專利名稱：一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法
技術領域：
本發明屬于環保技術領域，更具體涉及一種低成本培養基規模化生產溶藻菌的制 備方法。適宜工業化生產，溶藻菌適用于在富營養化水體中控制藍藻(主要是微囊藻)水華 的爆發。
背景技術：
藍藻是地球上最早出現的光合自養生物，在長期的進化過程中，這類生物發展了 一套獨特的形態和生理生化機制，能夠在各種不同生境中生衍，使其具有一定的競爭優勢。 在環境條件適宜時，某些藍藻能快速生長，當達到一定生物量時，微囊藻在水體表層大量聚 集，形成肉眼可見的藻類聚集物，即藍藻(微囊藻)水華。藍藻水華引起的一系列環境和健康 問題，正受到全世界各國的高度重視。藻類過度繁殖是導致湖泊水環境惡化的關鍵環節， 有害藻類的過度增殖，尤其產毒素藍藻給人類健康構成了潛在的威脅。針對我國湖泊面 臨的嚴重富營養化及其災害問題，在湖內污染源、流域點源與面源污染控制需要投入巨大 資金且短期內難以取得成效的情況下，探索浮游藻類生物量的控制、抑制“水華”發生、改 善湖泊水質的有效途徑是非常必要的。藻類的控制技術可歸結為物理方法、化學方法和生 物方法。物理方法主要是電磁場、機械除藻等，可作為藍藻水華控制的輔助性措施，但處 理能力有限，局限于水處理工程應用。化學除藻的方法主要包括施用除草劑、殺藻劑及金 屬鹽等。化學藥劑除藻技術雖有快速高效的優點，但會帶來水體的二次污染問題，直接在 作為飲用水源的湖泊、水庫等的應用受到限制或必須慎用。生物學控藻技術是利用藻類的 天敵及其產生的生長抑制物質對藻類的生長、繁殖進行抑制，從而達到控制藻類數量、防 治富營養化帶來的各種危害，目前正處在研究發展的初期階段。溶藻細菌(algae-lysing bacteria)，作為水生生態系統生物種群結構和功能的重要組成部分，對維持藻的生物量 平衡具有非常重要的作用。溶藻細菌，作為水華防治的生物，已經引起越來越多人的關 注。然而，培養溶藻菌的主要營養成分為硝酸鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，氯化鈣，檸檬酸， 檸檬酸鐵銨，乙二胺四乙酸，碳酸鈉，A5 + Co Solution (A5溶液)大豆胰蛋白等(見ZL ZL2004100129324 “一種腸桿菌及制備方法和應用”)，這些原料，尤其是大豆胰蛋白成本較 高，難用于大規模生產，給溶藻菌的應用帶來了一定的困難。本發明采用1/2體積的豆腐水 進行培養，原料來源容易，生產成本低廉，且易于培養，適宜工業化生產，從而達到控制富營 養化湖泊藍藻水華發生的目的。
發明內容
本發明的目的是在于提供了一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法。方 法易行，操作簡便，在于降低了富營養化水體，控制了藍藻水華爆發。該方法原料來源容易， 生產成本低廉，且易于培養，適宜工廠化的生產。為了達到上述的目的，本發明采取以下技術措施
本發明采用(新鮮未稀釋豆腐水與井水的體積比)1/2體積的豆腐水為原料，適當添加
3少量營養元素(N、P、K、Ca、Mg、具體用量見配制培養基)進行溶藻菌培養。其主要技術措施 如下
溶藻菌菌種來源
溶藻菌為專利菌種(專利號ZL2004100U9324，菌種名為腸桿菌；拉丁文是 Enterobacteriaceae . sp，保藏在武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為M204010。) 該溶藻菌能在市場中買到。一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法，其步驟是
其技術構思是:A、配制溶藻菌I、溶藻菌II菌種培養基；B、溶藻菌I、溶藻菌II菌 種的培養；C、III級溶藻菌種子(母液擴大)規模化生產培養。A、溶藻菌I、溶藻菌II菌種培養基
①配制培養基硝酸鈉100-1 lOrng，磷酸氫二鉀3-%ig，硫酸鎂7-8mg，氯化鈣， 檸檬酸0. 5-0. 6mg,檸檬酸鐵銨0. 5-0. 7mg,乙二胺四乙酸0. 5-0. 7mg,碳酸鈉Umg，A5 + Co Solution (A5 溶液)0· 1-0. 3ml,蒸溜水 Distilled water99. 9 ml, 5-6 g/升大豆胰 蛋白，混合溶解后可得培養基。培養基PH7.6。②滅菌培養基配制好后采用高壓蒸汽滅菌，當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時， 水蒸氣的溫度升高到121°C，經15 30min滅菌結束，培養基降到20 25°C后，即可進行 接種。接種應在無菌室內的超凈工作臺上進行，接種前將無菌室內和超凈工作臺內的紫外 燈同時打開，滅菌lh。試管、平板和三角瓶接種應在超凈工作臺上分別按斜面接種、平板劃 線和液體培養接種法進行接種。B、溶藻菌I、溶藻菌II菌種的培養將溶藻菌原種接種在經過A步驟中的①②滅 菌好的培養基中，將經過A步驟①②試管培養基中繁殖而成的I級溶藻菌菌種接種后應放 在培養架上或生物培養箱內培養，溫度控制在25 ^TC,每天應搖動2 3次為宜。培養 的I級溶藻菌菌種要定期更換，(試管)斜面和平板三個月換一次；液體試管或小三角瓶夏 季保種19 21天，冬季一個月換一次培養基。II級溶藻菌種子培養(三角瓶液體培養)接 種后應放在恒溫搖床上振動培養，溫度控制在25 ^TC,如沒有恒溫搖床可以培養架上或 生物培養箱內培養，每天應搖動2 3次為宜。II級溶藻菌菌種培養約5 7天后即可生 長好，生長好的II級菌種可以進行III級溶藻菌種子(母液擴大)培養。C、III級溶藻菌種子(母液擴大)規模化生產培養
①培養基配制利用經上述A步驟中的①②菌種培養基進行III級溶藻菌種子和工 廠化生產成本高，為了降低成本，本發明用下面培養基代替上述A步驟的①(溶藻菌菌種 培養基)培養基即磷酸氫二鉀，硫酸鎂7-8mg，豆腐廢水1000ml，調至pH=7.6。 配制前先將豆腐水用雙層紗布過濾，再用自來水或深井水與過濾后豆腐水按照1 :1比例稀 釋；然后加入溶解好的磷酸氫二鉀和硫酸鎂，調節pH至7. 6。②操作
a 溶藻菌III級種子(母液擴大培養)將培養好的II級菌種接種入配制好的C步驟中 的①培養基中，接種量為10%，將接種好的培養基分裝入25L的清洗干凈的塑料壺或桶中。 把接種好的菌水塑料壺用棉塞或牛皮紙包扎，在壺口插上通氣和出氣管各一支，在觀 32°C條件下通氣發酵培養。條件適宜時一般5天左右發酵完成，可以作為規模化生產的種 子。
4
規模化生產方法發酵池10m3 ；配制體積濃度為5%的“84”消毒液40L (生產廠 家上海新佳佳美容護膚品有限公司)，噴灑在發酵池壁和底部，24h后，用干凈的深井水清 洗發酵池。取配制好的C步驟中的①培養基7 8 m3放入10 m3的發酵池中，加溶藻菌III 級種子(母液)lm3，然后加培養液至10m3，最后用塑料薄膜密封，28 32°C發酵培養。一般 6 8天后即可得到溶藻菌成品。該溶藻菌廣泛用于控制水域中藍藻發生的水華中。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果
①溶藻菌的噴灑規模化生產好的溶藻菌成品按照一定濃度(1/10000)噴灑在藍藻 發生的湖泊、水庫、河道、池塘等富營養化水體中。②監控建立的監控條件和標準為藍藻水體的顏色的變化，葉綠素含量下降，藍藻 優勢度減少，水體富營養化程度降低、水體的透明度上升。③用途說明溶藻菌用于除藻具有以下優點方法容易，操作簡單，無污染，安全 性高。相比殺藍藻的如硫酸銅等化學物質具有明顯的優點。使用細菌清除藍藻不會帶來第 二次污染。在較大的水體中形成一種新的生態平衡具有原料來源容易，生產成本低廉，且易 于培養，適宜工業化生產，具有較強的操作性。
具體實施例方式實現例1
一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法，其步驟是 1、采用溶藻菌菌種
溶藻菌為專利菌種(專利號ZL2004100U9324，菌種名為腸桿菌；拉丁文是 Enterobacteriaceae . sp，保藏在武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏號為M204010。) 可在市場上購買。2,1. II級溶藻菌菌種(實驗室)培養
①培養基硝酸鈉100-1 lOrng，磷酸氫二鉀3-%ig，硫酸鎂7-8mg，氯化鈣，檸 檬酸0. 5-0. 6mg,檸檬酸鐵銨0. 5-0. 7mg,乙二胺四乙酸0. 5-0. 7mg,碳酸鈉llmg，A5 Solution + Co0.l-0.3ml，蒸餾水(Distilled water)99. 9 ml, 5-6 g/升大豆胰蛋白，混
合溶解后可得培養基。培養基pH=7.6。②滅菌培養基配制好后采用高壓蒸汽滅菌，當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時， 水蒸氣的溫度升高到121°C，經15 30min，即可進行接種。接種應在無菌室內的超凈工作 臺上進行，接種前將無菌室內和超凈工作臺內的紫外燈同時打開，滅菌lh。試管、平板和三 角瓶接種應在超凈工作臺上分別按斜面接種、平板劃線和液體培養法進行接種。③培養將實例步驟1中的溶藻菌菌種在上述步驟2的①②步驟試管培養基中繁 殖而成的I級溶藻菌菌種，接種后應放在培養架上或生物培養箱內培養，溫度控制在25或 沈或27或觀或^TC,每天應搖動2-3次為宜。步驟1中的溶藻菌菌種要定期更換，(試 管)斜面和平板三個月換一次；液體試管或小三角瓶夏季保種19 21天，冬季一個月換 一次培養基。II級溶藻菌種子培養(三角瓶液體培養)接種后應放在恒溫搖床上振動培養， 溫度控制在25或沈或27或觀或^TC,如沒有恒溫搖床可以培養架上或生物培養箱內培 養，每天應搖動2 3次為宜。II級溶藻菌菌種培養約5 7天后即可生長好，生長好的II級溶藻菌菌種可以進行III級溶藻菌種子(母液擴大)培養。3、III級溶藻菌種子(母液擴大)規模化生產培養
①培養基配制利用上述步驟2中③生長好的II級溶藻菌菌種培養基進行III級溶藻 菌種子和工廠化生產成本高，為了降低成本，本發明用下面培養基代替上述步驟①中的溶 藻菌菌種培養基即磷酸氫二鉀，硫酸鎂7-8mg，1/2體積的豆腐廢水1000ml， pH7. 6。配制前先將豆腐水用雙層紗布過濾，再用自來水或深井水與過濾后豆腐水按照1 :1 比例稀釋；然后加入溶解好的磷酸氫二鉀和硫酸鎂，調節pH至7. 6。②操作
a 溶藻菌III級溶藻菌種子(母液擴大培養)取配制好的培養基50L lm3，放入25L 的清洗干凈的塑料壺或桶中，再加入50L 1 m3培養好的II級菌種。然后將培養基加 到25L。把接種好的菌水塑料壺用棉塞或牛皮紙包扎，在壺口插上通氣和出氣管各一支，在 28 32°C條件下通氣發酵培養。條件適宜時一般5天左右發酵完成，可以作為規模化生 產的種子。規模化生產方法發酵池10m3 ；配制體積含量為5%的“84”消毒液40L，噴灑在發 酵池壁和底部，24h后，用干凈的深井水清洗發酵池。取配制好的培養液7 8 m3放入10 m3的發酵池中，加溶藻菌III級種子(母液)lm3，然后加培養液至10m3，最后用塑料薄膜密封， ^ 32°C發酵培養。一般7天左右即可。4、應用溶藻菌主要用于控制水域中藍藻發生的水華。①溶藻菌的噴灑規模化生產好的溶藻菌成品按照一定濃度(1/10000)噴灑在 藍藻發生的湖泊、水庫、河道、池塘等富營養化水體中。④監控建立的監控條件和標準為是藍藻水體的顏色的變化，葉綠素含量下降，藍 藻優勢度減少，水體富營養化程度降低、水體的透明度上升。③用途說明溶藻菌用于除藻具有以下優點方法容易，操作簡單，無污染，安全 性高。相比殺藍藻的如硫酸銅等化學物質具有明顯的優點。使用細菌清除藍藻不會帶來第 二次污染。在較大的水體中形成一種新的生態平衡。本發明與現有溶藻菌規模化技術相比 較具有原料來源容易，生產成本低廉，且易于培養，適宜工業化生產，具有較強的操作性。
權利要求
1. 一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法，其步驟是 A、溶藻菌I、溶藻菌II菌種培養基①配制培養基硝酸鈉100-110mg，磷酸氫二鉀3-%ig，硫酸鎂7-8mg，氯化鈣， 檸檬酸0.5-0. 6mg，檸檬酸鐵銨0.5-0. 7mg，乙二胺四乙酸0.5-0. 7mg，碳酸鈉Umg，A5 + Co Solution (々5溶液)，蒸餾水99.9 ml, 5-6 g/升大豆胰蛋白，混合溶解后得培養基，培養 基 Ph=7. 6 ；②滅菌培養基配制好后采用高壓蒸汽滅菌，當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸 氣的溫度升高到121°C，經15 30min滅菌結束，培養基降到常溫后，進行接種，接種在無菌 室內的超凈工作臺上進行，接種前將無菌室內和超凈工作臺內的紫外燈同時打開，滅菌lh， 試管、平板和三角瓶接種在超凈工作臺上分別按斜面接種、平板劃線和液體培養接種法進 行接種；B、溶藻菌I、溶藻菌II菌種的培養將溶藻菌原種接種在經過A步驟中的①②滅 菌好的培養基中，將經過A步驟①②試管培養基中繁殖而成的I級溶藻菌菌種接種后應放 在培養架上或生物培養箱內培養，溫度控制在25 ^TC,每天應搖動2 3次為宜；培養 的I級溶藻菌菌種要定期更換，斜面和平板三個月換一次；液體試管或小三角瓶夏季保種 19 21天，冬季一個月換一次培養基，II級溶藻菌種子培養接種后放在恒溫搖床上振動培 養，溫度控制在25 ^°C，每天搖動2 3次，II級溶藻菌菌種培養5 7天后，II級菌種 進行III級溶藻菌種子培養；C、III級溶藻菌種子規模化生產培養①培養基配制用上述(A)步驟的①培養基磷酸氫二鉀，硫酸鎂7-8mg，豆 腐廢水1000ml，調至pH=7. 6，將豆腐水用雙層紗布過濾，再用自來水或深井水與過濾后豆 腐水按照1 :1比例稀釋；然后加入溶解好的磷酸氫二鉀和硫酸鎂，調節PH至7. 6 ； ②操作a 溶藻菌III級種子將培養好的II級菌種接種入配制好的(C)步驟中的①培養基，接 種量為10%，將接種好的培養基分裝入25L的清洗干凈的塑料壺或桶中，把接種好的菌水塑 料壺用棉塞或牛皮紙包扎，在壺口插上通氣和出氣管各一支，在觀 32°C條件下通氣發酵 培養，5天發酵完成，作為規模化生產的種子；b:規模化生產方法發酵池10m3 ；配制5% 84消毒液，噴灑在發酵池壁和底部，24h 后，用干凈的深井水清洗發酵池，取配制好的(C)步驟中的①培養基7 8 m3放入10 m3的 發酵池中，加溶藻菌III級種子lm3，然后加培養液至10m3，最后用塑料薄膜密封，觀 32°C發 酵培養，6 8天后得到溶藻菌成品。
全文摘要
本發明公開了一種低成本培養基工業化生產溶藻菌的制備方法，其步驟A、溶藻菌Ⅰ、溶藻菌Ⅱ菌種培養基①配制培養基；②滅菌培養基配制好后采用高壓蒸汽滅菌；B、溶藻菌Ⅰ、溶藻菌Ⅱ菌種的培養將(A)步驟中的第一步①的溶藻菌菌種在上述步驟②中(A)步驟①試管培養基中繁殖的Ⅰ級溶藻菌級菌種接種后放在培養架上或生物培養箱內培養；C、Ⅲ級溶藻菌種子規模化生產培養①培養基配制調節pH至；②操作a溶藻菌Ⅲ級種子:將培養好的Ⅱ級菌種接種入配制好的(C)步驟中的①培養基；b:規模化生產方法得到溶藻菌成品。方法易行，操作簡便，降低了富營養化水體，控制了藍藻水華爆發。原料來源容易，生產成本低廉，適宜工廠化生產。
文檔編號C12N1/12GK102093956SQ20101058823
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優先權日2010年12月15日
發明者劉軍, 劉彬彬, 劉浩, 唐智偉, 趙冰, 項嬌 申請人:武漢昌寶環保工程有限公司