專利名稱：黑楊PdERECTA基因的功能分析與利用的制作方法
技術領域：
本發明設計涉及來自黑楊(Populus del toides)的PdERECTA基因功能分析與應用。
背景技術：
黑楊(Populus deltoides)又叫歐美雜交楊，它具有生長迅速、適應性強、繁殖容易、造林成活率高、用途廣泛等特點，深受廣大林農的歡迎。但其耗水量大，喜濕潤，因此成為其在我國干旱，半干旱地區推廣的主要障礙之一。氣孔作為植物吸收C02和進行蒸騰作用的主要器官，對植物的水分利用效率有著巨大的影響。ERECTA基因編碼的類受體激酶， 在植物葉片發育的氣孔密度調節的信號轉導過程中有重要作用。其對氣孔密度起負調控作用。該基因的表達可導致葉片氣孔密度減小，對蒸騰作用的影響遠大于光合作用，因此可提高水分利用效率。
發明內容
本發明的目的是提供黑楊中的一種與水分利用效率相關的ERECTA基因，該基因在黑楊中克隆，在提高水分利用效率中具有重要作用。本發明所提供的ERECTA基因來源于黑楊，是ERECTA基因家族中的一個，命名為PdERECTA。序列表中序列氨基酸殘基序列是由947個氨基酸殘基組成的蛋白質，。水分利用效率相關基因PdERECTA是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列。2)與序列中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。序列表中序列1的DNA序列由947個堿基組成，為該基因的開放讀碼框序列。本發明所提供的水分利用效率相關基因PdERECTA，使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體(包括雙元農桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體) 轉化植株，可獲得水分利用效率提高的轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，可以使用增強子，但是必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇性標記，通常使用的可選擇性標記可以是編碼對抗生素(包括慶大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因和生物安全標記(甘露糖)，也可以是⑶S、GFP等可以產生顏色變化的酶或發光化合物的基因等。攜帶有本發明的水分利用效率相關基因PdERECTA基因的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，以培育高水分利用效率的植物品種，例如Ti質粒、Ri質粒、電穿孔、微注射、植物病毒載體、直接DNA轉化或植物病毒載體等，所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。下面結合具體實施例對本發明做進一步說明
圖一是通過RT-PCR技術克隆得到的基因全長電泳圖，圖中M為markerIII，1為與水分利用效率相關的基因PdERECTA ；圖二為PdERECTA基因在不同脅迫下RT-PCR檢測結果。
具體實施例方式實施例1，黑楊總RNA的提取用CTAB (薩姆布魯克，分子克隆實驗指南，第三版)的方法從鹽處理的黑楊中提取總 RNA。實施例2，黑楊PdERECTA cDNA序列的克隆總RNA用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，然后用引物GPl
(CA (C/T) CA (A/G) A (G/C) TGAAGC (A/T) GATCC)
和 6Ρ2(α;Α(;(;(ΑΛ;/ (;(ΧΑΤ(ΑΛ;/τ)Α·ΑΤ(ΑΛ;))對該 cDNA 進行 PCR。PCR 程序為⑴ 94°C，變性 5 分鐘。 (2)PCR擴增，35個循環:94°C，變性50秒；63°C退火50秒；72°C，延伸50秒；(3) 72°C，延伸10分鐘。將PCR產物用瓊脂糖進行電泳分離，然后用天根的瓊脂糖DNA分離試劑盒回收目的片斷并與TaKaRa公司的pKM1304載體進行連接，連接的反應體系為目的片斷4 μ 1， 1μ lpKM1304vector,5y 1 Solution I，于16°C過夜連接，再將連接產物轉化進感受態的大腸桿菌ToplO，用PCR的方法檢測陽性菌株，最后取轉化成功的菌株在上海生工進行DNA序列測定。實施例3，黑楊PdERECTA基因在逆境中的表達特性對于從苗圃取得的兩年生黑楊植株，分別進行鹽處理、ABA處理、冷處理、干旱處理，根據實驗設計的時間取葉片，經液氮速凍，提取RNA作熒光定量-PCR分析，熒光定量-PCR反應以黑楊的Actin2為對照，以控制PCR反應中模板cDNA的濃度一致，結果如圖 2，3所示。實施例4、黑楊PdERECTA基因表達載體的構建用一頭加有BGL II酶切位點接頭，一頭加有SPEI酶切位點的引物從含有其cDNA 序列的克隆載體上進行PCR，得到的產物連接到克隆載體上，菌落鑒定后將得到的陽性克隆搖菌、提質粒，并用BGL II和SPEI酶切3小時，同時提取pKM1304質粒，也用BGL II和SPE I酶切3小時將得到的酶切產物用T4連接酶16°C過夜連接，分別轉化大腸桿菌ToplO，得到的正向和反向的陽性產物進一步轉化農桿菌JV3101。
權利要求
1.黑楊的水分利用效率相關基因PdERECTA，它具有與序列表中序列2的氨基酸殘基序列獲將序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的基因，其特征在于它具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.黑楊的水分利用效率相關基因PdERECTA，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列。2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的 DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于所述黑楊水分利用效率基因PdERECTA的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.權利要求4所述的基因，其開放閱讀框是自5’端第1到第觀41位堿基。
6.含有權利要求3所述的基因的表達載體。
7.含有權利要求3所述的基因的細胞系。
8.權利要求3所述的基因在培育高水分利用效率植物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個黑楊(Populus deltoides)的水分利用效率相關基因ERECTA基因，該基因對提高植物水分利用效率有重要作用，本發明將提供的ERECTA基因命名為PdERECTA，具有與序列表2的氨基酸序列或將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。水分利用效率相關基因PdERECTA，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的PdERECTA基因在培育高水分利用效率植物品種中具有重要作用。
文檔編號C12N9/12GK102399797SQ20101028183
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者夏新莉, 尹偉倫, 郭鵬 申請人:夏新莉, 尹偉倫, 郭鵬