在缺血和缺血再灌注損傷中的微小rna調節的制作方法

專利名稱：在缺血和缺血再灌注損傷中的微小rna調節的制作方法
技術領域：
本發明概括地涉及心臟學、病理學和分子生物學領域。特別地，本發明包含響應缺血心臟組織的缺血和再灌注而受到調節的幾種miRNA。對這些鑒定的miRNA的表達的操作提供了用于治療心肌缺血和其他形式的缺血損傷的新治療方法。
背景技術：
心臟病及其表現，包括冠狀動脈疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，明確呈現為美國當今的主要健康風險。診斷、治療和贍養患有這些疾病的患者的費用高達(iswell into)數十億美元。心臟病特別嚴重的表現是心肌梗死。心肌梗死(MI)更通常稱為心臟病發作，是當對于心臟的一部分的血液供給中斷時發生的醫學狀況，最通常是由于易損斑塊的破裂。血液供給中的中斷最初導致缺血和氧不足引起的損害，這可以進展為心臟組織死亡(即梗死)。它遍及全世界對于男性和女性均為死亡主要原因。僅在美國，冠心病是5例死亡中I例的原因，并且大約7，200, 000個男性和6，000, 000個女性正忍受著某一形式的冠心病。在他們中，每年1，200，000人患有新的或復發性冠心病發作，并且其中約40%由于發作而死亡。這意味著大致每65秒，I個美國人死于冠心病事件。心肌梗死的先兆是心肌缺血。心肌缺血在氧輸送不能滿足心臟中的心肌代謝需要時發生。這種缺陷可以起因于氧的減少供應(減少的冠狀動脈血流)或對于氧增加的心肌需求(增加的壁壓力或后負荷)。盡管缺氧是必須組分，但它不是由缺血心臟經歷的唯一環境應激。缺血產生損傷心血管功能的多種環境應激。因此，多個信號傳導途徑在使細胞損傷降到最低且維持心輸出量的嘗試中在缺血損傷過程中在哺乳動物細胞中是激活的。在激活的轉錄調節物中有缺氧誘導因子(HIF)轉錄因子家族的成員。響應減少的氧濃度，HIF因子調節影響眾多細胞過程的多種基因，所述細胞過程包括代謝(增強的葡萄糖攝取)、經由血管生成的新血管形成、細胞存活和氧輸送，所有這些在心臟中是重要的。這些基因表達級聯是快速的且影響對于心肌缺血的最初應答，這影響心肌收縮力中所得到的減少。缺血后通常為組織的再灌注，允許氧和代謝底物的重新接納，它們替換缺血代謝產物。再灌注過程誘導心肌中的生物化學、結構和功能變化，并且可以傾斜細胞存活和細胞死亡之間的平衡。與MI后重塑相關的基因表達和信號傳導途徑中的變化已得到深入研究，目的是鑒定可能允許受損心臟的功能恢復的治療靶。近來，微小RNA在心臟肥大和心力衰竭中的關鍵作用已得到描述，指向心臟病調節的新模式(van Rooi j等人(2006)Proc Natl AcadSci USA，第 103 卷(48) :18255-60 ;vanRooij 和 Olson(2007) J Clin Invest.，第 117 卷[9]:2369-76 ；van Rooi j 等人(2008) Proc Natl Acad Sci USA，第 105 卷(35) : 13027-32)。微小RNA(miRNA)是長度約18-約25個核苷酸的小的非蛋白質編碼RNA，其衍生自單個miRNA基因、蛋白質編碼基因的內含子、或通常編碼多個緊密關聯的miRNA的多順反子轉錄物。參見 Carrington 等人的綜述(Science,第 301 卷(5631) : 336-338, 2003)。當 miRNA和靶mRNA的序列完全互補時，miRNA通過促進靶mRNA的降解來充當靶mRNA的阻遏物，或當miRNA和靶mRNA的序列含有錯配時，miRNA通過抑制翻譯來充當靶mRNA的阻遏物。miRNA通過RNA聚合酶II (pol II)或RNA聚合酶III (pol III;參見Qi等人(2006)Cellular & Molecular Immunology,第 3 卷:411-419)轉錄，并且產生自稱為初級miRNA轉錄物(pri-miRNA)的最初轉錄物，其一般長幾千個堿基。pri-miRNA通過RNA酶Drosha在核中加工成約70-至約100-個核苷酸的發夾形前體(pre-miRNA)。在轉運至細胞質后，發夾pre-miRNA通過Dicer進一步加工，以產生雙鏈miRNA。成熟miRNA鏈隨后摻入RNA誘導沉默復合體(RISC)內，在其中它通過堿基配對互補性與其靶mRNA結合。在其中miRNA與mRNA祀完全堿基配對的相對罕見的情況下,它促進mRNA降解。更通常地，miRNA 與革巴mRNA形成不完全異源雙鏈體,影響mRNA穩定性或抑制mRNA翻譯。基于在小鼠和人中的遺傳研究，越來越明確的是miRNA確實活躍地涉及心臟重塑、生長、傳導性(conductance)和收縮力(在 van Rooij 和 Olson(2007)Journal ofClinical Investigation,第117卷(9) : 2369-2376中綜述)。心臟缺血誘導可以影響心室的功能和對存活的預后的重塑，這依賴于肌細胞損失的程度和存活心肌組織的重塑程度。涉及響應缺血的最初細胞重塑過程的miRNA的鑒定和表征可以提供新治療方法，以減少或消除缺血損傷的適應不良效應。發明概述本發明部分基于在缺血事件或缺血繼以組織再灌注后立即在心臟組織中受到調節的幾種miRNA的發現。對這些鑒定的miRNA的調節呈現出用于治療心肌缺血且預防心肌梗死和心力衰竭發展的新治療方法。相應地，本發明提供了在有此需要的受試者中治療或預防心肌缺血的方法，其包括調節一種或多種鑒定的miRNA在該受試者的心臟細胞中的表達或活性。在一個實施方案中，所述一種或多種miRNA選自miR-15家族成員、miR-21、miR_26a、let_7b、miR-199、miR-320、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-574、miR_92a、miR-499、miR-101a、miR-101b、miR_125b、miR-145、miR-126、miR-30 家族成員、miR-143、miR-185、miR_34a、miR-1、miR-133、miR-210 和 miR-29a_c。在特定實施方案中，受試者具有冠狀動脈疾病。在一個實施方案中，該方法包括給受試者施用一種或多種鑒定的miRNA的抑制齊U。例如，所述抑制劑可以是選自miR-15家族成員、miR-92a、miR-320、miR-21、miR-199、miR-499和miR-30家族成員的miRNA的表達或活性的抑制劑。所述一種或多種miRNA的抑制劑可以包括Antagomir或反義寡核苷酸。在另一個實施方案中，該方法包括給受試者施用一種或多種鑒定的miRNA的激動齊U。在某些實施方案中，所述激動劑增加選自miR-126、miR-143、miR-210和miR-29a_C的miRNA的表達或活性。在特定實施方案中，一種或多種miRNA的激動劑是包含一種或多種miRNA的成熟序列的多核苷酸。所述激動劑可以在體內由表達構建體表達。在某些實施方案中，治療或預防心肌缺血的方法進一步包括施用第二心臟治療齊U。第二心臟治療劑可以是開處方為治療心絞痛或冠狀動脈疾病的試劑。在一個實施方案中，第二心臟治療劑選自抗心絞痛藥、β -阻斷劑、Ionotrope、利尿藥、ACE-I、AII拮抗劑、內皮縮血管肽受體拮抗劑、HDAC抑制劑和鈣通道阻斷劑。本發明還包括預防或治療有此需要的受試者中的缺血再灌注損傷的方法。在特定實施方案中，該方法包括施用在再灌注損傷后受到調節的一種或多種miRNA的調節劑。調節劑可以是miRNA功能或表達的抑制劑或激動劑。在另一個實施方案中，本發明包含預防或減少有此需要的受 試者中響應缺氧的心肌細胞損失的方法，其包括給受試者施用miR-199、miR-320的抑制劑和/或miR-210的激動劑。在某些實施方案中，miR-210的激動劑是轉錄因子HIFl α。附圖
簡述圖I.在缺血損傷后的心臟組織中的miR_199a表達。在心肌梗死誘導后6、24和48小時關于從小鼠的梗死區中分離的組織的miR-199a的實時PCR分析。圖2. HIFl α響應miR-199抑制在心肌細胞中是上調的。A.在用針對miR_199a的antimiR或錯配對照(MM)處理的心肌細胞中的HIFl α表達的Northern印跡分析。B.在小鼠中在antimiR-199a或錯配對照(MM)靜脈內注射后在多種組織中關于miR-199的實時PCR分析。圖3. miR-320在心肌缺血后的心臟組織中是下調的。在心肌缺血誘導后6、24和48小時關于從小鼠的梗死區中分離的組織的miR-320的實時PCR分析。圖4. miR-210的表達在缺血和缺氧后的心臟細胞中被誘導。A.在心肌缺血誘導后
6、24和48小時關于從小鼠的梗死區中分離的組織的miR-210的實時PCR分析。B.在體外暴露于缺氧條件后6和12小時關于大鼠新生兒心肌細胞的miR-210的實時PCR分析。圖5.特定miRNA響應缺血再灌注被調節。在再灌注后的缺血組織中統計上顯著受到調節的miRNA的熱圖(p〈0. 01)。發明詳述本發明部分基于在缺血損傷后立即受到調節的miRNA亞組的鑒定。特別地，本發明人發現在缺血事件后的前48小時內，在缺血組織中顯著上調的至少30種miRNA和在缺血組織中下調的至少38種miRNA。miRNA亞組顯示出在缺血事件后立即的動態調節某些miRNA的表達最初是下調的隨后為上調，而其他的表達最初是上調的隨后為下調。此夕卜，本發明人發現在缺血事件后在再灌注的心臟組織中待調節的重疊但獨特的miRNA亞組。發現在再灌注的心臟組織中至少32種miRNA是顯著上調的，而至少48種miRNA是顯著下調的。調節的miRNA中的重疊提示miRNA可以涉及在不同時間點時的不同心臟病過程，并且可以作用于影響疾病狀態。因此，存在涉及心臟對缺血損傷的響應的一組miRNA，并且對這些特定miRNA的活性或表達的操作可以導致對心臟重塑的控制，從而使得任何潛在所致的梗死在大小上得到限制，并且心肌收縮力得到維持。相應地，本發明提供了在有此需要的受試者中治療或預防心肌缺血的方法，其包括調節受試者的心臟細胞中在表I和2中列出的一種或多種miRNA的表達或活性。本發明還包括表I和2中列出的miRNA的相應人序列。在特定實施方案中，一種或多種miRNA選自miR-15家族成員(例如miR-15a、miR-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、miR-424 和 miR-497)(SEQ ID NOs :1_6)、miR-21(SEQ ID NO:7)、miR_199a(SEQ ID NOs :8_9)、miR_320(SEQ ID NO:10),miR-214(SEQID NO: 11), miR-10a(SEQ ID NO: 12)、miR-10b (SEQ ID NO: 13)、miR-574 (SEQ IDNOs 14-15)、miR-92a (SEQ ID NO: 16)、miR-499 (SEQ ID NOs : 17-18)、miR-101a/miR-101b (SEQID NO: 19),miR-126 (SEQ ID NO: 20)、miR-30 家族成員(例如 miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d 和 miR_30e) (SEQ ID NOs :21-25)、miR-143 (SEQ ID NO: 26)、miR-185 (SEQ IDN0:27)、miR-34a(SEQ IDNO:28)、miR-1(SEQ ID NO:29)、miR-133a/miR_133b(SEQ ID NOs 30-31),miR-210(SEQ ID NO:32)、miR-29a_c(SEQ ID NOs :33-35)、miR_26a(SEQ IDNO:37),let-7b(SEQ ID NO:38)、miR_125b (SEQ ID NO:39)和 miR-145(SEQID NO:40)。如本文使用的，術語“調節”指miRNA的生物學活性中的變化或 改變。調節可以是miRNA的表達水平中的變化、miRNA的結合特征中的變化(例如對于靶mRNA或RISC復合體的組分)、或與miRNA相關的生物學或功能性質中的任何其他變化。調節可以是miRNA的表達或功能中的增加或減少。術語“調節劑”指能夠改變或更改如上所述的miRNA的表達或生物學活性的任何分子或化合物。調節劑可以是miRNA功能或表達的抑制劑，或它可以是miRNA功能或表達的激動劑。如本文使用的，術語“心肌缺血”或“缺血”指在心臟內的狀況，其起因于向心肌的血液供給不足。缺血可以涉及例如向心臟組織的有限血流量，其是由于通過正常供應心臟組織的一個或多個冠狀動脈的堵塞或減少的流動。缺血損害包括心肌細胞的損失、心臟肥大、心肌病、心臟收縮力的減少和心律不齊。當對于局限性區域的血液供給被剝奪延長的時間段從而使得心臟細胞死亡時，導致梗死。“梗死”是組織中的凝固性壞死區域，其起因于向該區域的循環的阻塞。在受試者的心臟組織中本文公開的一種或多種miRNA的表達或活性的調節在減少或預防缺血損害方面是有效的，包括預防梗死的發展或減少梗死面積、維持心臟收縮力且使受試者中的心臟重塑降到最低，所述受試者已經歷缺血事件或處于經歷缺血事件的風險中。在心臟中的缺血和所致的缺血損害通過缺血事件或損傷引起。“缺血事件”或“缺血損傷”是導致或可以導致對心臟組織的血液供給不足的任何情況。由本發明包含的缺血事件或損傷包括但不限于低血糖癥、心動過速、動脈粥樣硬化、低血壓、血栓栓塞、血管的外部擠壓、栓塞、鐮狀細胞病、通常伴隨發炎脈管的管腔中的血栓的炎癥性過程、出血、心力衰竭和心臟停搏、休克包括膿毒性休克和心源性休克、高血壓、血管瘤和體溫過低。在一個實施方案中，在有此需要的受試者中治療或預防心肌缺血的方法包括給受試者施用在表I和2中列出的一種或多種miRNA的抑制劑。在另一個實施方案中，所述抑制劑是選自下組的一種或多種miRNA的表達或活性的抑制劑miR-15家族成員(例如miR-15a、miR-15b、miR-16-l、miR-16-2、miR-195、miR-424 和 miR-497)(SEQ ID NOs :1_6)、miR-92a(SEQ ID NO:16),miR-21(SEQ ID NO:7)、miR_199a(SEQ ID NOs 8-9),miR-320 (SEQID NO: 10)、miR-499 (SEQ ID NOs :17-18)和 miR-30 家族成員(例如 miR_30a、miR_30b、miR-30c、miR-30d 和 miR-30e)(SEQ ID NOs :21-25)。在特定實施方案中，一種或多種miRNA的抑制劑是反義寡核苷酸。反義寡核苷酸可以包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或其組合。優選地，反義寡核苷酸具有至少一種化學修飾(例如糖或主鏈修飾)。例如，合適的反義寡核苷酸可以包含一種或多種“構象限制的”或二環糖核苷修飾(BSN)，其對于在含有BSN的寡核苷酸及其互補微小RNA靶鏈之間形成的復合物賦予增強的熱穩定性。例如，在一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個“鎖核酸”。鎖核酸(LNA)含有2’ _0，4’ -C-亞甲基核糖核苷(結構A)，其中核糖糖部分呈“鎖定”構象。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個2’，4’ -C-橋接的2’脫氧核糖核苷(CDNA，結構B)。參見例如，美國專利號6，403，566和Wang等人(1999) Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters,第9卷1147-1150,將這兩篇都整體引入本文作為參考。在另外一個實施方案中，反義寡核苷酸含有至少一個具有結構C中所示結構的修飾核苷。靶向一種或多種miRNA的反義寡核苷酸可以含有BSN(LNA、CDNA等)或其他修飾核苷、
和核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的組合。
權利要求
1.一種在有此需要的受試者中治療或預防心肌缺血的方法，其包括調節在表I和2中列出的一種或多種miRNA在該受試者的心臟細胞中的表達或活性。
2.權利要求I的方法，其中所述一種或多種miRNA選自miR-15家族成員、miR-21、miR_26a、let_7b、miR_199a、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-574、miR-320、miR_92a、miR-499、miR-101a、miR-101b、miR_125b、miR-126、miR-30 家族成員、miR-143、miR-145、miR-185、miR_34a、miR-1、miR-133、miR-210 和 miR-29a_c。
3.權利要求2的方法，其中調節包括給所述受試者施用選自miR-15家族成員、miR-92a、miR-320、miR-21、miR-199a、miR-499 和 miR-30 家族成員的一種或多種 miRNA 的抑制劑。
4.權利要求3的方法，其中所述一種或多種miRNA的抑制劑是反義寡核苷酸或Antagomir0
5.權利要求4的方法,其中所述反義寡核苷酸包含與所述一種或多種miRNA的成熟序列至少部分互補的序列。
6.權利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸包含至少一種糖和/或主鏈修飾。
7.權利要求4的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度為約8至約18個核苷酸。
8.權利要求2的方法，其中調節包括給所述受試者施用選自miR-126、miR-143、miR-210和miR-29a-c的一種或多種miRNA的激動劑。
9.權利要求8的方法，其中所述一種或多種miRNA的激動劑是包含所述一種或多種miRNA的成熟序列的多核苷酸。
10.權利要求9的方法，其中所述激動劑由表達構建體表達。
11.權利要求3或8的方法，其中所述抑制劑或激動劑通過靜脈內施用、皮下施用、或直接注射到心臟組織內而施用于所述受試者。
12.權利要求3或8的方法，其中所述抑制劑或激動劑通過經口、經皮、持續釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、導管或舌下施用而施用于所述受試者。
13.權利要求I的方法，其中所述受試者具有冠狀動脈疾病。
14.權利要求I的方法，其中在調節一種或多種所述miRNA的表達或活性后在所述受試者中心肌細胞損失被減少或防止。
15.權利要求I的方法，其進一步包括施用第二心臟治療劑。
16.權利要求12的方法，其中所述第二心臟治療劑選自抗心絞痛藥、β阻斷劑、Ionotrope、利尿藥、ACE抑制劑、血管緊張素2型拮抗劑、內皮縮血管肽受體拮抗劑、HDAC抑制劑和鈣通道阻斷劑。
17.權利要求I的方法，其中所述受試者是人。
18.—種在有此需要的受試者中預防或減少響應缺氧的心肌細胞損失的方法，其包括給所述受試者施用miR-199a、miR-320的抑制劑和/或miR-210的激動劑。
19.權利要求18的方法，其中所述miR-199a或miR-320的抑制劑是反義寡核苷酸或Antagomir0
20.權利要求18的方法，其中所述miR-210的激動劑是包含miR-210的成熟序列的多核苷酸。
21.權利要求18的方法，其中所述激動劑是HIFlα。
22.權利要求18的方法，其中所述激動劑由表達構建體表 達。
全文摘要
本發明涉及缺血和缺血再灌注損傷后的心臟重塑中涉及的miRNA的鑒定。這些miRNA的亞組在缺血事件后的短時間內受到調節，指示這些miRNA在后續病理學事件的誘導中起重要作用。描述了對這些鑒定的miRNA的調整作為用于心肌缺血和缺血再灌注損傷的治療或預防。
文檔編號C12N15/11GK102791859SQ201080063933
公開日2012年11月21日 申請日期2010年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者D.奎亞特, E.N.奧爾森, E.V.魯伊杰 申請人:得克薩斯系統大學董事會