專利名稱：一種簾蛤科線粒體coi基因擴增引物的篩選方法
技術領域：
本發明涉及一種雙殼貝類線粒體細胞色素c氧化酶亞基I (cytochrome c oxidase subimit I ；COI)基因序列擴增引物的篩選方法，特別是涉及一種簾蛤科線粒體COI基因序 列擴增引物的篩選方法。
背景技術：
簾蛤科(Veneridae)貝類隸屬于軟體動物(Mollusca)，雙殼綱(Biavalvia)，異齒 亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，簾蛤超科(Veneracea)，是一種在世界范圍內均 有分布，數量大，經濟種類多，具有很高商業價值的的貝類類群。據統計，簾蛤科貝類在全世 界范圍內有800多種，隸屬于14個亞科，為雙殼綱種類最為豐富的一個科。簾蛤科貝類中含 有很多經濟價值極高的種類，如菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum、等邊淺蛤Gomphina aequilatera、紫石房給 Saxidomus purpuratus、文給 Meretrix meretrix、青給 Cyclina sinensis等。然而簾蛤科貝類很多種類形態可塑性很大，近源種之間形態差異細微，故相 當大一部分簾蛤科貝類種間關系一直存在爭議，國內外學者始終沒有統一的看法。例如菲 律賓蛤仔R. · philippinarum由于貝殼形態、殼表顏色、殼表花紋等變化很大，早期分類學 家將其定為 dentivulata、indica、violascens、japoniaca、semidecussata、bifurcata 禾口 philippinarum等7個種。而在國內，菲律賓蛤仔往往被定名為與其形態相近的姊妹種雜色 ^aiJ- (Ruditapes variegata)。近年來，利用DNA序列對物種進行分類和進化研究已成為一種高效的方法，其中 線粒體COI基因由于具有突變速率適中，單親遺傳等特點成為物種鑒定和生物系統學研 究的理想基因。此基因序列已在許多生物類群特別是動物界的分類及進化研究中得到了 成功的應用。并且，COI基因已成為鑒定物種和發現新種的新興技術——DNA條形碼(DNA barcoding)技術在動物類群中的標準基因。因此，COI基因是雙殼貝類簾蛤科物種鑒定和 系統發育研究最為理想的分子標記。然而貝類COI序列的變異速率明顯高于動物的其他類群軟體動物不同物種，即 使是近源種甚至種內不同群體之間的COI序列變異都很大，這就導致了 Folmer等人于1994 年設計的COI通用引物LC01490和HC02198在這一動物類群中的擴增效率極低下。缺少擴 增效率高的引物已經嚴重阻礙了簾蛤科貝類系統發生相關研究的進行。
發明內容
本發明的目的是提供一種簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，它能滿足 現有技術的上述需求。一種簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物 技術信息中心，下載簾蛤科貝類的線粒體全序列；b、將下載的序列用BioEdit軟件比對分 析，確定序列兩端保守區域；c、在確定的保守區域用引物設計軟件Primer Premier 5設計 多對引物并合成；d、提取簾蛤科貝類DNA，然后將合成的引物在相應反應體系下進行PCR擴增；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一組雞尾引物，此組雞尾 引物由一對兼并引物和一對普通引物組成，其正向引物為COIF-VLT :ACAAAT CAY AAR GAY ATY GG禾口 COIF-VSA :ACC MT CAT AAA GAT ATT GG，反向引物為 COIR-VP :CCT GTA GGA ATA GCA ATA AT 禾口 COIR-VJ :CCW GTff GGR ACA GCA ATA AT0本發明根據包括簾蛤科貝類在內的貝類物種COI序列變異度高和COI通用擴增引 物在此動物類群中擴增效率低的特性，通過反復試驗篩選出簾蛤科COI基因的特異性擴增 引物。采用本發明的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物，可以有效的擴增出簾蛤科不同物種 的COI序列，對于基于COI分子序列的簾蛤科物種分類、系統發育、系統地理學研究和簾蛤 科種質資源保護以及漁業資源管理都具有及其重要的意義。
具體實施例方式本發明的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法采用以下步驟a、登陸美 國國立生物技術信息中心，下載簾蛤科貝類的線粒體全序列；b、將下載的序列用BioEdit 軟件比對分析，確定序列兩端保守區域；C、在確定的保守區域用引物設計軟件Primer Premier 5設計多對引物并合成；d、提取DNA，然后分別用合成的多對引物在反應體系下 進行PCR反應；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一組雞尾引 物(cocktail primer)，此組雞尾引物由一對兼并引物和一對普通引物組成，其正向引物為 COIF-VLT=ACA AAT CAY AAR GAY ATY GG 禾P COIF-VSA :ACC AAT CAT AAA GAT ATT GG,反 向引物為 COIR-VP =CCT GTA GGA ATA GCA ATA AT 禾口 COIR-VJ :CCW GTff GGR ACA GCA ATA AT。下面結合實施例對本發明作進一步說明1.樣品采集于2003年至2010年從中國南北沿海共采集56種簾蛤科貝類的312 個個體。2.線粒體全序列下載登陸美國國立生物技術信息中心(NCBI, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，下載Genbank已有的3條簾蛤科貝類線粒體全序列。3.確定COI序列保守序列用序列處理軟件BioEdit (http://www.mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)對上述序列進行多重比對分析，確定出COI 5，端較保守的區域。4.引物設計設計用引物設計軟件Primer Premier 5 (http //www. premierbiosoft. com/primerdesign/index. html)在保守區域設計引物，設計引物時保證 擴增目標片段不小于500bp，并盡量避免發卡結構、引物二聚體的出現。設計出的8組引物 交由上海生工生物技術有限公司合成。5. DNA提取用苯酚氯仿法對所采集的全部樣品進行DNA提取。6.PCR擴增在10μ 1 PCR反應體系中用合成的8組引物分別對這312個簾蛤樣品 進行 PCR 擴增，該體系包括100ng 模板 DNA，0. 25U Taq 聚合酶(Takara)，1 X PCR buffer, 0. 2mM dNTPs, 1. 5mM Mgcl2,引物各 1 μ M。PCR擴增條件為94°C預變性 3min，94°C變性 lmin， 48-52°C退火lmin(不同引物退火溫度不同)，72°C延伸lmin，共35個循環，最后72°C延伸 5min。引物篩選產物用質量百分濃度為-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一，擴增效率最高的一組引物，該組引物為雞尾引物(正向引物=COIF-VLT和 C0IF-VSA，反向引物=COIR-VP和COIR-VJ)，其擴增的產物片段長度約900bp，301個個體具 明亮條帶。其擴增效率大于95%，遠大于Folmer等人設計的COI通用擴增引物在簾蛤科貝 類中的擴增效率(60%左右)。用ABI PRISM 3130測序儀(Applied Biosystems)雙向測 序。序列用BioEdit軟件拼接后，與NCBI上下載的簾蛤科COI序列進行多重比對分析，確 定所得序列為目的片段，即簾蛤貝類線粒體COI基因序列片段。
權利要求
一種簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物技術信息中心，下載簾蛤科貝類的線粒體全序列；b、將下載的序列用BioEdit軟件比對分析，確定序列兩端保守區域；c、在確定的保守區域用引物設計軟件Primer Premier 5設計多對引物并合成；d、提取簾蛤科貝類DNA，然后將合成的引物在相應反應體系下進行PCR擴增；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一組雞尾引物，此組雞尾引物由一對兼并引物和一對普通引物組成，其正向引物為COIF VLTACA AATCAY AAR GAY ATY GG和COIF VSAACC AAT CAT AAA GAT ATT GG，反向引物為COIR VPCCT GTA GGA ATA GCA ATA AT和COIR VJCCW GTW GGR ACA GCA ATAAT。
2.如權利要求1所述的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 簾蛤科貝類的線粒體全序列為3條，下載于美國國立生物技術信息中心。
3.如權利要求1所述的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 簾蛤科貝類樣品為2003年至2010年從中國南北沿海采集的56種簾蛤科貝類的312個個 體。
4.如權利要求1所述的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 反應條件體系為100ng模板DNA，0. 25U Taq聚合酶，1 XPCR緩沖液，0. 2mM dNTPs, 1. 5mM Mgcl2,引物各 1 μ Μ。
5.如權利要求1所述的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 PCR擴增條件為941預變性31^11，941變性 lmin，48_52°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，共 35 個循環，最后72°C延伸5min。
6.如權利要求1所述的簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是所述的 瓊脂糖凝膠電泳檢測所用的瓊脂糖質量百分濃度為-1. 5%。
全文摘要
一種簾蛤科線粒體COI基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物技術信息中心，下載簾蛤科貝類的線粒體全序列；b、將下載的序列用BioEdit比對分析，確定其保守區域；c、在保守區域內用Primer Premier 5設計多對引物并合成；d、提取簾蛤科貝類DNA，將合成的引物在相應反應體系下進行PCR擴增；e、進行電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一組雞尾引物，此組雞尾引物由一對兼并引物和一對普通引物組成。采用本發明的簾蛤科線粒體COI引物，可以有效的擴增出簾蛤科不同物種的目的片段，對基于COI序列的簾蛤科物種分類、系統發育、系統地理學研究和簾蛤科種質資源保護以及漁業資源管理都具有及其重要的意義。
文檔編號C12N15/11GK101979536SQ20101029762
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月26日 優先權日2010年9月26日
發明者孔令鋒, 李琪, 陳軍 申請人:中國海洋大學