新纖維素酶基因的制作方法

專利名稱：新纖維素酶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及纖維素酶，具體涉及解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus) 來源的纖維素酶、編碼該纖維素酶的多核苷酸、利用了該多核苷酸的纖維素酶的制造方法及其用途。而且，在本說明書中，“多核苷酸”包括例如DNA或者RNA、或它們的修飾體或者嵌合體，優選為DNA。
背景技術：
纖維素酶是分解纖維素的酶的總稱，一般而言，微生物生產的纖維素酶中包括多種纖維素酶成分。纖維素酶成分根據其底物特異性可分為纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、 β -葡萄糖苷酶這3類,對于作為產生纖維素酶的絲狀真菌的黑曲霉(Aspergillus niger) 而言，可以認為其最多產生4種纖維二糖水解酶、15種內切葡聚糖酶、15種β -葡萄糖苷酶。因此，在對微生物產生的纖維素酶進行產業利用時，是以該微生物生產的各種纖維素酶成分的混合物的形式加以利用。
絲狀真菌解纖維素枝頂孢的特點是生產糖化力強的纖維素酶(非專利文獻I)，有報告稱，其在飼料用途、 青貯飼料用途方面具有高有用性(專利文獻1-3)。此外，對其所含有的纖維素酶成分(專利文獻4-10)進行了詳細研究，已知其與其他絲狀真菌一樣分泌多種纖維素酶成分。
可以認為，在限定于某種用途的情況下，多種纖維素酶成分中，特定的數種酶成分對其用途而言是重要的。因此，如果能夠根據利用的用途對微生物生產的纖維素酶進行纖維素酶成分組成的最適化，則可以期待獲得活性更高的纖維素酶。為止的最佳方法是通過基因重組方法導入特定的酶基因進行過度表達、或者缺損特定的酶基因。
然而，對于解纖維素枝頂孢的情況，在多種纖維素酶成分中，僅分離出了 2種纖維二糖水解酶基因(專利文獻4、5)以及I種β-葡萄糖苷酶基因(專利文獻10)，現狀是，對于其他的纖維素酶無法利用基因導入進行表達增強、或者利用缺損進行表達抑制。
在這樣的背景中，為了通過基因重組技術將解纖維素枝頂孢產生的纖維素酶的組成最適化，希望分離出內切葡聚糖酶、β_葡萄糖苷酶等多糖分解酶基因。
現有技術文獻
非專利文獻
非專利文獻 I !Agricultural and Biological Chemistry,(日本)，1987 年，第51 卷，p.65
專利文獻
專利文獻I :日本特開平7-264994號公報
專利文獻2 :日本專利第2531595號說明書
專利文獻3 :日本特開平7-236431號公報
專利文獻4 :日本特開2001-17180號公報
專利文獻5 :國際公開W097/33982號小冊子8
專利文獻6 :國際公開W099/011767號小冊子
專利文獻7 日本特開2000-69978號公報
專利文獻8 :日本特開平10-066569號公報
專利文獻9 :日本特開2002-101876號公報
專利文獻10 日本特開2000-298262號公報發明內容
發明所要解決的問題
本發明的課題是通過從解纖維素枝頂孢分離出包含分類于內切葡聚糖酶、 β-葡萄糖苷酶的纖維素酶基因的基因組DNA，并解析其堿基序列，確定內切葡聚糖酶以及 β-葡萄糖苷酶基因。
解決問題的方法
技術領域：
本發明為解決上述問題，對已知的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶的氨基酸序列進行了深入比較，發現了即使在解纖維素枝頂孢中也保守的氨基酸序列，并基于本信息設計了各種引物。使用這樣設計的各種引物，以基因組DNA或cDNA作為模板實施了 PCR。 其結果得到了內切葡聚糖酶以及β -葡萄糖苷酶的基因片段，因而基于本基因片段設計引物，繼續進行PCR，從而擴增出了 9種內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，并進行了堿基序列解析，從而完成了本發明。
S卩，本發明涉及
[I]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的I 306位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[2]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的I 475位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[3]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的I 391位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[4]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的1 376位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[5]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
(i)包含SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的I 221位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO :10所述的氨基酸序列的f 221位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的f 221位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[6]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的1 319位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO :12所述的氨基酸序列的f 319位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的f 319位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[7]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的1 301位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶、
[8]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 16所述的氨基酸序列的I 458位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO :16所述的氨基酸序列的I 458位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 16所述的氨基酸序列的I 458位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的葡糖苷酶、
[9]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白質
⑴包含SEQ ID NO 18所述的氨基酸序列的I 457位的序列的蛋白質；
(ii)包含在SEQ ID NO :18所述的氨基酸序列的廣457位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；
(iii)包含與SEQ ID NO 18所述的氨基酸序列的f457位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的葡糖苷酶、
[10]絲狀真菌來源的[1Γ[9]所述的蛋白質、
[11] [10]所述的蛋白質，其中，絲狀真菌是屬于解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)的絲狀真菌、
[12]包含編碼[1Γ[9]所述的蛋白質的堿基序列的多核苷酸、
[13]包含SEQ ID NO 1所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[14]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
⑴編碼[I]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 1所述的堿基序列的136 1437位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 1所述的堿基序列的136 1437位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[15]從[14]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[16] [15]所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQ ID NO : I所述的堿基序列的233 291位、351 425位、579 631位、697 754位或853 907位的序列中的I個以上的序列的序列、
[17]從[13] [16]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[18] [17]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO : I所述的堿基序列的136 216位的序列、
[19]包含SEQ ID NO 3所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[20]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:
⑴編碼[2]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 3所述的堿基序列的128 1615位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 3所述的堿基序列的128 1615位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[21]從[19] [20]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[22] [21]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :3所述的堿基序列的128 187位的序列、
[23]包含SEQ ID NO 5所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[24]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:
⑴編碼[3]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 5所述的堿基序列的169 1598位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 5所述的堿基序列的169 1598位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[25]從[24]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[26] [25]所述的DNA，其中，內含子序列是包含SEQ ID NO 5所述的堿基序列的 254 309位、406 461位或1372 1450位的序列選自中的I個以上的序列序列、
[27]從[23] [26]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[28] [27]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :5所述的堿基序列的169 231位的序列、
[29]包含SEQ ID NO 7所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[30]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
⑴編碼[4]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 7所述的堿基序列的70 1376位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 7所述的堿基序列的70 1376位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、11
[31]從[30]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[32] [31]所述的DNA，其中，內含子序列是選自SEQ ID NO 7所述的堿基序列的 45Γ500位或765 830位的序列中的I個以上的序列的序列、
[33]從[29] [32]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[34] [33]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :7所述的堿基序列的7(Γ129位的序列、
[35]包含SEQ ID NO 9所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[36]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
(i)編碼[5]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 9所述的堿基序列的141 974位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 9所述的堿基序列的141 974位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[37]從[36]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[38] [37]所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQ ID NO :9所述的堿基序列的551飛09位或831 894位的序列中的I個以上的序列的序列、
[39]從[35] [38]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[40] [39]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :9所述的堿基序列的14廣185位的序列、
[41]包含SEQ ID NO : 11所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[42]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
⑴編碼[6]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 11所述的堿基序列的114 1230位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 11所述的堿基序列的114 1230位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[43]從[42]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[44] [43]所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQ ID NO 11所述的堿基序列的183 232位或299 357位的序列中的I個以上的序列的序列、
[45]從[41] [44]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[46] [45]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO 11所述的堿基序列的11Γ161位的序列、
[47]包含SEQ ID NO 13所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[48]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
⑴編碼[7]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 13所述的堿基序列的124 1143位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO :13所述的堿基序列的124 1143位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA、
[49]從[48]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[50] [49]所述的DNA，其中，內含子序列是SEQ ID NO :13所述的堿基序列的 225 275位的序列、
[51]從[47] [50]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[52] [51]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO 13所述的堿基序列的12Γ186位的序列、
[53]包含SEQ ID NO 15所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[54]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
(i)編碼[8]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 15所述的堿基序列的238 1887位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 15所述的堿基序列的238 1887位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質的DNA、
[55]從[54]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[56] [55]所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQ ID NO 15所述的堿基序列的78Γ850位、1138 1205位或1703 1756位的序列中的I個以上的序列序列、
[57]從[53] [56]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[58] [57]所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO 15所述的堿基序列的238 321位的序列、
[59]包含SEQ ID NO 17所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA、
[60]選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA
(i)編碼[9]所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 17所述的堿基序列的66 1765位的序列的DNA ；
(iii)與由SEQ ID NO 17所述的堿基序列的66 1765位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有β -葡糖苷酶活性的蛋白質的DNA、
[61]從[60]所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA、
[62] [61]所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQ ID NO 17所述的堿基序列的149 211位、404 460位、934 988位或1575 1626位的序列中的I個以上的序列的序列、
[63]從[59Γ[62]所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA、
[64] [63]所述的DNA，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO : 17所述的堿基序列的66 227位的序列、
[65]包含[12Γ[64]所述的DNA的表達載體、
[66]用[65]所述的表達載體轉化的宿主細胞、
[67] [66]所述的宿主細胞，其中，宿主細胞是酵母或絲狀真菌、
[68] [67]所述的宿主細胞，酵母屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬 (Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)、
「69]「681所述的宿主細胞,其中，酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、
[70] [67]所述的宿主細胞，其中，絲狀真菌屬于腐質霉屬(Humicola)、曲霉屬 (AsperRillus)、木霉屬(Trichoderma)、鍵抱菌(Fusarium)或枝頂抱霉屬(Acremonium)、
[71] [70]所述的宿主細胞，其中，絲狀真菌是解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)、特異腐質霉(Humicola insolens)、黑曲霉(AsperRillus niRer)或米曲霉(AsperRillus oryzae)、綠色木霉(Trichoderma viride)、或尖鍵抱菌(Fusariumoxysporum)、
[72]通過同源重組缺損了與[12Γ[64]所述的DNA對應的基因的枝頂孢霉屬 (Acremonium)的絲狀真菌、
[73] [72]所述的絲狀真菌，其中，絲狀真菌是解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)、
[74] [1Γ[9]所述的蛋白質的制造方法，其包括培養[66] [73]所述的宿主細胞、并從該宿主和/或其培養物收集[1Γ[9]所述的蛋白質的步驟、
[75]采用[74]所述的方法生產的蛋白質、
[76]包含[1Γ[9]或者[75]所述的蛋白質的纖維素酶制備物、
[77] 一種對生物量進行糖化的處理方法，該方法包括使含有纖維素的生物量與 [1Γ[9]或者[75]所述的蛋白質、或[76]所述的纖維素酶制備物接觸的步驟、
[78] 一種含有纖維素的纖維的處理方法，該方法包括使含有纖維素的纖維與 [1Γ[9]或者[75]所述的蛋白質、或[76]所述的纖維素酶制備物接觸的步驟、
[79] 一種廢紙的脫墨方法，其特征在于，在用脫墨劑處理廢紙進行脫墨的步驟中， 使用[1Γ[9]或者[75]所述的蛋白質、或[76]所述的纖維素酶制備物、
[80] 一種改善紙或紙漿的濾水性的方法，該方法包括將紙或紙漿用[I] [9] 或者[75]所述的蛋白質、或[76]所述的纖維素酶制備物進行處理的步驟、
[81] 一種改善動物飼料的消化性的方法，該方法包括將動物飼料用[1Γ[9]或者[75]所述的蛋白質、或[76]所述的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
發明的效果
根據本發明，能夠獲得以重組蛋白質的形式高效生產來源于解纖維素枝頂孢的特定內切葡聚糖酶以及β -葡萄糖苷酶所必需的DNA，此外，能夠獲得高效表達這些纖維素酶成分的重組微生物。而且，通過培養所得的重組微生物，能夠高效廉價地生產特定的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶。
此外，根據本發明，能夠在解纖維素枝頂孢的基因組中缺損特定的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因，其結果是能夠得到生產不含這些內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶的纖維素酶的重組解纖維素枝頂孢，能夠生產不含特定的內切葡聚糖酶以及β _葡萄糖苷酶纖維素酶的纖維素酶。
通過本發明所得的各種纖維素酶中，選擇最適的纖維素酶群，對纖維素系底物進行處理，能夠有效且廉價地分解這些纖維素系底物。


[圖I]
[圖2]
[圖3]
[圖4]
[圖5]
[圖6]
[圖7]質粒PACC3的限制酶圖譜。 質粒PACC5的限制酶圖譜。 質粒PACC6的限制酶圖譜。 質粒PACC7的限制酶圖譜。 質粒PACC8的限制酶圖譜。 質粒PACC9的限制酶圖譜。 質粒pACCIO的限制酶圖譜。14
[圖8]質粒pBGLC的限制酶圖譜。
[圖9]質粒pBGLD的限制酶圖譜。
發明的具體實施方式
內切葡聚糖酶以及β_葡萄糖苷酶
作為本發明的蛋白質的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶可以包含對應于選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18中的氨基酸序列中的成熟蛋白質部分的序列，或者可以包含與該氨基酸序列基本上等同的氨基酸序列。
在本發明中，“基本上等同的氨基酸序列”是指例如，具有I個或者多個(優選數個)氨基酸的取代、缺失、和/或添加引起的修飾、但不影響多肽的活性C的氨基酸序列，或者具有70%以上的同一性的、但不影響多肽的活性的氨基酸序列。
被修飾的氨基酸殘基的數目優選廣40個、更優選f數個、更優選Γ8個、最優選 Γ4個。作為本發明中所稱的“不影響活性的修飾”的例子，可以列舉出保守取代。“保守取代”是指將I個或多個氨基酸殘基用其他化學上類似的氨基酸殘基取代，但基本上不改變多肽的活性。可以列舉出例如將某個疏水性殘基用其它疏水性殘基取代的情況，將某個極性殘基用具有相同電荷的其它極性殘基取代的情況。能夠進行這樣的取代的功能上類似的氨基酸，按氨基酸分類是本技術領域公知的。具體的例子，作為非極性(疏水性)氨基酸可以列舉出丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可以列舉出甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作為具有正電荷(堿性)的氨基酸，可以列舉出精氨酸、組氨酸、賴氨酸等。此外，作為具有負電荷(酸性)的氨基酸，可以列舉出天冬氨酸、谷氨酸等。
本說明書中的“同一性(identity)”是指在作為本領域技術人員公知的同源性檢索程序的 FASTA3 [Science，227，1435-1441 (1985) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988) ；http //www. ddbj. nig. ac. jp/E-mai 1/homology-j. html]中，使用默認 (初期設定)的參數計算出的數值。作為所述同一性，可以是優選80%以上的同一性、更優選90%以上的同一性、更優選95%以上的同一性、更優選98%以上的同一性、特別優選99% 以上的同一'I"生。
對于本發明的蛋白質，可以在對應于成熟蛋白質部分的各氨基酸序列、或與其基本上等同的氨基酸序列的N末端和/或C末端，在不影響酶活性的范圍內，賦予任意的多肽序列。作為這樣的多肽序列，可以列舉出例如信號序列、檢測用標記(例如FLAG標簽)、 純化用多肽[例如、谷胱甘肽硫轉移酶(GST)]。
內切葡聚糖酶以及β_葡萄糖苷酶基因
作為本發明的多核苷酸的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因可以包含編碼所述的本發明的蛋白質的喊基序列，此外，也可以包含選自SEQ ID Ν0:1所述的喊基序列的136 1437位的序列、SEQ ID NO 3所述的堿基序列的128 1615位的序列、SEQ ID NO 5所述的堿基序列的169 1598位的序列、SEQ ID NO 7所述的堿基序列的70 1376位的序列、SEQ ID NO :9所述的堿基序列的141 974位的序列、SEQ ID NO : 11所述的堿基序列的 114 1230位的序列、SEQ ID NO 13所述的堿基序列的124 1143位的序列、SEQ ID NO 15 所述的堿基序列的238 1887位的序列、SEQ ID NO 17所述的堿基序列的66 1765位的序列中的堿基序列，或者可以包含與該堿基序列在嚴格條件下能夠雜交的堿基序列。
在本發明中，“嚴格條件”是指在高溫下、低鹽濃度溶液中進行雜交后的膜的洗滌操作，例如是指2XSSC濃度(1XSSC :15mmol/L檸檬酸三鈉、150mmol/L氯化鈉)、0. 5%SDS 溶液中、60°C、20分鐘的洗滌條件。_4]內切葡聚糖酶以及β_葡萄糖苷酶基因的獲取
本發明的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因可以采用例如以下的方法從解纖維素枝頂孢或其突變株分離。此外，正如本發明所公開的，堿基序列已經清楚，因而也可以人工化學合成。
采用常規方法從解纖維素枝頂孢的菌體抽提基因組DNA。將該基因組DNA用適當的限制酶消化后，通過與適當的載體進行連接，制作解纖維素枝頂孢的基因組DNA文庫。作為載體，可以使用例如質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、BAC載體等各種載體。
然后，可以基于在本說明書中公開的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因的堿基序列制作適當的探針，通過雜交從基因組DNA文庫分離希望的包含內切葡聚糖酶以及 β-葡萄糖苷酶基因的DNA片段。此外，可以基于在本說明書中公開的內切葡聚糖酶以及 β _葡萄糖苷酶基因的堿基序列制作用于擴增希望的基因的引物，以解纖維素枝頂孢的基因組DNA作為模板實施PCR，通過將擴增出的DNA片段與適當的載體連接，分離出希望的基因。而且，根據本發明的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因包含于質粒pACC3、pACC5、 pACC6、pACC7、pACC8、pACC9、pACCIO、pBGLC以及質粒pBGLD中，因而可以將這些用作PCR的模板DNA。此外，可以從這些質粒利用適當的限制酶制備希望的DNA片段。
微牛物的保藏
pACC3轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC3)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11029。
PACC5轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC5)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11030。
pACC6轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC6)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11031。
PACC7轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC7)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11032。
PACC8轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC8)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11033。
PACC9轉化的大腸桿菌(大腸桿菌T0P10/pACC9)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11034。
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pBGLC轉化的大腸桿菌(大腸桿菌TOPlO/pBGLC)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11036。
pBGLD轉化的大腸桿菌(大腸桿菌TOPlO/pBGLD)于平成20 (2008)年10月9日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(郵編305-8566日本國茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)進行了國際保藏。保藏號是FERM BP-11037。
表達載體以及轉化的微生物
在本發明中，提供一種表達載體，該表達載體能夠在宿主微生物內復制，且以其 DNA序列所編碼的蛋白質能夠表達的狀態包含包含編碼所述的SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18中記載的氨基酸序列、或其修飾氨基酸序列的堿基序列的DNA(以下也稱作“根據本發明的DNA序列”)。本表達載體基本上可以構建成自我復制載體，即以染色體外的獨立體的形式存在、其復制不依賴于染色體的復制，例如質粒。此外，本表達載體可以在將其導入宿主微生物時，整合到該宿主微生物的基因組中并與被其整合的染色體一起復制。根據本發明的載體構建的流程以及方法可以采用基因工程領域常規采用的那些。
就根據本發明的表達載體而言，為了將其實際導入宿主微生物并表達具有希望的活性的蛋白質，除了包含所述的根據本發明的DNA序列之外，優選還包含控制其表達的DNA 序列、用于選擇微生物的基因標記等。作為控制表達的DNA序列，其中包括啟動子、終止子以及編碼信號肽的DNA序列等。對啟動子沒有特殊限制，能夠在宿主微生物中顯示轉錄活性即可，可以作為控制編碼與宿主微生物同種或異種的任何蛋白質的基因的表達的DNA序列獲得。此外，對信號肽沒有特殊限制，能夠在宿主微生物中對蛋白質的分泌做出貢獻即可，可以由衍生自編碼與宿主微生物同種或異種的任何蛋白質的基因的DNA序列獲得。此外，本發明中的基因標記可以視轉化體的選擇方法適宜選擇，可以利用例如編碼藥物抗性的基因、與營養需求性互補的基因。
而且，根據本發明，提供用該表達載體轉化的微生物。對于該宿主_載體系統沒有特殊限制，可以使用例如利用了大腸桿菌、放線菌、酵母、絲狀真菌等的系統、以及利用了這些的與其他蛋白質的融合蛋白質表達系統等。
此外，利用該表達載體轉化微生物，可以按照本領域常規采用的方法來實施。
而且，將該轉化體用適當的培養基進行培養，能夠從其培養物分離得到上述的根據本發明的蛋白質。因此，根據本發明的其他方面，提供所述的根據本發明的新蛋白質的制造方法。轉化體的培養及其條件可以與所使用的微生物的培養及其條件基本等同。此外， 培養轉化體后、回收目的蛋白質的方法可以采用該領域常規采用的那些。
此外，根據本發明中的優選方面，提供能夠表達由根據本發明的DNA序列編碼的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶的酵母細胞。作為本發明中的酵母細胞，可以列舉出例如屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或畢赤酵母屬(Pichia)的微生物，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本發明中的宿主絲狀真菌可以屬于腐質霉屬(Humicola)、曲霉屬(AsperRillus) 或木霉屬(Trichoderma)、鐮孢菌屬(Fusarium)、或枝頂孢霉屬(Acremonium)。而且,作為它們的優選例，可以列舉出特異腐質霉(Humicola insolens)、黑曲霉(AsperRillusniger)或者米曲霉(Aspergillus oryzae)、或綠色木霉(Trichoderma viride)、尖鍵抱菌 (Fusarium oxysporum)、或解纖維素枝頂抱(Acremonium cellulolyticus)。
通過將根據本發明的內切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶基因與適當的載體連接并導入解纖維素枝頂孢，抑制其表達、或利用同源重組對這些基因進行基因破壞來缺損其功能，能夠抑制特定的內切葡聚糖酶以及β_葡萄糖苷酶的表達。利用同源重組進行的基因破壞可以按照常規采用的方法來實施，用于基因破壞的載體的制作、載體對宿主的導入對本領域技術人員而言是顯而易見的。
纖維素酶的制備
將這樣得到的轉化體用適當的培養基進行培養，能夠從其培養物分離得到上述的本發明的蛋白質。轉化體的培養及其條件可以根據所使用的微生物適宜設定。此外，從培養液回收目的蛋白質、純化也可以按照常規方法進行。
纖維素酶制各物
根據本發明的其他方面，提供包含上述的根據本發明的蛋白質(纖維素酶)的纖維素酶制備物。根據本發明的纖維素酶制備物U、根據本發明的纖維素酶中可以混合一般可含的成分、例如賦形劑(例如、乳糖、氯化鈉、山梨糖醇等)、表面活性劑、防腐劑等來制造。此外，本發明中的纖維素酶制備物可以制備成任何適當的形狀、例如粉末或液體狀。
纖維素酶的用途
根據本發明，可以認為，對于生物量糖化，通過用本發明的纖維素酶(群)或纖維素酶制備物進行處理，能夠顯著地改善糖化。因此，根據本發明，提供一種生物量糖化的改善方法，該方法包括用本發明的纖維素酶(群)或纖維素酶制備物對生物量進行處理的步驟。作為本發明中能夠處理的生物量的例子，可以列舉出稻桿、蔗渣(bagasse)、玉米秸桿、椰子的實等果實的渣、廢木材、以及對這些實施適當前處理而得到的材料。
而且，根據本發明提供一種帶來含有著色的纖維素的纖維的清澈化的方法，該方法包括用纖維素酶(群)或纖維素酶制備物處理含有著色的纖維素的纖維的步驟。以及， 提供一種帶來含有著色的纖維素的纖維的顏色的局部變化的方法，即對含有著色的纖維素的纖維賦予石洗(stone wash)的外觀的方法。該方法包括用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制備物處理含有著色的纖維素的纖維的步驟。
此外，根據本發明，可以認為通過用根據本發明的內切葡聚糖酶進行處理，能夠顯著地改善紙或紙漿的濾水性，而不伴隨強度的顯著降低。因此，根據本發明，提供一種紙漿的濾水性的改善方法，該方法包括用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制備物對紙或紙漿進行處理的步驟。作為本發明中可處理的紙漿的例子，可以列舉出廢紙紙漿、再循環板紙或紙漿、牛皮紙漿、亞硫酸紙漿或加工熱處理及其他高收率紙漿。
而且，通過將根據本發明的內切葡聚糖酶應用于動物飼料中，能夠改善飼料中的葡聚糖的消化性。因此，根據本發明，提供一種改善動物飼料的消化性的方法，該方法包括用本發明的內切葡聚糖酶或纖維素酶制備物對動物飼料進行處理的步驟。實施例
通過實施例對本發明進行具體說明，但本發明只要不超出其要旨即可，其不受以下的實施例的限定。
《實施例I:ACC3基因的克隆》
(1-1)基因組DNA的分離
將解纖維素枝頂抱(Acremoniumcellulolyticus)ACCP-5-1 株用(S)培養基(2% 肉湯、O. 5%酵母提取物以及2%葡萄糖)32°C培養2天，通過離心分離回收了菌體。從所得菌體中按照堀內等的方法(H. Horiuchi et. al. , J. Bacteriol. ,170,272-278, (1988))分離了基因組DNA。
(1_2)ACC3基因片段的取得
基于分類在糖苷水解酶家族5 (Glycoside Hydrolase family 5)中的已知的內切葡聚糖酶的序列，制作了以下的引物。
ACC3-F GGGCGTCTGTRTTYGARTGT(SEQ ID NO 19)
ACC3-R AAAATGTAGTCTCCCCACCA(SEQ ID NO 20)
ACC3-F以及ACC3-R作為引物使用，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至 53°C，其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的Ikbp的DNA片段用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 T0P0-pACC3-partial。
克隆至質粒T0P0-pACC3_partial中的插入DNA片段的測序使用BigDye Terminator v3. ICycle Sequebcing Kit (Applied Biosystems 公司制造)和 ABI PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems公司制造)，按照附帶的規程進行。其結果，將得到的堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行同源性檢索，結果與埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)來源的內切葡聚糖酶EGl (Q8WZD7)顯示74%的同一性，因而判斷本DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族5)基因的一部分。
(1-3)利用反向PCR法取得ACC3基因全長
反向PCR法按照Triglia等的方法(TTriglia et. al. ,Nucleic Acids Research, 16,8186, (1988))實施。將解纖維素枝頂孢的基因組DNA用SalI消化過夜，使用Mighty Mix (TaKaRa Bio公司制造)制作了環狀DNA。以本環狀DNA作為模板，通過ACC3基因片段中所含的下述的序列實施PCR，取得了 ACC3基因的5’上游區域以及3’下游區域。
ACC3-inv-F ACTTCCAGACTTTCTGGTCC(SEQ ID NO 21)
ACC3-inv-R AGGCCGAGAGTAAGTATCTC(SEQ ID NO 22)
對于上述5’上游區域以及3’下游區域，采用實施例1-2所述的方法進行解析，確定了 ACC3基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC3基因。
pACC3-F GAAGGATGGTAGATTGTCCG(SEQ ID NO 23)
pACC3-R ACCGAGAAGGATTTCTCGCA (SEQ ID NO 24)
將擴增得到的DNA使用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC3。通過用所得質粒pACC3轉化大腸桿菌 (Escherichia coli)T0P10 株(Invitrogen 公司制造),得到了大腸桿菌 T0P10 株 /pACC3。19
(1-4) cDNA的制作以及ACC3基因的內含子解析
將解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株用纖維素酶誘導培養基32°C培養2天，通過離心分離回收了菌體。將所得菌體用液體氮冷凍后，用研缽和研磨棒將其磨碎。從該磨碎的菌體使用ISOGEN(Nippongene公司)按照附帶的規程，分離總RNA。再從總RNA使用mRNA Purifiation Kit (Pharmacia公司)按照附帶的規程，純化mRNA。
從這樣所得的mRNA 使用 TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia 公司)按照附帶的規程，合成了 cDNA。從ACC3基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC3cDNA基因。
ACC3-N ATGAAGACCAGCATCATTTCTATC(SEQ ID NO 25)
ACC3-C TCATGGGAAATAACTCTCCAGAAT(SEQ ID NO 26)
對于上述ACC3cDNA基因采用實施例1_2所述的方法進行解析，通過與pACC3基因進行比較，確定了內含子的位置。
(1-5) ACC3的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離得到的內切葡聚糖酶ACC3基因由SEQ ID NO I所述的喊基序列的136 1437位所不的1302bp的喊基組成。此外，本ACC3基因顯不包含SEQ ID NO :1所述的堿基序列的233 291位、351 425位、579 631位、697 754位、以及 853 907位所示的5個內含子。從開放閱讀框(ORF)預測的ACC3的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP 3. O推定本ACC3的-27 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例2ACC5基因的克隆》
(2-1)基因組DNA以及mRNA的分離與cDNA的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 此外，按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。
(2_2)ACC5基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族7的已知的內切葡聚糖酶的N末端氨基酸序列以及多聚 A堿基序列為基礎，制作了以下的引物。
ACC5-F CAGCAGGCCCCCACCCCNGAYAAYYTNGC(SEQ ID NO 27)
ACC5-R AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA(SEQ ID NO 28)
使用么054以及405-1 作為引物，以00嫩作為模板，進行了？0 。？0 使用1^ taq 聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30秒、72°C I 分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63 °C分階段降低至53 °C，其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的I. 5kbp的DNA片段用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen 公司制造)按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒T0P0-pACC5-partial。
對克隆至質粒T0P0-pACC5_partial中的插入DNA片段的堿基序列進行解析,將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與煙曲霉 (AsperRillus fumiRatus)來源的內切葡聚糖酶(Q4WCM9)顯示60%的同一'丨生，因而判斷本 DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族7)基因的一部分。
(2-3)利用反向PCR法取得ACC5基因全長
按照實施例1-3所述的方法，以用HindIII消化的環狀DNA作為模板，通過ACC5基因片段中所含的下述序列實施PCR，取得了 ACC5基因的5’上游區域以及3’下游區域。
ACC5-inv-F ATCTCACCTGCAACCTACGA(SEQ ID NO 29)
ACC5-inv-R CCTCTTCCGTTCCACATAAA(SEQ ID NO 30)
對上述5’上游區域以及3’下游區域的堿基序列進行解析，確定了 ACC5基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC5基因。
pACC5-F ATTGCTCCGCATAGGTTCAA(SEQ ID NO 31)
pACC5-R TTCAGAGTTAGTGCCTCCAG(SEQ ID NO 32)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC5。通過用所得質粒pACC5轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) T0P10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 TOPlO 株 /pACC5。
(2_4)ACC5基因的內含子解析
由ACC5基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC5cDNA基因。
ACC5-N ATGGCGACTAGACCATTGGCTTTTG(SEQ ID NO 33)
ACC5-C CTAAAGGCACTGTGAATAGTACGGA(SEQ ID NO 34)
對上述ACC5cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACC5基因進行比較，確定了內含子的位置。
(2-5) ACC5的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACC5基因由SEQ ID NO 3 所述的堿基序列的128 1615位所示的1488bp的堿基組成。由開放閱讀框(ORF)預測的 ACC5的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP 3. O推定本ACC5的-20 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例3ACC6基因的克隆》
(3-1)基因組DNA的分離與基因組文庫的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 將分離的基因組DNA用—3AI進行部分消化。使用連接試劑盒Ver. 2 (寶酒造公司制造) 將其連接于噬菌體載體dMBL3克隆試劑盒(Stratagene公司制造)的MmHI臂。將其用乙醇沉淀后，溶解于TE緩沖液。將連接混合物使用Max PlaxXpackerging kit (Epicenter Technologies公司制造)形成曬菌體粒子,感染大腸桿菌XLl_blue MRA (P2)株。通過該方法得到了由I. IXlO4個噬菌體組成的基因組DNA文庫。
(3_2)ACC6基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族5中的已知的內切葡聚糖酶的序列為基礎，制作了以下的引物。
ACC6-F GTGAACATCGCCGGCTTYGAYTTYGG(SEQ ID NO 35)
ACC6-R CCGTTCCACCGGGCRTARTTRTG(SEQ ID NO 36)
使用ACC6-F以及ACC6-R作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的300bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 T0P0-pACC6-partial。
對質粒T0P0-pACC6_partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與綠色木霉 (Trichoderma viride)來源的內切葡聚糖酶EG3 (Q7Z7X2)顯示61%的同一'丨生，因而判斷本DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族5)基因的一部分。將本DNA片段以質粒 T0P0-pACC6-partial作為模板，按照與上述相同的方法用于PCR擴增，對于所得PCR產物， 使用 ECL DIRECT SYSTEM(Amersham Pharmacia Biotech 公司制造)進行標記，作為探針。
(3-3)利用菌落雜交進行篩選
將實施例3-1中制作的卩遼菌體菌落轉印于Hybond-N+尼龍轉印膜(Amersham公司制造)，堿變性后，用5倍濃度SSC (SSC 15mmol/L檸檬酸三鈉、150mmol/L氯化鈉)洗滌并干燥，固定DNA。雜交如下進行1小時的預雜交(42°C )后，添加HRP標記探針，進行4小時(42 °C )雜交。探針的洗滌如下進行用6M尿素、添加O. 4%SDS的O. 5倍濃度SSC進行2 次，2倍濃度SSC進行2次。
將進行過探針的洗滌的尼龍膜浸泡于檢測溶液I分鐘后，用同公司制造HYPER FILM ECL感光，得到了 I個陽性克隆。來自陽性克隆的DNA制備按照Maniatis等的方法 (J. Sambrook,E.F. Fritsch and Τ· Maniatls,"Molecular Cloning〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)，使用LE392作為宿主大腸桿菌進行。首先，將LE392用LB-MM培養基(1%蛋白胨、O. 5%酵母提取物、O. 5%氯化鈉、10mmol/L硫酸鎂、O. 2%麥芽糖)培養過夜。使其感染單菌落來源的噬菌體溶液，用LB-MM培養基培養過夜。在其中加入氯化鈉使其為1M，并加入氯仿使其為O. 8%，促進大腸桿菌的溶菌。通過離心分離除去菌體殘渣，從 10%PEG6000的沉淀回收噬菌體粒子。將噬菌體粒子在SDS存在下用蛋白酶K進行消化，將其用苯酚處理、并乙醇沉淀，回收了噬菌體DNA。
對于如上制備的DNA，使用ECL DIRECT SYSTEM，進行了 Southern印跡解析。以實施例3-2的PCR擴增片段作為探針進行雜交的結果是，2. 9kbp的！MI片段顯示出與染色體 DNA共通的雜交模式。將該片段克隆化至PUC118中，得到了質粒pUC_ACC6，然后解析了質粒的喊基序列。
(3_4)ACC6基因全長的取得
以從PUC-ACC6得到的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC6基因。
pACC6-F CTCTGCATTGAATCCCGAGA(SEQ ID NO 37)
pACC6-R GCAACGCTAAAGTGCTCATC(SEQ ID NO 38)
將擴增得到的DNA用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC6。通過用所得質粒pACC6轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) T0P10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 T0P10 株 /pACC6。
(3-5) cDNA的制作以及ACC6基因的內含子解析
按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。由ACC6基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，# 增了 ACC6cDNA 基因。
ACC6-N ATGACAATCATCTCAAAATTCGGT (SEQ ID NO 39)
ACC6-C TCAGGATTTCCACTTTGGAACGAA(SEQ ID NO 40)
對上述ACC6cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACC6基因進行比較，確定了內含子的位置。
(3-6) ACC6的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACC6基因由SEQ ID NO 5 所述的堿基序列的169 1598位所示的1430bp的堿基組成。此外，本ACC6基因顯示包含 SEQ ID NO 5所述的堿基序列的254 309位、406 461位、以及1372 1450位所示的3個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的ACC6的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP 3. O推定本ACC6的-21 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例4ACC7基因的克隆》
(4-1)基因組DNA的分離與基因組文庫的制作
按照實施例3-1所述的方法，制備了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA文庫。
(4_2)ACC7基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族5中的已知的內切葡聚糖酶的序列為基礎，制作了以下的引物。
ACC7-F CACGCCATGATCGACCCNCAYAAYTAYG(SEQ ID NO 41)
ACC7-R ACCAGGGGCCGGCNGYCCACCA (SEQ ID NO 42)
使用ACC7-F以及ACC7-R作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30 秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53 °C。將擴增得到的670bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 T0P0-pACC7-partial。
對質粒T0P0-pACC7-partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與煙曲霉 (AsperRillus fumiRatus)來源的內切葡聚糖酶(Q4WM09)顯示63%的同一性，因而判斷本DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族5)基因的一部分。將本DNA片段以質粒 T0P0-pACC7-partial作為模板，按照與上述相同的方法用于PCR擴增，將所得PCR產物使用 ECL DIRECT SYSTEM (Amersham Pharmacia Biotech 公司制造)進行標記，作為探針。
(4-3)利用菌落雜交進行篩選
按照實施例3-3記載的方法進行了基因組DNA文庫的篩選，結果得到了 I個陽性克隆。對于所得陽性克隆進行了 Southern印跡解析，結果是，3. 7kbp的片段顯示與染色體DNA共通的雜交模式。將該片段克隆化于PUC118，得到了質粒pUC-ACC7，然后解析了質粒的喊基序列。
(4_4)ACC7基因全長的取得
以從PUC-ACC7得到的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC7基因。
pACC7-F CAGTCAGTTGTGTAGACACG(SEQ ID NO 43)
pACC7-R ACTCAGCTGGGTCTTCATAG(SEQ ID NO 44)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC7。通過用所得質粒pACC7轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) T0P10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 TOPlO 株 /pACC7。
(4-5) cDNA的制作以及ACC7基因的內含子解析
按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。由ACC7 基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，# 增了 ACC7cDNA 基因。
ACC7-N ATGAGGTCTACATCAACATTTGTA(SEQ ID NO 45)
ACC7-C CTAAGGGGTGTAGGCCTGCAGGAT(SEQ ID NO 46)
對上述ACC7cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACC7基因進行比較，確定了內含子的位置。
(4-6) ACC7的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACC7基因由SEQ ID NO 7 所述的堿基序列的7(Γ1376位所示的1307bp的堿基組成。此外，本ACC7基因顯示包含SEQ ID NO 7所述的堿基序列的451 500位、以及765 830位所示的2個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的ACC7的氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。而且，利用信號序列預測軟件 SignalP 3. O推定本ACC7的-20 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例5ACC8基因的克隆》
(5-1)基因組DNA的分離與基因組文庫的制作
按照實施例3-1所述的方法，制備了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA文庫。
(5_2)ACC8基因片段的取得
基于對應于撫孢青霉菌(Penicillium verruculosum)來源的內切葡聚糖酶III 的N末端、C末端的氨基酸序列的DNA序列，制作了以下的引物。
MSff-N CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT(SEQ ID NO 47)
MSff-C CTAATTGACAGCTGCAGACCAA (SEQ ID NO 48)
使用MSW-N以及MSW-C作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用 LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30 秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的800bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 T0P0-pACC8-partial。
對質粒T0P0-pACC8-partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與綠色木霉 (Trichoderma viride)來源的內切葡聚糖酶Cell2A(Q8NJY4)顯示60%的同一性，因而判斷本DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族12)基因的一部分。將本DNA片段以質粒 T0P0-pACC8-partial作為模板，按照與上述相同的方法用于PCR擴增，將所得PCR產物使用 ECL DIRECT SYSTEM (Amersham Pharmacia Biotech 公司制造)進行標記，作為探針。
(5-3)利用菌落雜交進行篩選
按照實施例3-3記載的方法進行了基因組DNA文庫的篩選，結果得到了 I個陽性克隆。對于所得陽性克隆，進行了 Southern印跡解析，結果是，約5kbp的包II片段顯示與染色體DNA共通的雜交模式。將該運II片段克隆化于PUC118，得到了質粒pUC-ACC8，然后解析了質粒的喊基序列。
(5_4)ACC8基因全長的取得
以由pUC-ACCS得到的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC8基因。
pACC8-F AAAGACCGCGTGTTAGGATC (SEQ ID NO 49)
pACC8-R CGCGTAGGAAATAAGACACC(SEQ ID NO 50)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC8。通過用所得質粒pACC8轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) TOP 10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 T0P10 株/pACC8。
(5-5) cDNA的制作以及ACC8基因的內含子解析
按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。由ACC8 基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，# 增了 ACC8cDNA 基因。
ACC8-N ATGAAGCTAACTTTTCTCCTGAAC(SEQ ID NO 51)
ACC8-C CTAATTGACAGATGCAGACCAATG(SEQ ID NO 52)
對上述ACC8cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACC8基因進行比較，確定了內含子的位置。
(5-6) ACC8的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACC8基因由SEQ ID NO 9 所述的堿基序列的141、74位所示的834bp的堿基組成。此外,本ACC8基因顯示包含SEQ ID NO 9所述的堿基序列的551 609位、以及831 894位所示的2個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的ACC8的氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。而且，利用信號序列預測軟件 SignalP 3. O推定本ACC8的-15 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例6ACC9基因的克隆》
(6-1)基因組DNA以及mRNA的分離與cDNA的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 此外，按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。
(6_2)ACC9基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族45中的已知的內切葡聚糖酶的序列為基礎，制作了以下的引物。
ACC9-F CCGGCTGCGGCAARTGYTAYMA(SEQ ID NO 53)
ACC9-R AGTACCACTGGTTCTGCACCTTRCANGTNSC (SEQ ID NO 54)25
使用ACC9-F以及ACC9-R作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30 秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的800bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒 T0P0-pACC9-partial。
對質粒T0P0-pACC9_partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與綠色木霉 (Trichoderma viride)來源的內切葡聚糖酶EGV(Q7Z7X0)顯示79%的同一'丨生，因而判斷本 DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族45)基因的一部分。
(6-3)利用反向PCR法取得ACC9基因全長
按照實施例1-3所述的方法，以用運II或消化的環狀DNA作為模板，通過 ACC9基因片段所含的下述序列實施PCR，取得了 ACC9基因的5’上游區域以及3’下游區域。
ACC9-inv-F CGAAGTGTTTGGTGACAACG(SEQ ID NO 55)
ACC9-inv-R GTGGTAGCTGTATCCGTAGT(SEQ ID NO 56)
對上述5’上游區域以及3’下游區域的堿基序列進行解析，確定了 ACC9基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC9基因。
pACC9-F TACATTCCGAAGGCACAGTT(SEQ ID NO 57)
pACC9-R CTGAGCTGATTATCCTGACC(SEQ ID NO 58)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACC9。通過用所得質粒pACC9轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) TOPlO 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 TOPlO 株 /pACC9。
(6_4)ACC9基因的內含子解析
由ACC9基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC9cDNA基因。
ACC9-N ATGAAGGCTTTCTATCTTTCTCTC(SEQ ID NO 59)
ACC9-C TTAGGACGAGCTGACGCACTGGTA(SEQ ID NO 60)
對上述ACC9cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACC9基因進行比較，確定了內含子的位置。
(6-5) ACC9的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACC9基因由SEQ ID NO 11 所述的堿基序列的114^1230位所示的1117bp的堿基組成。此外，本ACC9基因顯示包含 SEQ ID NO=Il所述的堿基序列的183 232位、以及299 357位所示的2個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的ACC9的氨基酸序列如SEQ ID N0:12所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP3. O推定本ACC9的-16 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例7=ACClO基因的克隆》
(7-1)基因組DNA以及mRNA的分離與cDNA的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 此外，按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。
(7-2) ACClO基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族61中的已知的內切葡聚糖酶的序列以及多聚A堿基序列為基礎，制作了以下的引物。
ACClO-F GGTGTACGTGGGCACCAAYGGNMGNGG (SEQ ID NO 61)
ACClO-R AATTCGCGGCCGCTAAAAAAAAA(SEQ ID NO 62)
使用ACClO-F以及ACClO-R作為引物，以cDNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用 LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30 秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的300bp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 TOPO-pACClO-partial。
對質粒TOPO-pACClO-partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與土曲霉 (Aspergillus terreus)來源的內切葡聚糖酶EGIV(Q0D0T6)顯示65%的同一'丨生，因而判斷本DNA片段為內切葡聚糖酶(糖苷水解酶家族61)基因的一部分。
(7-3)利用反向PCR法取得ACC10基因全長
按照實施例1-3所述的方法，以用HindIII消化的環狀DNA作為模板，通過ACC10 基因片段所含的下述序列實施PCR，取得了 ACC5基因的5’上游區域以及3’下游區域。
ACC10-inv-F TTCTGCTACTGCGGTTGCTA(SEQ ID NO 63)
ACC10-inv-R GAATAACGTAGGTCGACAAG(SEQ ID NO 64)
對上述5’上游區域以及3’下游區域的堿基序列進行解析，確定了 ACC10基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 ACC10基因。
pACClO-F CGTTGACCGAAAGCCACTT(SEQ ID NO 65)
pACC10-R TGGCCTAAAGCTAAATGATG(SEQ ID NO 66)
將擴增得到的DNA用Τ0Ρ0 TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pACCIO。通過用所得質粒pACCIO轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) T0P10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 T0P10 株 /pACCIO。
(7-4) ACC10基因的內含子解析
由ACC10基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 ACClOcDNA基因。
ACC10-N ATGCCTTCTACTAAAGTCGCTGCCC(SEQ ID NO 67)
ACC10-C TTAAAGGACAGTAGTGGTGATGACG(SEQ ID NO 68)
對上述ACClOcDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pACCIO基因進行比較，確定了內含子的位置。
(7-5) ACC10的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的內切葡聚糖酶ACClO基因由SEQ ID NO: 13所述的堿基序列的124 1143位所示的1020bp的堿基組成。此外,本ACClO基因顯示包含SEQ ID NO :13所述的堿基序列的225 275位所示的I個內含子。由開放閱讀框(ORF) 預測的ACClO的氨基酸序列如SEQ ID N0:14所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP3.O推定本ACClO的-21 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例8=BGLC基因的克隆》
(8-1)基因組DNA以及cDNA的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 此外，按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。
(8-2) BGLC基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族I中的已知的葡糖苷酶的序列為基礎，制作了以下的引物。
BGLC-F CCTGGGTGACCCTGTACCAYTGGGAYYT (SEQ ID NO 69)
BGLC-R=TGGGCAGGAGCAGCCRffffYTCNGT(SEQ ID NO 70)
使用BGLC-F以及BGLC-R作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30 秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至53°C， 其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的I. 2kbp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造),按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體,得到了質粒 TOPO-pBGLC-partial。
對質粒TOPO-pBGLC-partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與煙曲霉 (AsperRillus fumiRatus)來源的β -葡糖苷酶I (Q4WRG4)顯示69%的同一'丨生，因而判斷本 DNA片段為β-葡糖苷酶(糖苷水解酶家族I)基因的一部分。
(8-3)利用反向PCR法取得BGLC基因全長
按照實施例1-3所述的方法，以用20坦1消化的環狀DNA作為模板，通過BGLC基因片段所含的下述序列實施PCR，取得了 BGLC基因的5’上游區域以及3’下游區域。
BGLC-inv-F GGAGTTCTTCTACATTTCCC(SEQ ID NO 71)
BGLC-inv-R AACAAGGACGGCGTGTCAGT(SEQ ID NO 72)
對上述5’上游區域以及3’下游區域的堿基序列進行解析，確定了 BGLC基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，以基因組DNA作為模板實施PCR，擴增了 BGLC基因。
pBGLC-F CTCCGTCAAGTGCGAAGTAT(SEQ ID NO 73)
pBGLC-R GGCTCGCTAATACTAACTGC(SEQ ID NO 74)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pBGLC。通過用所得質粒pBGLC轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) T0P10 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 T0P10 株 /pBGLC。
(8-4) BGLC基因的內含子解析
由BGLC基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 BGLC cDNA基因。
BGLC-N ATGGGCTCTACATCTCCTGCCCAA(SEQ ID NO 75)
BGLC-C CTAGTTCCTCGGCTCTATGTATTT(SEQ ID NO 76)
對上述BGLC cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pBGLC基因進行比較，確定了內含子的位置。
(8-5) BGLC的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的β -葡糖苷酶BGLC基因由SEQ ID NO 15 所述的喊基序列的238 1887位所不的1650bp的喊基組成。此外，本BGLC基因顯不包含 SEQ ID NO 15所述的堿基序列的784 850位、1138 1205位、以及1703 1756位所示的3個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的BGLC的氨基酸序列如SEQ ID N0:16所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP 3. O推定本BGLC的-28 -I氨基酸殘基為信號序列。
《實施例9=BGLD基因的克隆》
(9-1)基因組DNA以及cDNA的制作
按照實施例1-1所述的方法，分離了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的基因組DNA。 此外，按照實施例1-4所述的方法，制作了解纖維素枝頂孢ACCP-5-1株的cDNA。
(9-2) BGLD基因片段的取得
以分類在糖苷水解酶家族I中的已知的葡糖苷酶的序列為基礎，制作了以下的引物。
BGLD-F CACCGCCGCCTACCARRTNGARGG (SEQ ID NO 77)
BGLD-R =TGGCGGTGTAGTGGTTCATGSCRffARffARTC(SEQ ID NO 78)
使用BGLD-F以及BGLD-R作為引物，以基因組DNA作為模板，進行了 PCR。PCR 使用LA taq聚合酶(TaKaRa Bio公司制造)實施。PCR按如下程序實施94°C 30秒、退火30秒、72°C I分鐘，40個循環；但退火溫度在最初的20個循環中從63°C分階段降低至 53°C，其后的20個循環中固定在53°C。將擴增得到的Ikbp的DNA片段使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)，按照附帶的規程插入pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒 TOPO-pBGLD-partial。
對質粒TOPO-pBGLD-partial中克隆的插入DNA片段的堿基序列進行解析，將所得堿基序列翻譯成氨基酸序列，并對該氨基酸序列進行了同源性檢索，結果與埃默森籃狀菌 (Talaromyces emersonii)來源的β -葡糖苷酶I (Q8X214)顯示76%的同一性，因而判斷本 DNA片段為β-葡糖苷酶(糖苷水解酶家族I)基因的一部分。
(9-3)利用反向PCR法取得BGLD基因全長
按照實施例1-3所述的方法，以用XimI消化的環狀DNA作為模板，通過BGLD基因片段所含的下述序列實施PCR，取得了 BGLD基因的5’上游區域以及3’下游區域。
BGLD-inv-F CGGTTTCAATATCGGTAAGC(SEQ ID NO 79)
BGLD-inv-R GTGTCCAAAGCTCTGGAATG(SEQ ID NO 80)
對上述5’上游區域以及3’下游區域的堿基序列進行解析，確定了 BGLD基因的全長堿基序列。
以通過反向PCR法所得的堿基序列為基礎，制作了以下的引物，擴增了以基因組DNA作為模板實施PCR，BGLD基因。
pBGLD-F TTCTCTCACTTTCCCTTTCC(SEQ ID NO 81)
pBGLD-R AATTGATGCTCCTGATGCGG (SEQ ID NO 82)
將擴增得到的DNA用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pBGLD。通過用所得質粒pBGLD轉化大腸桿菌 (Escherichia coli) TOPlO 株(Invitrogen 公司制造)，得到了大腸桿菌 TOPlO 株 /pBGLD。
(9-4) BGLD基因的內含子解析
由BGLD基因序列制作包含起始密碼子以及終止密碼子的下述引物，以cDNA作為模板實施PCR，擴增了 BGLD cDNA基因。
BGLD-N ATGGGTAGCGTAACTAGTACCAAC(SEQ ID NO 83)
BGLD-C CTACTCTTTCGAGATGTATTTGTT (SEQ ID NO 84)
對上述BGLD cDNA基因的堿基序列進行解析，通過與pBGLD基因進行比較，確定了內含子的位置。
(9-5) BGLD的氨基酸序列的推定
采用上述方法從解纖維素枝頂孢分離的β -葡糖苷酶BGLD基因由SEQ ID NO 17 所述的堿基序列的66 1765位所示的1700bp的堿基組成。此外，本BGLD基因顯示包含SEQ ID NO 17所述的堿基序列的149 211位、404 460位、934 988位、以及1575 1626位所示的4個內含子。由開放閱讀框(ORF)預測的BGLD的氨基酸序列如SEQ ID N0:18所示。而且，利用信號序列預測軟件SignalP 3. O推定本BGLD的-33 -I氨基酸殘基為信號序列。
工業實用性
本發明的蛋白質能夠作為纖維素酶制備物使用，可以適用于纖維素系底物分解的用途。
以上通過特定方面說明了本發明，對本領域技術人員而言顯而易見的變形、改良包含在本發明的范圍中。
序列表的SEQ ID NO :19 84的序列所示的各堿基序列為人工合成的引物序列。SEQ ID NO :27(18 位以及 27 位)、SEQ ID NO :41 (18 位)、SEQ ID 勵42(14位)、SEQ ID NO: 54(26 位以及 29 位)、SEQ ID NO :61 (22 位以及 25 位)、SEQ ID NO :70 (22 位)、SEQ ID NO: 77 (19位)中的符號“η”表示任意堿基。
權利要求
1.選自以下的Q)、( )以及Qii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的306位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的I 306位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO. 2所述的氨基酸序列的f306位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
2.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的1 475位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列的f475位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO. 4所述的氨基酸序列的f475位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
3.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO. 6所述的氨基酸序列的f 391位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO. 6所述的氨基酸序列的f 391位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
4.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的376位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO. 8所述的氨基酸序列的f376位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO. 8所述的氨基酸序列的f376位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
5.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的1 221位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO :10所述的氨基酸序列的廣221位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的f 221位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
6.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的1 319位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID N0:12所述的氨基酸序列的廣319位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的f 319位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
7.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的廣301位的序列的蛋白質；( )包含在SEQ ID NO :14所述的氨基酸序列的I 301位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的內切葡聚糖酶；(iii)包含與SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的f 301位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的內切葡聚糖酶。
8.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQID NO 16所述的氨基酸序列的1 458位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQID NO :16所述的氨基酸序列的I 458位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；(iii)包含與SEQID NO 16所述的氨基酸序列的f458位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的葡糖苷酶。
9.選自以下的(i)、(ii)以及(iii)中的蛋白質(i)包含SEQID NO 18所述的氨基酸序列的1 457位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQID NO :18所述的氨基酸序列的I 457位的序列中，缺失、取代、和/或添加I個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；(iii)包含與SEQID NO 18所述的氨基酸序列的f457位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的葡糖苷酶。
10.權利要求I、中任一項所述的蛋白質，其為絲狀真菌來源。
11.權利要求10所述的蛋白質，其中，絲狀真菌是屬于解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)的絲狀真菌。
12.包含編碼權利要求廣9中任一項所述的蛋白質的堿基序列的多核苷酸。
13.包含SEQID NO : I所述的堿基序列或其修飾序列的DNA。
14.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求I所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 1所述的堿基序列的136 1437位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO :1所述的堿基序列的136 1437位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
15.從權利要求14所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
16.權利要求15所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID NO :1所述的堿基序列的233 291位、351 425位、579 631位、697 754位或853 907位的序列中的I個以上的序列的序列。
17.從權利要求13 16中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
18.權利要求17所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO :1所述的堿基序列的136 216位的序列。
19.包含SEQID NO :3所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
20.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求2所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 3所述的堿基序列的128 1615位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 3所述的堿基序列的128 1615位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
21.從權利要求19 20中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
22.權利要求21所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO :3所述的堿基序列的128 187位的序列。
23.包含SEQID NO :5所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
24.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求3所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 5所述的堿基序列的169 1598位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 5所述的堿基序列的169 1598位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
25.從權利要求24所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
26.權利要求25所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID NO :5所述的堿基序列的254 309位、406 461位或1372 1450位的序列中的I個以上的序列的序列。
27.從權利要求23 26中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
28.權利要求27所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO :5所述的堿基序列的169 231位的序列。
29.包含SEQID NO :7所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
30.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求4所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 7所述的堿基序列的70 1376位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO :7所述的堿基序列的70 1376位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
31.從權利要求30所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
32.權利要求31所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID NO :7所述的堿基序列的45廣500位或765 830位的序列中的I個以上的序列的序列。
33.從權利要求29 32中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
34.權利要求33所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO :7所述的堿基序列的7(Γ129位的序列。
35.包含SEQID NO :9所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
36.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求5所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 9所述的喊基序列的141 974位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO :9所述的堿基序列的141 974位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
37.從權利要求36所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
38.權利要求37所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQIDNO :9所述的堿基序列的551飛09位或831 894位的序列中的I個以上的序列的序列。
39.從權利要求35 38中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
40.權利要求39所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO :9所述的堿基序列的14廣185位的序列。
41.包含SEQID NO : 11所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
42.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求6所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO. 11所述的堿基序列的114 1230位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO :11所述的堿基序列的114 1230位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
43.從權利要求42所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
44.權利要求43所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID N0:11所述的堿基序列的183 232位或299 357位的序列中的I個以上的序列的序列。
45.權利要求44中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
46.權利要求45所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO: 11所述的堿基序列的11Γ161位的序列。
47.包含SEQID NO : 13所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
48.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求7所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 13所述的堿基序列的124 1143位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO : 13所述的堿基序列的124 1143位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有內切葡聚糖酶活性的蛋白質的DNA。
49.從權利要求48所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
50.權利要求49所述的DNA，其中，內含子序列是SEQID NO 13所述的堿基序列的 225 275位的序列。
51.從權利要求47飛O中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
52.權利要求51所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID NO 13所述的堿基序列的12Γ186位的序列。
53.包含SEQID NO : 15所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
54.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求8所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 15所述的堿基序列的238 1887位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 15所述的堿基序列的238 1887位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有β_葡糖苷酶活性的蛋白質的DNA。
55.從權利要求54所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
56.權利要求55所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID Ν0:15所述的堿基序列的78Γ850位、1138 1205位或1703 1756位的序列中的I個以上的序列的序列。
57.從權利要求53飛6中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
58.權利要求57所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID N0:15所述的堿基序列的238 321位的序列。
59.包含SEQID NO : 17所述的堿基序列、或其修飾序列的DNA。
60.選自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求9所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 17所述的堿基序列的66 1765位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 17所述的堿基序列的66 1765位的序列組成DNA在嚴格條件下雜交、且編碼具有β_葡糖苷酶活性的蛋白質的DNA。
61.從權利要求60所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
62.權利要求61所述的DNA，其中，內含子序列是包含選自SEQID Ν0:17所述的堿基序列的149 211位、404 460位、934 988位或1575 1626位的序列中的I個以上的序列的序列。
63.從權利要求59飛2中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
64.權利要求63所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID Ν0:17所述的堿基序列的66 227位的序列。
65.包含權利要求12 64中任一項所述的DNA的表達載體。
66.用權利要求65所述的表達載體轉化的宿主細胞。
67.權利要求66所述的宿主細胞，其中，宿主細胞是酵母或絲狀真菌。
68.權利要求67所述的宿主細胞,其中，酵母屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)或畢赤酵母屬(Pichia)。
69.權利要求68所述的宿主細胞，其中，酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
70.權利要求67所述的宿主細胞，其中，絲狀真菌屬于腐質霉屬(Humicola)、 曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、鐮孢菌屬(Fusarium)或枝頂孢霉屬 (Acremonium)。
71.權利要求70所述的宿主細胞,其中，絲狀真菌是解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)、特異腐質霉(Humicola insolens)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)、綠色木霉(Trichoderma viride)、或尖鍵抱菌(Fusarium oxysporum)。
72.通過同源重組缺損了對應于權利要求12飛4中任一項所述的DNA的基因的枝頂孢霉屬(Acremonium)的絲狀真菌。
73.權利要求72所述的絲狀真菌,其中，絲狀真菌是解纖維素枝頂孢(Acremonium cellulolyticus)。
74.權利要求I、中任一項所述的蛋白質的制造方法，其包括下述步驟培養權利要求 66 73中任一項所述的宿主細胞，并從該宿主和/或其培養物收集權利要求I、中任一項所述的蛋白質。
75.采用權利要求74所述的方法生產的蛋白質。
76.纖維素酶制備物，其包含權利要求廣9以及75中任一項所述的蛋白質。
77.—種對生物量進行糖化的處理方法，該方法包括下述步驟使含有纖維素的生物量與權利要求廣9以及75中任一項所述的蛋白質、或權利要求76所述的纖維素酶制備物接觸。
78.一種含有纖維素的纖維的處理方法，該方法包括下述步驟使含有纖維素的纖維與權利要求廣9以及75中任一項所述的蛋白質、或權利要求76所述的纖維素酶制備物接觸。
79.一種廢紙的脫墨方法，其特征在于，在用脫墨劑處理廢紙進行脫墨的步驟中，使用權利要求廣9以及75中任一項所述的蛋白質、或權利要求76所述的纖維素酶制備物。
80.一種改善紙或紙漿的濾水性的方法，該方法包括下述步驟將紙或紙漿用權利要求f 9以及75中任一項所述的蛋白質、或權利要求76所述的纖維素酶制備物進行處理。
81.—種改善動物飼料的消化性的方法，該方法包括將動物飼料用權利要求I、以及 75中任一項所述的蛋白質、或權利要求76所述的纖維素酶制備物進行處理的步驟。
全文摘要
本發明的課題是從解纖維素枝頂孢分離了包含分類于內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的纖維素酶基因的基因組DNA，通過解析其堿基序列，確定了內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶基因。對已知的內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列進行了深入比較，發現了在解纖維素枝頂孢中也能夠保守的氨基酸序列，基于本信息設計了各種引物。使用這樣設計的各種引物，以基因組DNA或cDNA作為模板實施了PCR。其結果，得到了內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因片段，因而以本基因片段為基礎，設計引物，通過繼續進行PCR，擴增出9種內切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，解析了其堿基序列，從而完成了本發明。
文檔編號C12P21/02GK102939376SQ20108006718
公開日2013年2月20日 申請日期2010年3月31日 優先權日2010年3月31日
發明者橫山史和 申請人:明治制果藥業株式會社