專利名稱：一種檢測新生隱球菌的dna探針、基因芯片及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測新生隱球菌的DNA探針、基因芯片 及其應用。
背景技術：
侵襲性真菌感染是真菌入侵人體而導致血液感染、各個臟器感染或全身播散的嚴 重感染。近20年來侵襲性真菌感染的發病呈明顯增長趨勢，這與大量應用廣譜抗生素、抗 癌放療、化療以及其他免疫抑制劑、類固醇藥物、器官移植、靜脈插管和各種侵襲性操作有關。侵襲性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等條件致病真菌， 還有組織胞漿菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等地方流行性致病真菌。不同環境下，感染的真菌 種類不同。侵襲性真菌感染早期沒有特異性表現，所以很容易被掩蓋，病死率很高。目前臨床常用的檢測真菌的技術主要有(一 )鏡檢及培養、鑒定如六胺銀染色、PAS染色、銀氨G-S染色法、10% KOH法 以及真菌培養法是臨床最常用的鑒定手段，但直接鏡檢特異性差、敏感性不足，不能鑒定出 真菌種類。真菌培養雖能鑒定真菌種類，但培養條件苛刻，培養時間長，假陰性高，敏感性不 足，無法輔助臨床治療。(二)免疫學方法免疫學方法的基本原理是利用抗原與抗體的特異結合，來達到 相互間的特異探察。該法主要用于檢測真菌的抗原、抗體、代謝產物及細胞成分。能根據真 菌抗原性的不同將真菌分類。但抗體的特異性限制了該項技術的發展。免疫組化、酶聯免疫吸附試驗、免疫印跡法及凝集反應都是基于免疫學方法檢測 真菌的手段，但目前廣泛應用于臨床的僅有G試驗，G試驗檢測的是真菌的細胞壁成分(1， 3) - β -D-葡聚糖，人體的吞噬細胞吞噬真菌后，能持續釋放該物質，使血液及體液中含量 增高(淺部真菌感染無類似現象)。適用于除隱球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早 期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。臨床應用中發現有諸多假陽性可能，例 如(1)使用纖維素膜進行血透標本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；(2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；(3)鏈球菌血癥；(4)操作者處理標本時存在污染。另外，使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導致食物中的葡聚糖或定植 的念珠菌經胃腸道進入血液等也可能造成假陽性。(三)分子生物學技術包括原位雜交、聚合酶鏈反應、DNA中G+C mol %含量測定、隨機擴增多態性 DNA(RAPD)分析、限制性內切酶多態性分析(RFLP)等，但上述技術均耗時耗力，不具有高通 量的特點，不能用少量的樣本快速同時檢測多種可能存在的真菌，因此多局限于實驗室研3究，尚不能真正應用于臨床。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測新生隱球菌的DNA探針，具有SEQID No. 1所示序 列，其與新生隱球菌DNA特異性結合，檢測新生隱球菌靈敏度高。本發明所述DNA探針可廣泛應用于生物學、醫學領域，如與以PCR技術為基礎的核 酸雜交技術結合，進行生物學分析或臨床診斷。本發明結合基因芯片技術，可實現小樣本、高通量、特異、快速、自動化檢測新生隱 球菌的目的。本發明提供的一種用于真菌檢測的基因芯片，通過將特異性寡核苷酸探針固 定在固相載體表面形成，所述寡核苷酸探針包含具有SEQ ID No. 1所示序列的DNA探針。探 針、引物與真菌目的基因之間的關系如表1所示。表1.本發明所述基因芯片所使用的引物及探針引物探 針靶區域GenBank 加入碼堿基序列(5，—3，)XINSY新生隱球菌FJ914891AGCAAGCCGAAGACTACCCCATAGGC (SEQ ID No. 1 所示)ITSl18SrRNA 通用 ？ I 物 5' primerAF455531TCGGTAGGTGAACCTGCGG ( SEQ ID No.2 所示)ITS428SrRNA 通用 ？I 物 3 ‘ primerL28817TCCTCCGCTTATTGATATGC ( SEQ ID No.3 所示)作為優選，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微 粒和塑料片。本發明的基因芯片所采用的固相載體選自任何可用于制備基因芯片的材料，包括 但不限于硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相載體 經不同的化學修飾后，在其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團，這些基團包括但不限 于氨基(-NH2)、醛基(-CH0)、羧基(-C00H)和巰基(-SH)。本發明所述基因芯片在所述固相載體上連接針對新生隱球菌的特異性核酸探針， 所述探針可以為單鏈或雙鏈DNA分子，其在適當的條件下可以與新生隱球菌基因特異性雜 交。所述探針可以通過DNA自動合成或PCR擴增而獲得。所述探針在其與載體連接的一端 可以選擇性地添加一個目的在于增加探針的空間活動性以利于雜交的連接臂。本發明所述基因芯片的制備，是將所述核酸探針有序地點樣到載體上，通過核酸 探針末端修飾的活性基團與載體表面相應的活性基團反應，形成共價連接，將探針固定于 載體上，從而制成基因芯片。同時，在本發明所述基因芯片上，按序與不同樣品雜交后，通過 對所捕獲陽性信號的尋址即可明確對應的樣品中是否有新生隱球菌的存在。作為優選，所述固相載體表面還固定有陽性對照探針、陰性對照探針。更優選地，所述陽性對照探針其序列如SEQ ID No. 4所示，其與陽性對照樣品特異4性結合，陽性對照樣品片段序列如SEQ ID No. 6所示，其中與陽性對照探針結合部位的序列 為 CCCATGGGTCTTGTCTGGA。更優選地，所述陰性對照探針，其序列如SEQ ID No. 5所示。本發明還提供一種用于檢測新生隱球菌的試劑盒，包含與新生隱球菌特異性結 合的探針，所述探針具有序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列中。本發明所述試劑盒優 選還包含用于對真菌基因擴增的引物，其具有序列表SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3所示的 序列。本發明還提供一種對可能含新生隱球菌的樣品進行檢測的方法，包含以下步驟步驟1 提取并擴增樣品的核酸序列，所述擴增將信標分子標記到擴增產物；步驟2 取步驟1所得擴增產物與固定于所述基因芯片上的探針進行雜交；步驟3 根據所述信標分子采用相應的檢測方法對基因芯片進行掃描分析。作為優選，步驟1擴增步驟所用的5’引物為真菌ISSrRNA通用引物，具有序列表 SEQ ID No. 2所示序列，3，引物為真菌28SrRNA通用引物，具有SEQ ID No. 3所示的序列。在所述的樣品標記過程中，可以利用本領域已知各種核酸標記方法使標本中的目 的基因標記信標分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉錄、隨機引物標記、缺口 平移以及末端轉移標記等方法。所述信標分子可以為熒光素或同位素；所述熒光素包括但 不限于，Cy3, Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述同位素包括但不限于32P。在適當的溫度和離子強度條件下，將所述標記產物與本發明所述基因芯片進行雜 交。雜交條件和方法是本領域已知的。雜交后，根據所選用的信標分子采用相應的檢測方 法對基因芯片進行掃描分析，根據所捕獲的陽性信號尋址，判斷所述標本中是否含有新生 隱球菌。本發明采用新生隱球菌特異性寡核苷酸作為探針，在真菌檢測過程中利用真菌通 用引物對樣品中真菌基因擴增進行標記。本發明所述基因芯片連接的探針和擴增所用的真 菌通用引物列于表1中。需要說明的是，本發明所采用的寡核苷酸探針和真菌通用引物也 可以用于對目的基因的普通PCR擴增，而擴增的PCR產物同樣可以作為探針按照所述方法 制備真菌檢測基因芯片，因此所述PCR產物作為探針所制備的基因芯片也在本發明的保護 范圍之內。分子生物學技術應用于真菌研究已顯示出多方面的優點，醫學真菌研究已逐漸形 成了以基因分析為基礎的鑒定和分類系統。我們基于分子生物學技術，利用芯片的高通量 平臺，設計完善了基于基因芯片特異性診斷新生隱球菌感染的技術。本發明所述DNA探針特異性強，靈敏度高，樣品中含有2-3CFU以上新生隱球菌經 檢測即可見陽性信號，新生隱球菌PCR產物達0. 04ng以上即可被檢測出來。本發明所述基因芯片以及利用所述基因芯片進行樣品檢測的方法所需樣本量少， 反應體積小，試劑消耗少，可實現樣品的高通量、自動化及快速檢測，分析過程客觀，特異性 強，通過本方法檢測出的結果與分離培養或測序比對結果的一致率達100%，保證了檢測結 果的精確性，適于應用于臨床。
圖1示本發明所述基因芯片與新生隱球菌菌株雜交的檢測結果；5
圖2示不同數量新生隱球菌孢子提取的DNA與本發明所述基因芯片雜交的檢測結 果；圖3示不同劑量新生隱球菌PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果。
具體實施例方式本發明公開了一種檢測新生隱球菌的DNA探針、基因芯片及其應用，本領域技術 人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改 動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的產品及應 用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內 對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。實施例1 :DNA的提取可按照本領域常規方法進行提取，樣本可以為新鮮組織、血液、尿液、腦脊液、分泌 物(痰液、胸水、腹水、肺泡灌洗液等)等。在本實施例中使用Qiagen微量DNA提取試劑盒， 以新鮮組織為例(1)將新鮮組織放入高溫滅菌的研缽中，倒入液氮后研碎，將研碎的組織移入 1. 5ml的EP管中；(2)加入Iml生理鹽水沖洗，離心3000rpm 5min,棄上清；(3)加入 200 μ 1 Na0H(50mM)，95°C孵育 lOmin，離心 5000rpml0min，棄上清；(4)加入 500 μ 1 Lyticase 溶壁酶溶液，37°C孵育 30min ；(5)離心 14000rpm lOmin，棄上清；(6)迅速加 180 μ 1 ATL 禾口 20 μ 1 蛋白酶 K 55°C 15min ；(7)加 100 μ 1 AL，震蕩 15s.充分混勻。70°C IOmin (100 μ 1 AL 緩沖液中加 1 μ g 載體RNA)；(8) 50 μ 1 乙醇(96-100% )震蕩 15s.室溫 5min(15_25°C )；(9)短暫離心；(10)小心將所有溶胞產物移至柱，避免沾濕管壁，移液器勿觸及膜，離心 6000g(SOOOrpm) lmin.將柱子放進2ml收集管，棄收集管。若溶胞產物未完全通過膜，再次用更高轉速離心直至柱子空；(11)往柱子里加500 μ 1 AWl (搖勻)，避免沾濕管壁。離心6000g (8000rpm) lmin.將柱子放進2ml收集管，棄收集管；(12)往柱子里加500 μ 1 AW2，避免沾濕管壁。離心6000g(8000rpm) lmin.將柱子 放進2ml收集管，棄收集管；(13) 14，OOOrpm, 3min使膜完全干燥，確保沒有乙醇；(14)將柱子置于1. 5ml離心管，棄收集管。加20-100 μ 1 AE蒸餾水(PH大于7)于膜中央。(15)室溫(15-25 "C ) lmin.(16)將柱子置于收集管上，20，OOOg(14, OOOrpm)離心lmin，將收集管內液體保存
實施例2 樣品的PCR擴增
PCR反應體系PCR反應總體積為25μ 1，含模板DNA(新生隱球菌，黃曲霉，煙曲 霉，黑曲霉，土曲霉，構巢曲霉，乳酒念珠菌，皺褶念珠菌，阿薩希毛孢子菌，少根根霉，小孢 根霉，微小根毛霉，傘狀犁頭霉，光滑念珠菌，白念珠菌，克柔念珠菌，熱帶念珠菌，近平滑念 珠菌，季也蒙念珠菌或都柏林念珠菌DNA) 5 μ 1，10XBuffer2. 5 μ 1，2. 5mM dNTP 1. 25 μ 1, 25mM MgCl2 3μ 1，引物 ITS1、ITS4 50pmol 各 0· 25 μ 1, Hotstart Taq 酶(5U/μ 1)0. 1 μ 1, 補超純水至25 μ 1。PCR反應條件95°C 15分鐘，擴增變性、退火、延伸的條件分別為94°C變性30秒， 60°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，；35個循環，最后72°C延伸10分鐘。取8μ1 PCR產物于 1. 5%的瓊脂糖中電泳30分鐘，電泳后染色30分鐘，于凝膠成像系統照相。剩余的PCR產 物用于雜交(5 μ 1 PCR產物即可)。實施例3 探針的標記以及基因芯片的制備(1)用0. 5Μ NaHCO3(PH 8. 4)稀釋本發明所述探針至適宜濃度，取4ul探針溶液 入微孔板中，每孔加入4ul點樣液，充分混勻，空白對照為等量上述NaHCO3與點樣液的混合 液。(2)將BiodyneC尼龍膜裁剪至合適大小。(3)室溫下，16% w/v EDAC 孵育 Biodyne C 尼龍膜 10 分鐘。(4)去離子水漂洗Biodyne C尼龍膜1分鐘。(5)用濾紙吸干尼龍膜。(6)用點樣儀取探針溶液及空白對照溶液點樣于制備好的尼龍膜上。(7)室溫下孵育5分鐘。(8)吸除尼龍膜表面液體，將尼龍膜放入0. IM NaOH液中滅活9分鐘。(9)在搖床中用100ml 2 X SSPE漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘。(10)在搖床中用60°C 2XSSPE/0. 5% SDS液漂洗Biodyne C尼龍膜5分鐘。(11)于室溫下在搖床中用200ml 20mM EDTA液清洗Biodyne C尼龍膜20分鐘。(12)將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，并加入IOml的EDTA，密封保存于 4°C冰箱中，備用。實施例4 利用本發明所述探針進行樣品的檢測使用鏈親和素-過氧化物酶(RocheDiagnostics Co.)用 2 X SSPE (SSPE is 0. 18M NaCl，IOmM NaH2PO4, ^P ImM EDTA[pH 7. 7]_0. 5% SDS) 1 4，000 稀釋；雜交溫度為 60°C;膠 片(Hyperfilm ；Amersham)的曝光時間為2分鐘。具體步驟如下(1)取5 μ 1 PCR擴增產物、與1 μ 1陽性對照片段(序列如SEQ IDNo. 6所示)樣 本同時加入150 μ 1 2XSSPE/0. 1% SDS混勻，加入EP管中。(2) 99°C加熱10分鐘，然后將EP管迅速放置于冰上至少5分鐘。(3)在雜交箱中用250ml 60°C的2XSSPE/0. 1% SDS液體搖動漂洗已標記了探針 的Biodyne C尼龍膜5分鐘。(4)吸除尼龍膜表面液體。(5)用自制模具加入經2 X SSPE/0. 1 % SDS溶液稀釋后的PCR擴增產物150 μ 1于對應位置。(6)在雜交箱中，60°C雜交60分鐘。
(7)用250ml 60°C 2XSSPE/0. 5% SDS溶液于搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每 次10分鐘。(8)加入15ml 2XSSPE/0. 5% SDS和1/5000鏈親和素-過氧化物酶結合物混合液，42 °C孵育45分鐘。(9)用250ml 42°C 2X SSPE/0. 5% SDS液于搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次 10分鐘。(10)室溫下用250ml 2 X SSPE液在搖床中洗Biodyne C尼龍膜兩次，每次5分鐘。(11)加入20ml ECL顯影劑于Biodyne C尼龍膜上，室溫孵育1分鐘。(12)將Biodyne C尼龍膜放入暗盒中。(13)在暗盒中放入X光片，曝光，洗片，觀察結果。(14)將Biodyne C尼龍膜用80°C 250ml 1 % SDS液搖動漂洗兩次，每次30分鐘。(15)再用200ml 20mM EDTA液于搖床中清洗Biodyne C尼龍膜15分鐘。(16)將Biodyne C尼龍膜放入潔凈的塑料袋中，并加入IOml的EDTA，密封4°C保存備用。實施例5:結果的判定在探針對應的底片位置上，出現黑點，表示結果為陽性。無黑點，表示結果為陰性。圖1示按照實施例1-4制備的標記了本發明探針的基因芯片雜交結果。基因芯片 上標記的探針的順序為1陽性對照(如SEQ ID No. 4所示)，2陰性對照(如SEQ ID No. 5 所示)，3空白對照，4-23本發明所述探針；菌株PCR產物雜交順序1-4新生隱球菌，5煙曲霉，6黃曲霉，7黑曲霉，8 土曲霉， 9構巢曲霉，10乳酒念珠菌，11皺褶念珠菌，12阿薩希毛孢子菌，13少根根霉，14小孢根霉， 15微小根毛霉，16傘狀犁頭霉，17光滑念珠菌，18白念珠菌，19克柔念珠菌，20熱帶念珠 菌，21近平滑念珠菌，22季也蒙念珠菌，23都柏林念珠菌。從圖1可見，本發明所述特異性探針僅僅與新生隱球菌的PCR產物雜交，未與其它 真菌PCR產物發生非特異性雜交，證實其與新生隱球菌結合特異性強。實施例6 靈敏度及重復性檢測不同數量新生隱球菌孢子提取DNA后，經本發明所述基因芯片檢測，結果如 圖 2 所示，1-2. 5ng(相當于 100CFU)，2-l. 25ng(相當于 50CFU)，3-0. 63ng(相當于 25CFU)，4-0. 3 Ing (相當于 12. 5CFU)，5-0. 15ng (相當于 6CFU)，6-0. 08ng (相當于 3CFU)， 7-0. 04ng (相當于 1. 5CFU)，8-0. 02ng (相當于 0. 75CFU)，9-0. 0 Ing (相當于 0. 4CFU)。取不同劑量新生隱球菌PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。Marker 為 750bp、500bp，C 為陰性對照，1-1 X 103ng，2_500ng，3_250ng，4_50ng，5_5ng，6-0. 5ng, 7-0. 05ng,8-5X10」ngo以上結果說明，樣品中含有2-3CFU以上新生隱球菌經檢測即可見陽性信號；真菌 PCR產物達0. 04ng以上即可被檢測出來。而利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物時，至少要 5ng以上PCR產物進行電泳方可見肉眼所見條帶。說明本發明所述檢測方案的敏感性明顯 高于單純PCR檢測。重復性檢測本發明具有良好的重復性，取10份陽性新生隱球菌進行重復檢測， 陽性率達100%。
實施例8 臨床分離菌株檢測結果檢測自臨床標本中分離培養的菌株，利用本發明所述基因芯片檢測出的結果經分 離培養或測序比對驗證，其檢測結果一致率達100%，結果見表2。表2.本發明所述方法進行臨床病例檢測
權利要求
1.一種用于檢測新生隱球菌的DNA探針，具有SEQ ID No. 1所示序列。
2.一種用于新生隱球菌檢測的基因芯片，通過將寡核苷酸探針固定在固相載體表面形 成，其特征在于，所述寡核苷酸探針包含權利要求1所述DNA探針。
3.根據權利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼 龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。
4.根據權利要求2或3所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針還包括陽性對 照探針、陰性對照探針。
5.根據權利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陽性對照探針如SEQID No. 4所7J\ ο
6.根據權利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述陰性對照探針如SEQID No. 5所7J\ ο
7.一種檢測新生隱球菌的試劑盒，包含權利要求1所述DNA探針。
8.一種對可能含新生隱球菌的樣品進行檢測的方法，包含以下步驟步驟1 提取并擴增樣品的核酸序列，所述擴增將信標分子標記到擴增產物； 步驟2 取步驟1所得擴增產物與固定于權利要求2-6任一項所述基因芯片上的探針 進行雜交；步驟3 根據所述信標分子采用相應檢測方法對基因芯片進行掃描分析。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟1所述擴增步驟的引物具有序列表 SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示的序列。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述信標分子可以為熒光素或同位素， 所述熒光素包括Cy3、Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述同位素包括32P。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，公開了一種檢測新生隱球菌的DNA探針。本發明所述檢測新生隱球菌的DNA探針具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其檢測新生隱球菌特異性強，靈敏度高達0.04ng。本發明還提供包含所述DNA探針的基因芯片。采用本發明所述基因芯片可實現對可能含新生隱球菌的樣品的高通量、自動化及快速檢測，特異性強，可保證檢測結果的精確性，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102041305SQ20101025797
公開日2011年5月4日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者李國輝 申請人:李國輝