GalA17。根據本發明的低溫α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示:mkkhitnlrqsfgiaffνlasycspvsaqqiisvktksnalvlqvtpgkelntiyIgeklandfdyvki qgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknllepaiavthadgntsldlIyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlf iqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnkyasanlylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsra nlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfaglewsgnfrtdieIdplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytls skgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrltllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnd daalgdwdvnkkklpngigtlvktakdnqvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnp kvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcnaviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggg grvdyaamkyftefwpsdntdplervymqweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnek dltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlqnpwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqn ykveeinvypdkkpwetatysgdflmqvginpnvnstntsvvlkitka其中，該酶基因編碼734個氨基酸，N端28個氨基酸為其預測的信號肽序列“mkkh itnlrqsfgiaffvlasycspvsa" (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的低溫α -半乳糖苷酶GalA17的理論分子量為80. OkDa，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示qqiisvktksnalνlqvtpgkelntiylgeklandfdyvkiqgqfkqgtdysgiynaaytpsgsknlIe paiavthadgntsldlIyvdhktttvstgvsqteitlkdnvypievhlfiqsyydtdiieqwttikhaekgnitlnk yasanIylkgynnfylnqyhgdwakemqpeesklthgikvldtklgsranlfqpsvfmvsldkpateddgkvlfagl ewsgnfrtdieIdplnnlrvisginnaaaayslakntvfttpkfwytlsskgkghasrnlhdwsrnykildgkgsrl tllnnweatyfnfdedklkvliadskklgvdmfllddgwfgnnfprnnddaalgdwdvnkkklpngigtlvktakdn qvkfgiwiepemvnpasdlykkhpewivkqpgrtehyfrnqlvldlsnpkvqdfvygvvdnlftenpelayikwdcn aviynayssnlkdkqnnfytdyvtglykvlerirvkyptvpmmlcsggggrvdyaamkyftefwpsdntdplervym qweysyfypaltiaahvtdwgkqpikyrtdvammgrlgfdivvkdlnekdltfaqqaiknynalsntiwqgdqyrlq npwgndaasvmfvnksgneavvfsysvnsryeagthlpiklkglqagqnykveeinvypdkkpvvetatysgdfImq vginpnvnstntsvvlkitka本發明的0-半乳糖苷酶6&認17的最適？!1值為5.5，最適溫度為451，在 30°C-50°C間均具有55%以上的酶活力；用胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、膠原蛋白酶處理60分 鐘，酶活性維持在90% ；具有多種底物的降解能力。本發明提供了編碼上述低溫α-半乳糖苷酶GalA17。具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO. 4所示
ATGAAAAAACACATTACCAATTTAAGGCAATCTTTTGGGATCGCATTTTTTGTGCTGGCGAG TTATTGCAGCCCGGTTTCGGCGl CAACAAATTATCTCAGTAAAAACAAAAAGTAATGCGCTTGTTTTGCAAGT TACTCCCGGAAAAGAGTTGAACACTATTTACTTAGGAGAAAAATTAGCCAATGATTTTGATTATGTAAAAATACAAG GACAGTTCAAACAAGGAACAGATTATTCAGGAATTTACAATGCAGCATATACACCATCTGGTTCTAAAAACTTATTA GAACCTGCAATTGCAGTAACACACGCTGACGGAAATACTTCGCTGGATTTATTATACGTAGATCAIAAAACGACTAC GGTAAGTACAGGAGTTTCTCAAACTGAAATTACCTTAAAAGACAATGTTTATCCAATTGAGGTTCATTTGTTTATTC AGTCTTACTATGATACTGATATTATAGAGCAATGGACAACGATTAAACATGCTGAAAAAGGAAATATTACTTTAAACAAATATGCTTCGGCTAATTTATATCTTAAAGGATATAACAATTTCTATTTGAATCAATATCACGGAGACTGGGCAAA AGAAATGCAGCCTGAAGAAAGCAAATTAACTCACGGAATTAAAGTGTTAGAIACTAAATTAGGTTCACGTGCGAATT TGTTTCAGCCTTCAGTATTTATGGTTTCTTTAGACAAACCAGCTACAGAAGATGACGGAAAAGTGTTATTTGCAGGT TTAGAATGGTCAGGAAATTTCCGTACAGATTTAGAATTAGATCCATTAAATAATCTTCGTGTTATTTCTGGTATTAA IAATGCAGCGGCAGCTTATTCTTTAGCTAAAAACACTGTATTTACAACTCCAAAATTTTGGTAIACTTTATCTTCTA AAGGAAAAGGACATGCAAGCCGTAACTTACACGACTGGTCAAGAAATTAIAAAATATTAGACGGAAAAGGAAGCCGT TTAACTTTGCTAAACAACTGGGAAGCTACTTATTTTAATTTTGATGAAGATAAACTAAAAGTGCTTATCGCTGAIAG TAAAAAACTTGGCGTTGATATGTTCTTATTAGATGACGGATGGTTCGGAAACAATTTTCCTCGTAACAATGACGACG CAGCTCTTGGAGACTGGGACGTAAACAAAAAGAAATTACCAAACGGAATCGGTACTTTGGTAAAAACAGCTAAAGAC AATCAGGTAAAATTCGGAATCTGGATTGAGCCGGAAATGGTAAACCCAGCGAGTGATTTGTATAAAAAACATCCGGA ATGGATTGTGAAACAACCGGGAAGAACGGAGCATTATTTCCGTAATCAATTGGTTTTAGATTTATCAAACCCTAAAG TTCAGGATTTTGTTTACGGAGTTGTAGACAATCTTTTTACAGAAAACCCGGAATTGGCGTATATCAAATGGGATTGT AATGCAGTAATTTACAACGCATATTCAAGCAATTTAAAAGACAAACAAAACAATTTCTATACAGATTATGTAACAGG ATTGTAIAAAGTTTTAGAGCGTATTCGTGTAAAATACCCTACAGTACCTATGATGCTTTGCTCTGGTGGTGGTGGTA GAGTAGATTATGCTGCAATGAAATACTTTACAGAATTCTGGCCAAGTGAIAACACAGATCCTTTAGAAAGAGTATTA TGCAATGGGAATACTCGTATTTTTACCCGGCTTTGACCATCGCAGCTCACGTAACAGATTGGGGAAAACAACCTATA AAATACCGTACAGATGTTGCCATGATGGGAAGATTAGGTTTTGATATTGTGGTAAAAGATTTAAACGAGAAAGATTT GACTTTTGCTCAACAAGCGATCAAAAATTATAATGCATTAAGCAACACAATCTGGCAAGGAGATCAATACCGTTTGC AAAATCCTTGGGGTAATGACGCGGCGTCTGTAATGTTTGTAAACAAAAGCGGAAACGAAGCAGTTGTATTTAGTTAT TCTGTTAATTCAAGATACGAAGCAGGAACACATCTTCCTATAAAATTAAAAGGATTACAAGCAGGACAAAACTATAA AGTAGAAGAAATCAACGTATATCCGGATAAAAAGCCTGTGGTAGAAACTGCGACTTATTCTGGTGATTTTTTAATGC AGGTTGGTATCAACCCGAATGTAAATTCTACTAATACGAGCGTTGTTTTAAAAATTACAAAGGCCTAA本發明通過PCR的方法分離克隆了 α -半乳糖苷酶基因galA17，DNA全序列分析 結果表明，α-半乳糖苷酶GalA17結構基因galA17全長2205bp。其中，信號肽的核苷酸序 列為ATGAAAAAACACATTACCAATTTAAGGCAATCTTTTGGGATCGCATTTTTTGTGCTGGCGAGTTATTGC AGCCCGGTTTCGGCG(SEQ ID NO. 5)。將α-半乳糖苷酶基因galA17序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行 BLAST比對。該基因與Pedobacter sp. BAL39來源的潛在α -半乳糖苷酶(EDM38577)具有 最高的一致性，為66. 6% ；與確證活性的Carnobacterium piscicola BA來源GH36 α -半 乳糖苷酶(AAL27305)的一致性為30. 1%。說明GalA17是一種新的α -半乳糖苷酶。本發明還提供了包含上述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組載體，優選為 pET_galA17。將本發明的α -半乳糖苷酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之 間，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發 明的α -半乳糖苷酶基因插入到質粒pET_22b(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位點之間， 得到大腸桿菌表達質粒pET-galA17。本發明還提供了包含上述低溫α -半乳糖苷酶基因galA17的重組菌株，優選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株BL21/galA17。本發明還提供了一種制備低溫α -半乳糖苷酶GalA17的方法，包括以下步驟
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組α -半乳糖苷酶表達；以及3)回收并純化所表達的α -半乳糖苷酶GalA17。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大 腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21/galA17。本發明還提供了上述α-半乳糖苷酶GalA17的應用。本發明提供了一個新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶最適ρΗ在 中性范圍(ΡΗ5. 5)，ρΗ穩定性在中性ρΗ內最佳，最適溫度較低(45°C)且在較低溫度(10°C ) 具有活性，熱穩定性較差(<50°C但都能在37°C穩定)。這些共同特征可能與天牛生存環 境(體溫隨自然環境溫度而變，但不低于0°C、不高于40°C)及腸道生理環境(腸道內容物 PH為6. 5)密切相關。多種蛋白酶抗性(胰蛋白酶、膠原蛋白酶和α-糜蛋白酶)，可以有效 地水解角豆膠、瓜爾膠和豆粕，表明GalA17在食品和飼料添加劑方面具一定的應用潛力。
圖1在大腸桿菌中表達的重組α -半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分 子量蛋白質Marker ;1 含有α _半乳糖苷酶基因的大腸桿菌培養上清液；2 純化的重組 α -半乳糖苷酶3 含有空載體的大腸桿菌培養上清液；圖2重組α -半乳糖苷酶的最適ρΗ。圖3重組α -半乳糖苷酶的ρΗ穩定性。圖4重組α -半乳糖苷酶的最適溫度。圖5重組α _半乳糖苷酶的熱穩定性。黃桿菌Flavobacterium sp. i7，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏 號為CGMCC No. 4009。
具體實施例方式試驗材料和試劑1、菌株及載體黃桿菌Flavobacterium sp. i7，保存于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)， 其保藏號為CGMCC No. 4009。大腸桿菌表達載體pET22b (+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3)購于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養基(1)產纖維素酶細菌篩選培養基=Peptone 10g, NaCl 5g, Yeast extract 0. 5g, CMC 5g，剛果紅 0. 2g，MnS04 ·5Η20 0. 02g，MgSO4 · 7H20 0. 4g，ZnSO4 · 7H20 0. Olg，CuSO4 · 5H20 0. Olg, FeSO4 · 7H20 0. lg，CaCl2 · 2H20 0. lg，K2HPO4O. 5g，瓊脂 20g，加蒸餾水至 1000ml，ρΗ 自然(約為7)。(2) LB 培養基 ^ptone 10g，Yeast extract 5g, NaCl IOg,力口蒸餾水至 1000ml，PH自然(約為7)。固體培養基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。實施例1 黃桿菌 Flavobacterium sp. TN17 的篩選利用剛果紅法對天牛胃腸道內的共生微生物進行纖維素酶及半纖維素酶的產酶 活性初篩。產酶越多或酶活越高，水解圈越大；產酶越快，水解圈出現越早。平板上一共隨 機挑取了 100株細菌。提取該100株細菌的基因組并擴增得到了 16S rDNA。經BLASTn比 對后，菌株TW7屬于黃桿菌屬，定名為黃桿菌Flavobacterium sp. TN170實施例2黃桿菌Flavobacterium sp. TN17 α -半乳糖苷酶編碼基因galA17克隆提取Flavobacterium sp. TN17 基因組 DNA 將液體培養Id的菌體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇， 于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真 空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。 根據第36家族α -半乳糖苷酶基因的保守([F/L/V] -[L/V] -[L/M/V] -D-D-G-ff-F 和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E])序列設計合成了簡并引物 GH36F，GH36RGH36F 5' -GACATGTTCGTGATGGACGAYGGNTGGTT-3‘；GH36R 5' -CGGACTCTGGGTTCACCATYTCNGGYTC-3‘)。以Flavobacterium sp. TN 17總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為94°C 變性5min ；然后94°C變性30seC，44°C退火30seC，72°C延伸lmin，30個循環后72°C保溫 IOmin0得到一約193bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術有限 公司測序。根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各二條TAIL-PCR特異性引物設計 方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在spl的內側。每兩個引物之間的距離沒 有嚴格規定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl， usp2(上游特異性引物)，dspl, dsp2(下游特異性引物)見表1。表1. α -半乳糖苷酶GalA17TAIL_PCR特異性引物
引物名稱引物序列(5'-3')引物長度(bp)usplTACCAAAGTACCGATTCCGTTT22usp2AGAGCTGCGTCGTCATTGTTA21dsplAATGACGACGCAGCTCTTGG20dsp2ACGGAATCGGTACTTTGGTAAA22
通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收后送三博生物 技術有限公司測序，經拼接后得α “半乳糖苷酶編碼基因galA17的序列如SEQ IDN0. 4所示。實施例3重組α -半乳糖苷酶的制備。將表達載體pET22b⑴進行雙酶切(BamHI+HindlII)，同時將編碼α -半乳糖苷酶 的基因galA17雙酶切(BamHI+Hindlll)，切出編碼成熟α -半乳糖苷酶的基因片段與表達 載體pET22b (+)連接，獲得含有Flavobacterium sp. TN17 α -半乳糖苷酶的基因galA17的 重組質粒pET-galA17并轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌菌株BL21/galA17。取含有重組質粒pET-galA17的E. coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET_22b (+)空 質粒的E. coli BL21(DE3)菌株，以0. 1 %的接種量接種于LB (含100 μ g/mLAmp)培養液中， 37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以接種量接種到新鮮的LB (含100μ g/mLAmp) 培養液中，快速振蕩培養約2-3h (OD600達到0. 6-1. 0)后，加入終濃度0. 7mM的IPTG誘導， 于20°C繼續振蕩培養約20h或26°C振蕩培養約8h。12000rpm離心5min，收集培養基上 清。依次利用中空纖維超濾膜和超濾膜包(分子篩原理)對該初酶液進行濃縮。以上胞外 濃縮的初酶液經13，OOOrpm離心IOmin后，吸取上清并用Nickel-NTAAgarose純化目的蛋 白。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組α-半乳糖苷酶在大腸桿菌中得到了表達。所表達的 α-半乳糖苷酶經過純化之后，其蛋白質的含量達到總蛋白的90%以上。實施例4重組α -半乳糖苷酶的活性分析酶活性測定方法采用pNPG法。將pNPG溶于0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 中，使其終濃度為2mmol/L。反應體系含20 μ L適量酶液，230 μ L的IOOmM緩沖液和250 μ L 的2mmol/L底物。底物在反應溫度下預熱5min后，加入酶液再反應5min，然后加1. 5mL IM Na2CO3終止反應，冷卻至室溫后在405nm波長下測定釋放出的pNP。1個酶活單位⑶定義 為每分鐘分解PNP類化合物產生1 μ moIpNP所需的酶量。實施例5重組α -半乳糖苷酶GalA17的性質測定1、重組α -半乳糖苷酶GalA17的最適pH和pH穩定性的測定方法如下酶的最適pH測定將實施例4純化的重組α-半乳糖苷酶GalA17在37°C和 PHI. 0-12. 0的緩沖液下進行酶促反應。酶的pH穩定性測定將純化的酶液置于pHl. 0-12. 0 的緩沖液中，在37°C下處理Ih以上，然后在pH5. 5及37°C下進行酶促反應，以未處理的酶 液作為對照。緩沖液為0. IM KCl-HCl (pHl. 0-2. 0)，McIlvaine buffer (pH2. 0-8. 0)，0· IM Tris-HCl (ρΗ8. 0-9. 0)和 0. IM glycine-Na0H(pH9. 0-12. 0)。以 pNPGal 為底物，在 37°C下反 應5min，測定純化的GalA17的酶學性質。結果表明GalA17的最適pH為5. 5，在pH5. 0-7. 0 之間，酶活> 55% (圖2)；經pH5. 0-9.0的緩沖液37°C處理Ih后，剩余活性> 80% (圖 3)。2、重組α -半乳糖苷酶GalA17的最適溫度及熱穩定性測定方法如下酶的最適溫度測定在pH5. 5的緩沖液中，于0-80°C下進行酶促反應。酶的熱穩 定性測定將同樣酶量的酶液置于設定的溫度中(37°C，50°C或60°C )處理0-60min后，在 PH5. 5及37°C下進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。在45°C時，GalA17的酶活最高， 在30-50°C間具有> 55%的酶活(圖4)；經37°C處理Ih后，GalA17仍較穩定，而60°C處理 5min后，GalA17完全變性(圖5)。
3、重組α -半乳糖苷酶GalA17的Km值測定方法如下酶的動力學參數測定一級反應時間在pH5. 5及45°C下，以IM pNP類化合物作為 底物，依次在酶促反應的2-30min內終止反應并測定酶活性，計算出酶活性與反應時間的 比值，若在一定時間內該比值保持穩定，則此時間為一級反應時間。用0. 05-1ΜρΝΡ化合物 作為底物，在pH5. 5、45°C和一級反應時間下，根據Lineweaver-Burk方法測定Km、Vmax和 kcat。在 450C ρΗ5· 5 條件下，GalA17 對 pNPGal 的 Km、Vmax 和 kcat 分別為 2. 47mM、476. 19 μ mol mirTW1 和 654. 62s-1。4、不同金屬離子化學試劑對GalA17酶活的影響測定方法如下在酶促反應體系中加入IOmM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。在 37°C、ρΗ5· 5條件下測定酶活性。結果表明，IOmM的Ag+、Hg2+和SDS可完全抑制GalA17 ； Fe2+對GalA17的抑制較強(剩余酶活 30% )，Cr3+對GalA17的抑制較弱(剩余酶活 75% ) ；Mn2+、β -mercaptoethanol、Zn2+ 和 EDTA 可使 GalA17 的酶活提高 0. 2 倍；其余金 屬離子和化學試劑對GalA17的影響很小。5、α-半乳糖苷酶GalA17的抗蛋白酶能力酶的蛋白酶抗性用相當于重組酶1/10 (w/w)的胰蛋白酶(ρΗ7.0)、α-糜蛋白酶 (ρΗ7. 0)或膠原蛋白酶(ρΗ7. 5)在37 °C對重組酶處理Ih，然后在pH5. 5及37 °C下進行酶促 反應，以在蛋白酶對應PH緩沖液中但未加蛋白酶的酶液作為對照。經胰蛋白酶、膠原蛋白 酶和α -糜蛋白酶處理Ih后，GalA17仍能分別保持98. 56%,95. 64%和92. 79%的酶活。 從以上結果可以看出GalA17對這三種蛋白酶都有良好的抵抗能力。5、α -半乳糖苷酶GalA17的底物特異性在37°C PH5. 5條件下，GalA17對pNPGal、水蘇糖、蜜二糖、棉籽糖、豆粕、角豆膠 和瓜爾膠的比活分別為 92. 95士4. 14,51. 22士0. 85,2. 52士0. 06,0. 84士0. 26,0. 87士0. 16、 0. 49 士 0. 07 和 0. 20 士 0. 04U mg-1。
權利要求
一種低溫α 半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權利要求1所述的低溫α-半乳糖苷酶GalA17，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.—種低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其編碼權利要求1或2所述的 低溫α-半乳糖苷酶GalA17。
4.如權利要求3所述的低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 4。
5.如權利要求3所述的低溫α-半乳糖苷酶基因galA17，其特征在于，所述α_半乳 糖苷酶基因galA17的信號序列如SEQ ID NO. 5所示。
6.包含權利要求3或4所述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組載體。
7.包含權利要求3或4所述低溫α-半乳糖苷酶基因galA17的重組菌株。
8.如權利要求7的重組菌株，其特征在于，其所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌 或乳酸桿菌。
9.一種黃桿菌 Flavobacterium sp. Tm7，其保藏號為CGMCC No. 4009。
10.權利要求1或2所述低溫α-半乳糖苷酶GalA17的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫α-半乳糖苷酶GalA17及其基因和應用。本發明提供了一種來源于天牛胃腸道共生細菌Flavobacterium sp.TN17的α-半乳糖苷酶GalA17，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，且本發明提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的編碼基因galA17。本發明的α-半乳糖苷酶具有以下性質最適pH5.5，最適溫度45℃，在30-50℃間具有＞55％的酶活；良好的pH穩定性；良好的蛋白酶抗性和較好的水解各種底物的能力；可作為一種飼料或食品添加劑應用于飼料與食品行業。
文檔編號C12N1/21GK101892207SQ20101023853
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者周峻沛, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 趙珩, 黃火清 申請人:中國農業科學院飼料研究所