生物芯片及其制備方法

專利名稱：生物芯片及其制備方法
技術領域：
本發明涉及微機電系統(MEMS)和細胞生物學技術領域，特別是涉及一種生物芯 片及其制備方法。
背景技術：
結合生物技術和微機電系統技術的生物微機電系統(Biology-Micro Electromechanical System，簡稱Bio-MEMS)技術可以將生命科學研究中的不連續分析過 程(如樣品制備、化學反應和分析檢測)實現連續化、集成化、微型化，從而獲得所謂的微全 分析系統。該系統包括進樣、分離、反應和檢測，廣義的系統還涉及到輸運，其最終目標是在 微芯片上實現化學全分析，以之取代常規分析實驗室的所有功能。與傳統儀器相比，微全分 析系統具有體積小、重量輕、成本低、便攜帶、防污染、分析過程自動化、分析速度快、所需樣 品和試劑少等諸多優點，對生物學、分析化學、醫學等相關領域產生了革命性的影響，成為 MEMS技術研究中的重要領域。間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)具有多項分化潛能，成為組織工程 和再生醫學領域非常重要的細胞供體。它不僅在基礎科學研究領域具有廣泛的應用，也存 在巨大的臨床應用潛力。目前人們通常從骨髓或脂肪組織中分離MSC。因為抽取骨髓和脂 肪對人體有一定影響，因此MSC的供體較少，限制了 MSC的應用。近來，人們發現臍帶血中 也有較多的MSC，嬰兒出生后臍帶血即成為廢棄物，因而來源豐富，可解決MSC供體不足的 問題，但是臍帶血MSC的分離和擴增存在以下問題1、從臍帶血中分離的MSC經常混有破骨細胞(OsteoclasticCell，0C)常用的從臍帶血中分離MSC的方法是用密度梯度離心分離方法，利用臍帶血中各 種細胞密度的差異，將MSC分離出來。但是這樣分離出來的細胞并不是純粹的MSC，而是一 類稱為單個核細胞的細胞。這類細胞中混有0C。破骨細胞OC較大，生長較快，與MSC搶奪 資源，必須去除。通常的去除方法是用差速消化法，即在原代細胞在培養瓶中貼壁后，利用 OC與培養基底粘附較緊的特性，采取較短的消化時間，使MSC與OC分離。2、差速消化法增加消化次數，對細胞會造成額外的損傷消化是用胰蛋白酶等試劑處理細胞，令其表面與胞外基質粘附的蛋白分子破壞或 失效，使細胞與基底分離。消化對細胞有傷害，來源于人體的細胞一般只能承受5-10次上 述消化處理。3、分離自臍帶血的MSC數量少需要多次擴增方能達到足夠的數量臍帶血量少，因此分離出的MSC數量亦較少，大約每個供體可以分離出104-105個 MSC0而組織工程或者臨床應用所需的細胞數遠多于此，大約需要107-108個細胞，這就需 要在體外對臍血中分離的MSC進行擴增。由于MSC對生長環境要求較高，需要較大的細胞 密度方能正常生長、增值，因此MSC必須先需接種到小培養孔中以保證細胞密度，待其長滿 培養瓶后，經過數次消化、傳代方能擴增才能達到一定數量。該過程耗時長，最重要的是需 經多次消化，會對細胞的功能、狀態造成不利影響。
綜上所述，解決臍血MSC分離和擴增的問題的關鍵是，降低該過程中所需的消化 次數，在消化次數盡量少甚至不要消化的情況下獲得大量的臍血MSC。

發明內容
(一)要解決的技術問題本發明要解決的技術問題是如何在消化次數盡量少甚至不要消化的情況下獲得 大量的臍血MSC，以實現臍血MSC分離和擴增。(二)技術方案為解決上述技術問題，本發明提供了一種生物芯片，包括離心分離器和富集器，以 及位于離心分離器的中心處的進樣口，所述離心分離器和富集器上分別具有排放口，所述 離心分離器上具有離心分離器出口，所述富集器上具有富集器入口，所述離心分離器出口 與所述富集器入口相連接；其中，所述離心分離器包括渦旋式微流體通道和沿微流體通道內的流體流動方向 布置于所述微流體通道內的若干微立柱，所述微立柱將微流體通道分成內流道和外流道。優選地，所述富集器包括富集單元，所述富集單元的底部具有縫隙或者網格，其大 小設計為使得所要富集的細胞不會從縫隙或者網格流過。優選地，所述富集單元為方形直壁漏斗狀，所述富集單元底部為以一定間隔布置 的梳齒，每個所述梳齒的長度為50-100 μ m，各梳齒之間的距離為5-18um。優選地，所述富集單元的深度為30-150 μ m，寬度為50-150 μ m。優選地，所述富集單元的深度為30-50 μ m。優選地，所述富集單元的入口處內側為直壁，入口處外側為流線形過渡。優選地，所述微流體通道為半圓對扣形式或阿基米德螺線形式，繞行中心處的圈 數至少為5圈，其中心入口所在圈的直徑為500-800 μ m，每圈的寬度為200-400 μ m。優選地，所述微立柱的橫截面為圓形，所述圓形的直徑為6_30μπι。優選地，所述微立柱的橫截面為正方形，所述正方形的邊長為6-30 μ m。本發明還提供了一種生物芯片的制備方法，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50 μ m,形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列；(d)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中 的氣泡；(e)處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；(f)將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，并靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘 烤30-60分鐘；(g)將固化的PDMS切成與具有微流體通道和微富集單元陣列的硅片同樣大小，并 在相應的入口和出口位置打孔；(h)將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理；(i)將PDMS和硅結構按相應的位置進行鍵合，在微流體通道入口和出口安裝金屬管。
本發明還提供了一種生物芯片的制備方法，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50 μ m,形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列的 模具；(d)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中 的氣泡；(e)處理、清洗所述模具，并在其表面涂上脫模劑；(f)將無氣泡的PDMS均澆在模具上，靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤 30-60分鐘；(g)將固化了 PDMS從模具上剝離，并切分每個單元；(h)處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；(i)將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤 30-60分鐘；(j)將固化的PDMS切成與具有微流體通道和微富集單元陣列的硅片同樣大小，并 在相應的微流體通道入口和出口位置打孔；(k)將上下兩個鍵合表面用氧離子處理；(1)將兩片PDMS按相應的位置進行鍵合，在入口和出口安裝金屬管。本發明還提供了一種生物芯片的制備方法，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50 μ m,形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列；(d)將硅片正面與玻璃陽極鍵合，形成硅玻璃片；(e)采用干法、濕法或CMP的方法將鍵合后的硅玻璃片背面的硅結層減薄；(f)硅片背面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(g)深刻蝕出進出樣口和與富集器對應的通孔；(h)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中 的氣泡；處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，并 靜置平坦化，然后在60-10(TC烘箱中烘烤30-60分鐘；(i)將固化的PDMS切成與具有微流道和微富集器陣列的硅片同樣大小，并在相應 的微流體通道入口和出口位置打孔；(j)將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理。(三)有益效果通過微流體通道的設計，本發明生物芯片的結構緊湊，芯片的總面積減小，分離效 率提高。該芯片的分離、富集過程耗時短，支持原位培養，減少細胞消化次數，該芯片還可以 用于其他功能微粒分離。本發明的生物芯片可以取代傳統的細胞分離、富集、擴增的分立方 式，存在巨大的臨床應用潛力。


圖1的(a)-(f)是依照本發明實施例的生物芯片的結構示意圖及其局部放大圖；圖2的(a)-(g)是依照本發明一個實施例的生物芯片制備工藝流程圖；圖3的(a)-(i)是依照本發明另一實施例的生物芯片制備工藝流程圖；圖4的(a)-(h)是依照本發明又一實施例的生物芯片制備工藝流程圖；圖5中a為使用本發明的生物芯片分離和富集人肺腺癌細胞A549(用FITC標記 細胞表面蛋白)富集過程的截圖(放大100倍)；圖5中b為圖5中a所示任一富集區的放大效果圖(放大400倍)；圖5中c為圖5中b所示區域經過一段時間后細胞的富集效果圖(放大400倍)；圖6中a示出了使用本發明的生物芯片分離MSC(放大100倍)時分離前貼壁的 MSC ；圖6中b示出了使用本發明的生物芯片分離MSC(放大100倍)時消化后分離前 的 MSC ；圖6中c示出了使用本發明的生物芯片分離MSC(放大100倍)時分離后外流道 細胞(主要為間充質干細胞中)；圖6中d示出了使用本發明的生物芯片分離MSC(放大100倍)時分離后內流道 細胞(主要為破骨細胞)。其中，1:離心分離器；2:富集器；3:進樣口 ；4:排放口 ；5:離心分離器出口 ；6 富 集器入口 ；7 微流體通道；8 微立柱；9 中心入口 ；10 富集單元；11 硅片；12 膠；13 脫 模劑；14,17 =PDMS ；15 金屬管；16 模具；18 玻璃；71 內流道；72 外流道。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。微機電生物系統(Bio-MEMS)芯片是一種嶄新的技術，其采用微納米加工技術，利 用MSC與OC的尺度差異，和MSC喜聚落生長的性質，探索和開發能實現臍帶血MSC快速分 離、富集、擴增的生物芯片。可以利用芯片上微流道中的結構，對MSC進行富集，目標是使 10-20個MSC聚集成一小團細胞，并將此類小細胞團均勻地分布在培養瓶底部。因為小團細 胞之間互相的黏附、聚集有助于構成MSC生長的微環境，避免因MSC濃度過低造成的培養失 敗。利用這種方法可以在較大培養瓶中培養相對少量的細胞，避免多次消化傳代對細胞造 成不良影響。如圖1中的(a)所示，本發明提供了一種生物芯片，包括離心分離器1、富集器2、 進樣口 3，離心分離器1和富集器2上各有一個排放口 4，離心分離器1具有離心分離器出 口 5，富集器2具有富集器入口 6，所述離心分離器出口 5與所述富集器入口 6相連接。如 圖1中的(b)所示，離心分離器1包括半圓對扣形式或阿基米德螺線形式的微流體通道7， 以及沿所述微流體通道7內的流動方向(即微流體通道的周向)布置于所述微流體通道7 內的的多個微立柱8。如圖1中的(d)和(e)所示，微流體通道7繞行中心處的圈數為至少 5圈，各圈之間的間隔為200-400 μ m,中心入口 9所在圈的直徑為500-800 μ m。微立柱8將 微流體通道7分成內流道71和外流道72，其中內流道與離心分離器的排放口 4相連，外流
7道與離心分離器出口 5相連，同一圈微流體通道7上的相鄰微立柱8的柱面之間的距離為 15-25 μ m,優選為25 μ m。優選地，微立柱8的截面為圓形或正方形。由于圓形的分離效果最 好，因此微立柱8的截面優選為圓形。圓形直徑可取為6-30 μ m,正方形邊長可取6-30 μ m。 如果尺寸小于6 μ m時，在加工或分離實驗中，易適成立柱斷裂；如果尺寸大于30 μ m時，容 易加工，但分離溝道中用于分離的縫隙較少，分離效率降低。如圖1中的(c)和(f)所述，所示富集器2是由一個或多個富集單元10構成，富 集單元10的底部具有縫隙或者網格，所述縫隙或者網格的大小滿足使所要富集的細胞不 會從縫隙或者網格流過。利用微型泵或注射泵將混有不同大小的細胞或微粒從芯片的進樣口 3注入，利用 離心力和微立柱陣列間距大小進行分離，小于微立柱8間隙的細胞或微粒在微流道中運動 過程中被分離到外流道72，而大于微立柱8間隙的細胞或微粒在微流道中運動過程仍在內 流道71。將所需要的細胞或微粒通過離心分離器出口 5和富集器入口 6導入富集器2中， 在微流體流中細胞或微粒會進入富集單元10中。改變離心分離器1上微立柱的間距，可以用于不同尺寸的細胞或微粒(例如慢回 轉生物反應器中培養細胞用到的micro beads等)的分離，同樣，改變富集單元的大小，可 以適當改變富集細胞或微粒的多少。本發明巧妙地利用了一些細胞喜聚落生長的特性(例 如間質細胞、間充質干細胞、肝星狀細胞、以及軟骨細胞等)，通過對細胞的富集實現無需消 化、傳代的大面積片上細胞培養。優選地，富集單元10為方形直壁漏斗狀，該方形直壁漏斗狀富集結構的底部具有 梳齒，所述梳齒之間的距離即縫隙的寬度為5-18um，長度為50-100 μ m。所述方形直壁漏斗 的深度為50-150 μ m,優選為30-50 μ m,寬度為50-150 μ m。根據細胞的尺寸，調節方形直壁 漏斗的深度大于細胞直徑并且小于細胞直徑的2倍，可以實現單層細胞的富集和培養，這 有利于細胞的生長和增殖，有利于盡快得到所需數量的細胞。優選地，所述方形直壁漏斗的 入口處內側為直壁，入口處外側為流線形過渡。富集器2可以由幾十個富集單元10 (例如10-90個富集單元)構成，根據細胞或 微粒大小以及富集細胞數量的多少，可以在加工時改變富集單元的大小及富集單元底部梳 齒間隙大小。分離器與富集器可以硅材料或聚合物材料，與分離器和富集器鍵合在一起的 是聚合物材料或玻璃材料。富集器2的形狀并不特別限定，考慮到流場分布的均勻性，在本 發明的一個實施方案中，所述富集器2的整體形狀為菱形。實施例1 在硅片上加工出離心分離器和富集器本實施例的結構參見附圖1，工藝流程參見附圖2。1)分離器與富集器的硅片結構工藝流程(a)處理、清洗硅片11 ；(b)在硅片正面甩膠12、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕(ICP)硅100 μ m左右，形成微流體通道、微型立柱陣列分離 器1、進樣口 3、富集器2陣列、兩個樣品出口樣品排放口 4 ；2)分離器與富集器的蓋片聚合物工藝流程(d)處理、清洗硅片11，并在其表面涂上脫模劑13 ；(e)將無氣泡的硅橡膠(PDMS) 14均澆在培養皿內，并靜置平坦化，然后在
860-100°C烘箱中烘烤30-60分鐘左右，優選60°C、80°C和100°C ；(f)將固化的PDMS14切成與有微流道和微富集器陣列的硅片一樣大，并在相應的 入口和出口位置打孔。將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理，適當增加鍵合強度，否 則在進樣時會漏液；(g)將PDMS和硅結構按相應的位置進行鍵合，安裝上進出口的金屬管15。實施例2 用聚合物加工出離心分離器和富集器本實施例的結構參見附圖1，工藝流程參見附圖3。1)分離器與富集器的聚合物結構工藝流程(a)處理、清洗硅片11 ；(b)在硅片正面甩膠12、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕(ICP)硅100 μ m左右，形成微流體通道、微型立柱陣列分離 器和富集器陣列的模具16 ；(d)處理、清洗硅結構模具，并在其表面涂上脫模劑，將無氣泡的PDMS17均澆在 硅結構的模具上，并靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤0. 5-1小時左右，優選60°C、 80°C 和 IOO0C ；(e)將固化了 PDMS從硅模具上剝離，并切分每個單元；2)分離器與富集器的蓋片聚合物工藝流程(f)處理、清洗硅片11，并在其表面涂上脫模劑13 ；(g)將無氣泡的PDMS17均澆在培養皿內，并靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中 烘烤30-60分鐘左右；(h)將固化的PDMS切成與有微流道和微富集器陣列的硅片一樣大，并在相應的入 口和出口位置打孔；(i)將上下兩個鍵合表面用氧離子處理，適當增加鍵合強度，否則在進樣時會漏 液，將兩片PDMS按相應的位置進行鍵合，安裝上進出口的金屬管15。實施例3 三明治結構的離心分離器和富集器本實施例的結構參見附圖2，工藝流程參見附圖4。(a)處理、清洗硅片11 ；(b)在硅片正面甩膠12、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕(ICP)硅50 μ m左右，形成微流體通道、微型立柱陣列分離 器、樣品入口、富集器陣列、兩個樣品出口(與方法一結構類似)；(d)硅片正面與玻璃18陽極鍵合；(e)將鍵合后的硅玻璃片的背面減薄硅片，可以采用干法、濕法或CMP的方法；(f)硅片背面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(g)深刻蝕出進出樣口和與富集器對應的通孔；(h)將固化的PDMS切成與有微流道和微富集器陣列的硅片一樣大，并在相應的入 口和出口位置打孔；將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理，適當增加鍵合強度，安裝 上進出口的金屬管15。圖4示出了使用本發明的生物芯片富集人肺腺癌細胞A549，人肺腺癌細胞A549直 徑比MSC略大，但遠小于破骨細胞。具體步驟如下
1)先用100%乙醇浸潤分離流道，注意避免氣泡；2)將入口管浸沒在PBS溶液中，入口處換為PBS溶液。將生物芯片接到蠕動泵上， 以25微升/分鐘的流速進樣，直到將流道中的乙醇置換掉為止。3)隨后同法將入口換為胰酶消化得到的單細胞懸液；以5微升/分鐘的流速進 樣，直到細胞懸液完全進入流道為止。為了便于直觀地觀測細胞富集情況，我們在此使用事先室溫孵育FITC染料30分 鐘的細胞并用熒光顯微鏡觀測。結果如附圖5所示，由圖5可見，利用本發明的生物芯片取得了非常好的富集效^ ο圖6示出了按照類似的方法分離和富集MSC的效果圖。所用的生物芯片與分離人 肺腺癌細胞A549的生物芯片相同。分離前原代培養的人臍血間充質干細胞(MSC)中混有 大量直徑比MSC大近兩倍的破骨細胞等雜細胞。將細胞用胰酶消化后，用Iml培養液(含 10% FBS)終止消化，經單細胞懸液通過生物芯片。如圖6所示，經過分離后可以將體積較 小的MSC保留而體積較大的破骨細胞則被去除。由以上實施例可以看出，本發明實施例的離心分離器與富集器集于一體的生物芯 片的優點在于(1)將離心分離器與富集器實現單片集成，利用細胞的尺寸差異和細胞喜愛聚落 生長的特性，相對于傳統的細胞分離、富集、擴增分立的方式，實現免消化的細胞分離、富集 和擴增過程；(2)離心分離器部分采用離心分離與梳齒相結合的方法，提高了分離效率，避免了 分離過程的阻塞；(3)實現了硅-聚合物、聚合物-聚合物、玻璃_硅-聚合物的三種結構，實現了多 種材料的加工方法，可以降低成本；(4)采透明聚合物或玻璃加工，可以在分離過程中實時觀察分離效果，減小分離過 程中的失誤，提高了工作效率。本發明克服了當前分離芯片結構復雜、制備工藝難度大、分離效率低、富集非陣列 形式等缺點，實現一個低成本、高性能、高效率的微型片上細胞分離與陣列多組份富集片上 集成結構微分析平臺，利用MEMS體硅和表面微機械加工技術來制備離心分離器和富集器 于一體的片上分析系統。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑 或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型 也應視為本發明的保護范圍。
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權利要求
一種生物芯片，其特征在于，包括離心分離器(1)和富集器(2)，所述離心分離器(1)的中心處具有進樣口(3)，所述離心分離器(1)和富集器(2)上分別具有排放口(4)，所述離心分離器(1)上具有離心分離器出口(5)，所述富集器(2)上具有富集器入口(6)，所述離心分離器出口(5)與所述富集器入口(6)相連接；其中，所述離心分離器(1)包括渦旋式微流體通道(7)和沿所述微流體通道(7)內的流體流動方向布置于所述微流體通道(7)內的若干微立柱(8)，所述微立柱(8)將微流體通道(7)分成內流道(71)和外流道(72)。
2.如權利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述富集器(2)包括富集單元(10)，所 述富集單元(10)的底部具有縫隙或者網格，其大小設計為使得所要富集的細胞不能從縫 隙或者網格流過。
3.如權利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述富集單元(10)為方形直壁漏 斗狀，所述富集單元(10)底部為以一定間隔布置的多個梳齒，每個所述梳齒的長度為 50-100 μ m，各梳齒之間的距離為5-18um。
4.如權利要求3所述的生物芯片，其特征在于，所述富集單元(10)的深度為 30-150 μ m,寬度為 50-150 μ m。
5.如權利要求3或4所述的生物芯片，其特征在于，所述富集單元(10)的深度為 30-50 μm0
6.如權利要求3所述的生物芯片，其特征在于，所述富集單元(10)的入口處內側為直 壁，入口處外側為流線形過渡形狀。
7.如權利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述微流體通道(7)為半圓對扣形 式或阿基米德螺線形式，繞行中心處的圈數至少為5圈，其中心入口(9)所在圈的直徑為 500-800 μ m，每圈的寬度為 200-400 μ m。
8.如權利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述微立柱(8)的橫截面為圓形，所述 圓形的直徑為6-30 μ m。
9.如權利要求1所述的生物芯片，其特征在于，所述微立柱(8)的橫截面為正方形，所 述正方形的邊長為6-30 μ m。
10.一種權利要求1 9任一項所述生物芯片的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50μ m，形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列；(d)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中的氣泡；(e)處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；(f)將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，并靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤 30-60分鐘；(g)將固化的PDMS切成與具有微流體通道和微富集單元陣列的硅片同樣大小，并在相 應的微流體通道入口和出口位置打孔；(h)將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理；(i)將PDMS和硅結構按相應的位置進行鍵合，在微流體通道入口和出口安裝金屬管。
11.一種權利要求1 9任一項所述生物芯片的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50μπι，形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列的模且.Z、 9(d)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中的氣泡；(e)處理、清洗所述模具，并在其表面涂上脫模劑；(f)將無氣泡的PDMS均澆在模具上，靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤30-60 分鐘；(g)將固化了PDMS從模具上剝離，并切分每個單元；(h)處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；(i)將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，靜置平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤30-60 分鐘；(j)將固化的PDMS切成與具有微流體通道和微富集單元陣列的硅片同樣大小，并在相 應的微流體通道入口和出口位置打孔；(k)將上下兩個鍵合表面用氧離子處理；(1)將兩片PDMS按相應的位置進行鍵合，在入口和出口安裝金屬管。
12.—種權利要求1 9任一項所述生物芯片的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)處理、清洗硅片；(b)在硅片正面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(c)在硅片正面深刻蝕硅50μ m，形成微流體通道、微立柱陣列和富集單元陣列；(d)將硅片正面與玻璃陽極鍵合，形成硅玻璃片；(e)采用干法、濕法或CMP的方法將鍵合后的硅玻璃片背面的硅結層減薄；(f)硅片背面甩膠、前烘、光刻、顯影、后烘；(g)深刻蝕出進出樣口和與富集器對應的通孔；(h)將PDMS與其固化劑按10 1的比例混合，并充分攪拌，用真空泵去除PDMS中的氣 泡；處理、清洗培養皿，并在其表面涂上脫模劑；將無氣泡的PDMS均澆在培養皿內，并靜置 平坦化，然后在60-100°C烘箱中烘烤30-60分鐘；(i)將固化的PDMS切成與具有微流道和微富集器陣列的硅片同樣大小，并在相應的微 流體通道入口和出口位置打孔；(j)將PDMS和硅結構鍵合的表面用氧離子處理。
全文摘要
本發明公開了一種生物芯片及其制備方法，該生物芯片包括離心分離器、富集器和進樣口，所述離心分離器和富集器上分別具有排放口，所述離心分離器上具有離心分離器出口，所述富集器上具有富集器入口，所述離心分離器出口與所述富集器入口相連接；其中，所述離心分離器包括渦旋式微流體通道和沿流體流動方向布置于所述微流體通道內的若干微立柱，所述微立柱將微流體通道分成內流道和外流道。本發明生物芯片的結構緊湊，芯片的總面積減小，分離效率提高。該芯片的分離、富集過程耗時短，支持原位培養，減少細胞消化次數，該芯片還可以用于其他功能微粒分離。
文檔編號C12M3/00GK101962614SQ20101025118
公開日2011年2月2日 申請日期2010年8月11日 優先權日2010年8月11日
發明者李志宏, 杜婧, 楊春, 王瑋, 耿照新 申請人:清華大學;北京大學