專利名稱：反義抗病毒化合物及治療流感病毒感染的方法
技術領域：
本發明涉及用于治療流感病毒感染的反義寡核苷酸和利用寡核苷酸的抗病毒治療方法。·
背景技術：
縱觀人類歷史，流感病毒是導致人類死亡率和發病率的一個主要原因。在世界范圍內，甲型流感病毒感染每年引起數以百萬計的嚴重病例，導致多達500，000人喪生。流行性傳染病在嚴重程度方面變化很大但每隔一定時間就會發生并且總會導致顯著的死亡率和發病率，最頻繁地發生在老年人群中。盡管針對匹配的流行性感冒病毒株的疫苗可以預防60-80%的健康成年人中的疾病，但是保護率在高危人群中要低得多。而且，疫苗接種并不提供針對非預期病毒株的保護，諸如1997年在香港以及2003年和2004年在歐洲與東南亞爆發的H5和H7禽流感。目前的抗流感病毒藥物在它們提供保護及治療效果方面的能力是有限的(Cox and Subbarao 1999;Cox and Subbarao 2000)。甲型流感病毒為負極性的節段RNA病毒。通過4個蛋白的復合體復制基因組節段 3個聚合酶多肽(PA、PB1和PB2)和NP(核蛋白)。所有8個基因組節段的5’和3’末端的序列區域在一個基因型內是高度保守的(Strauss and Strauss 2002)。根據它們表面糖蛋白的抗原和遺傳特性，可將甲型流感病毒分型。迄今已經鑒定了 15個紅細胞凝集素(HA)與9個神經氨酸苷酶(NA)亞型。已經從禽類宿主分離出了衍生所有已知的HA與NA亞型的病毒，但是只有HlNl (1918)、H2N2 (1957/58)以及H3N2 (1968) 亞型與人類中廣泛傳播的流行性傳染病相關(Strauss and Strauss 2002)。自從1997年以來，當時H5N1流感病毒傳播至人類并且殺死了 18個感染者中的6 個人，已經有多重的禽流感病毒傳播至哺乳動物。直接傳播全部的病毒或通過哺乳動物株獲得來自于禽流感病毒的基因節段。在亞洲禽類H5N1病毒廣泛傳播的感染已引起了日益增加的關注該亞型可實現人-人的傳播并且建立了種間傳播。通過病毒糖蛋白的不同形式(HA，NA)確定不同類型的流感病毒能夠感染的物種。這提供了鳥類與人類間相當大的不易克服的物種屏障。然而，豬卻提供了 “混合罐能夠被這兩種類型的病毒所感染并因此而允許禽類病毒-人類的傳代。當個體的豬細胞與禽類和人類的流感病毒共感染時，可以出現攜帶禽類HA基因型但是易于感染人類的重組形式。禽類HA可以感染豬但是不感染人類。在豬中，基因組節段包裝期間，創建帶有幾個禽類節段與人類HA和/或NA節段的病毒是可能的(Cox and Subbarao 2000)。流感病毒感染人類和動物(例如豬、鳥、馬)而且可能引起急性呼吸性疾病。已經有很多的生產有效針對流感病毒的疫苗的嘗試，然而沒有任何一個是完全成功的，尤其是在長期基礎上。這可能是由于，至少部分地，流感病毒基因組的節段的特征，其使得通過節段的再分配而有許多形式的存在是可能的。例如，已經提出了存在著RNA節段在動物與人類流感病毒間的相互交換，這可以導致在這兩種群體中引入新的抗原亞型。因此，由于新的亞型的出現(抗原“轉移”)，長期的疫苗接種方法就失敗了。此外，病毒的表面蛋白，紅細胞血凝素與神經氨酸苷酶，不斷地經歷較小的抗原變化(抗原“轉移”)。這種高程度的變異解釋了為什么針對特別的流感病毒所發展的的特異性免疫不能針對新的變體建立保護。 因此，需要可選擇的抗病毒策略。盡管乙型和丙型流感病毒引起的臨床疾病比甲型流感病毒所引起的少，但是 新的抗病毒藥物也應該有益于抑制由這些因子所引起的感染。天然地發生在鳥類中的流感病毒被叫做禽流感(鳥流感)。鳥類在它們的腸道中攜帶病毒但通常不會被感染致病。然而，遷徙的鳥類可以攜帶鳥流感以感染馴養的雞、鴨和火雞，引起疾病甚至死亡。禽流感輕易不感染人類但是當人類暴露非常頻繁時，諸如接觸馴養的鳥類，人類感染就會發生。1961年在南非的燕鷗中首先鑒定出危險的鳥流感(H5N1)并且鑒定為潛在地致死的流感形式。2003年下半年和2004年，八個亞洲國家發生了 H5N1的爆發。這些國家在那段時間內超過100，000，000只鳥類死亡或者被捕殺以便控制爆發。亞洲報道了開始于2004年6月的新的致死的H5N1的爆發，其目前正在進行中。已在泰國、越南和柬埔寨觀察到約50%死亡率的人類H5N1感染。這些感染主要發生在接觸感染的家禽的人身上，但是有少數的H5N1人-人傳播的病例發生。自從1998年以來，三元重組株甲型流感病毒(Hl)與來源于豬(HA、NP、NA、M以及 NS)、人類(PBl)以及鳥類(PB2和PA)的節段一起在傳播。最近所述的新的豬起源的，是正在進行中的國際性疾病爆發原因的甲型流感(2009H1N1)病毒(S-OIV)為三元重組株病毒， 其包括已與歐亞的豬流感病毒的神經氨酸苷酶(NA)和基質(M)節段重組的該早已存在的病毒的基因成分(S-0IV調查組，2009)。以前的甲型流感病毒(HI)三元重組株病毒偶爾傳播至人類但是沒有有效地在人-人間傳播，但是新的S-OIV可非常高效地在人-人間傳播。 最近29個國家報道了 3440個實驗室確認的S-OIV感染病例。疫情爆發開始于墨西哥，該國記載了總計1364個病例，導致了 45例死亡(3. 3%病例-致死率)。墨西哥以外，只報道了有3例死亡(O. 1%病例-致死率)。此時并不清楚這種死亡率在地理位置上不平衡的原因。雖然目前的S-OIV對神經氨酸苷酶抑制劑奧司地韋(oseltamivir)和扎那米韋 (zanamivir)敏感,卻早已記載了季節性流感病毒進化為賦予耐神經氨酸苷酶抑制劑的變異。S-OIV將取代人類HI成為季節性流感病毒或S-OIV將與另一種病毒株重組以產生另一種新的變體？它將進化變得更致命？從新病毒的鑒定到新疫苗的生產和配送的時間間隔將這些不確定性混合起來。而且，足夠的新病毒血凝素抗原可使大劑量免疫原和加強免疫方案的使用成為必要，這造成了必須迅速地引起保護性免疫的大規模預防接種的實際困難。鑒于這些考慮，存在著對創造新形式的預防和治療的迫切需求，尤其是對于s-οιν，理想地是帶有廣泛的抗各種流感病毒株、亞型以及類型的活性。存在對新形式的甲型流感治療的迫切需求，這是由于(a)已知的該病毒經受連續的低水平抗原漂移及低頻率但是不可預知的導致大流行性疾病的主要抗原漂移的傾向， (b)疫苗接種的明顯失敗，即使當病毒株適度匹配以預防相當大比例的疫苗接受者的流感相關疾病，以及(C)對已批準的流感療法形式(例如金剛烷衍生物以及新近地神經氨酸苷酶抑制劑，奧司他韋)抵抗的頻率增加。鑒于流感病毒所引起的疾病的嚴重程度，存在著對治療流感病毒感染的新療法的即時需求。考慮到缺乏有效的預防或療法，因此本發明的目標是提供用于治療被流感病毒所感染的宿主的治療化合物和方法。發明概述 本發明的實施方案包括，在一方面，可有效地抑制具有單鏈負義基因組的RNA病毒在宿主細胞內復制的抗病毒化合物，該RNA病毒選自正黏液病毒科，包括甲型流感病毒、 乙型流感病毒和丙型流感病毒屬。化合物可靶向于選自以下的區域內的病毒RNA序列1) 負義病毒RNA節段的5’或3’末端的25個堿基；2)正義cRNA的5’或3’末端的末端25個堿基；3)流感病毒mRNA的AUG起始密碼子周圍的45個堿基，以及4)受到選擇性剪接的流感病毒mRNA的剪接供體或受體位點周圍的50個堿基。在某一實施方案中，抗病毒化合物可包括寡核苷酸，其表征為a)耐核酸酶的主鏈，b) 12-40個核苷酸堿基，以及c)長度為至少10個堿基的靶向序列，其與選自以下的靶區域雜交i)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的負義病毒RNA節段的5’或3’ 末端的25個堿基，諸如包含Ml或M2的節段，ii)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的正義cRNA的5’或3’末端的末端25個堿基；iii)流感病毒mRNA的AUG起始密碼子周圍的45個堿基，諸如Ml或M2mRNA ；以及iv)受到選擇性剪接的甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒mRNA的剪接供體或受體位點周圍的50個堿基，諸如Ml或M2mRNA。寡核苷酸也可表征為a)被哺乳動物的宿主細胞主動地攝取的能力，和/或b)與病毒的靶區域形成異源雙鏈體結構的能力，其中所述的異源雙鏈體結構為i)由病毒和寡核苷酸化合物的正義或負義鏈組成，以及ii)以至少45° C的離解Tm為特征。在另一方面，本發明的實施方案包括抑制感染的流感病毒在哺乳動物宿主細胞內復制的抗病毒化合物，該流感病毒具有單鏈的、節段的、負義基因組并選自正黏液病毒科。 化合物可以作為表征為上文所述元件的寡核苷酸給予受感染的宿主細胞。化合物可給予流感病毒感染的或處于流感病毒感染風險中的哺乳動物個體。化合物可由通過不帶電荷的、含磷的亞基間鍵連接的嗎啉亞基組成，將一個亞基的嗎啉氮連接到鄰近亞基的5’環外碳原子。在一方面，亞基間鍵為磷二酰胺鍵，諸如具有以下結構的那些
權利要求
1.分離的抗病毒反義寡核苷酸，所述寡核苷酸包含 a)耐核酸酶的主鏈； b)12-40個核苷酸堿基，以及 c)長度為至少10個堿基的靶向序列，其與選自以下的靶區域雜交 i)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的負義病毒RNA節段的5’或3’末端的25個堿基， ii)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的正義cRNA的5’或3’末端的末端.30個堿基， iii)流感病毒mRNA的AUG起始密碼子周圍的45個堿基，以及 iv)受到選擇性剪接的流感病毒mRNA的剪接供體或受體位點周圍的50個堿基。
2.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸通過與病毒的靶區域形成異源雙鏈體結構的能力表征，其中所述異源雙鏈體結構為 a)由所述病毒的正義或負義鏈與所述寡核苷酸化合物組成，以及 b)通過至少45°C的離解Tm表征。
3.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少10個堿基，其與選自以下的靶區域互補 i)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的Ml或M2區域的負義病毒RNA節段的5’或3’末端的25個堿基， ii)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的Ml或M2區域的正義cRNA的5’或.3’末端的末端30個堿基， iii)流感Ml或M2mRNA的AUG起始密碼子周圍的45個堿基，以及 iv)流感Ml或M2RNA的剪接供體或受體位點周圍的50個堿基。
4.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含通過不帶電荷的、含磷的亞基間鍵連接的嗎啉亞基，所述亞基間鍵將一個亞基的嗎啉氮連接到鄰近亞基的5’環外碳原子。
5.如權利要求4所述的寡核苷酸，其中所述嗎啉亞基通過符合以下結構的磷二酰胺鍵連接
6.如權利要求5所述的寡核苷酸，其中X=NR2，并且其中每一R獨立地為氫或甲基，以及對帶正電荷的鍵而言，X為I-哌嗪。
7.如權利要求6所述的寡核苷酸，其中至少2個且不超過總數一半的亞基間鍵為帶正電荷的。
8.如權利要求6所述的寡核苷酸，其中所述嗎啉寡聚物包含如SEQID NO: 13所示的帶正電荷的亞基間鍵。
9.如權利要求I所述的寡核苷酸,其中所述病毒的靶區域包含SEQID N0:1-11中的任意一個或多個。
10.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述病毒的靶區域包含SEQID NO:2或4。
11.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQIDNO: 12-47中任意一個或多個的至少10個連續堿基。
12.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQIDNO: 12或13。
13.如權利要求13所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸為肽核酸(PNA)。
14.如權利要求13所述的PNA寡核苷酸，其包含SEQID NO:48-62中的任意一個或多個的至少10個連續堿基。
15.如權利要求14所述的寡核苷酸，其基本上由SEQID NO:48-62中的一個或多個組成。
16.如權利要求I所述的寡核苷酸,其包含一個或多個鎖核酸(LNA)亞基。
17.如權利要求16所述的寡核苷酸，其基本上由LNA亞基組成。
18.如權利要求16所述的寡核苷酸，其包含SEQID NO:63_114中的任意一個或多個的至少10個連續堿基。
19.如權利要求18所述的寡核苷酸，其基本上由SEQID NO:63-114中的一個或多個組成。
20.如權利要求I所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸連接至增強宿主細胞對所述化合物的攝取的富精氨酸多肽。
21.如權利要求20所述的寡核苷酸，其中所述富精氨酸多肽選自由SEQIDNO:115-128。
22.減少流感病毒復制的方法，包括將流感病毒感染的細胞與權利要求1-21中任一項所述的抗病毒反義寡核苷酸接觸。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述細胞在個體中，并且所述方法包括給予所述個體所述反義寡核苷酸。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述個體具有繼發性細菌感染，所述方法還包括細菌抗生素與所述抗病毒反義寡核苷酸的單獨地或同時地聯合給藥。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述繼發性細菌感染為鏈球菌肺炎感染。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述抗生素為β-內酰胺。
27.如權利要求24所述的方法，其中所述抗生素選自盤尼西林、阿莫西林、頭孢菌素、氯霉素和克林霉素。
28.如權利要求23或權利要求24所述的方法，還包括靶向于編碼⑶200或⑶200受體的RNA分子的反義寡核苷酸與抗病毒反義寡核苷酸的單獨地或同時地聯合給藥。
29.包含權利要求1-21中任一項所述的反義寡核苷酸和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
30.如權利要求29所述的藥物組合物，還包含細菌抗生素。
31.如權利要求29所述的藥物組合物，還包含靶向于編碼⑶200或⑶200受體的RNA分子的反義寡核苷酸。·
全文摘要
本發明涉及反義抗病毒化合物以及在抑制正黏液病毒(Orthomyxoviridae)科的病毒生長和治療病毒感染中的使用及產生它們的方法。該化合物在治療哺乳動物的流感病毒感染中特別有用。示例性的反義抗病毒化合物為基本上不帶電荷或部分地帶正電荷的嗎啉代寡核苷酸，其具有1)耐核酸酶的主鏈，2)12-40個核苷酸堿基，以及3)長度為至少12個堿基的靶向序列，該靶向序列與選自以下的靶區域雜交a)甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒的負義病毒RNA節段的5’或3’末端的25個堿基；b)正義vcRNA的5’或3’末端的末端30個堿基；c)流感病毒mRNA的AUG起始密碼子周圍的45個堿基，以及d)受到選擇性剪接的流感病毒mRNA的剪接供體或受體位點周圍的50個堿基。
文檔編號C12N15/113GK102712928SQ201080061009
公開日2012年10月3日 申請日期2010年11月12日 優先權日2009年11月13日
發明者帕特里克·L·艾偉森 申請人:Avi生物制藥公司