專利名稱：一種雌性生殖干細胞的體外分離及培養方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及動物干細胞的體外增殖、分化、分離，特別涉及一種雌性生殖干細胞的體外分離及培養方法。
背景技術：
生殖細胞的發生、增殖、分化的研究是生命科學研究的重要課題之一。在動物繁殖育種中，高產、優質的遺傳資源完全依賴于生殖細胞來完成遺傳；在人類，由于卵子的發生、成熟障礙等引起的不孕癥更是困擾眾多患者的一個現實問題；在基礎研究中，卵子更是發育生物學研究的最重要研究對象之一；因此卵母細胞的發生、分化的研究，在畜牧業生產和生物醫學研究中具有重要的意義。然而高等哺乳動物卵母細胞的發生、轉移、分化完全在體內完成，因此很難動態實時地檢測和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells. StemCells and Development,2008,17 :399-411)。干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。胚胎干細胞 (ES細胞或ESCs)是由早期胚胎內細胞團(ICM)或原始生殖細胞(PGCs)分離而來的多能干細胞。由于胚胎干細胞的獨特生物學特性，使胚胎干細胞在細胞替代治療、組織器官修復與重建、基因治療以及發育生物學模型、新藥開發和毒理實驗等，幾乎所有的生命科學和生物醫藥領域均具有重要的意義。40多年前，科學家就發現雄性哺乳動物生殖器官中有雄性生殖干細胞-精原干細胞的存在，并成功地進行了體外培養。最近人們發現，成年動物睪丸的精原細胞在體外合適的條件下，可能轉化為多能性的雄性生殖干細胞(Matsui等，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell，1992，70 :841-847 ；董武子等，新生牛雄性生殖細胞源類ES的培養及檢測， 畜牧獸醫學報，2007，38 O) :144-148 ;Guan 等，Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature，2006，440 :1199-1203 ；Sesndel 等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+germline progenitors. Nature，2007，449 :346-350 ；Kanatsu-Shinohara 等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008，78 (4) :681-687 ；Kanatsu 等， Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell，2004， 119 :1001-1012 ；Bukovsky 等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature，456，344-349 ；Kanatsu-Shinohara 等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008，78 (4) :681-687)。所以，mGSCs 可做為轉基因動物和克隆動物的理想載體細胞，而且比起正常的ES細胞，mGSCs細胞來源數量多，培養相對容易。但對于生殖細胞的研究來說，更為重要的是mGSCs能夠有效地分化產生出精子(Ko 等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell Stem Cell,2009，5 :87-96)。
但對于雌性哺乳動物，傳統觀點認為所有生殖細胞都在雌性胎兒胚胎發育中進入減數分裂，出生后不再產生新的卵母細胞。因此，在其之后的生命周期中，只有有限的雌性生殖細胞存在于生殖細胞池中，隨著年齡的增長，其數量將不斷減少，而不存在一種干細胞對其進行補充和再生。近年來，有研究者提示出生后雌性小鼠的生殖細胞存在再生的活性。上海交通大學吳際教授首次從成年小鼠卵巢中分離并成功建立了雌性生殖干細胞(rescs)，并證明所得到的rescs具有分化形成卵母細胞，完成世代傳遞的潛力。因此其可望作為轉基因動物生產、異種器官移植、大動物疾病模型研究等提供新的途徑和平臺，也可以作為哺乳動物生殖與發育研究的新途徑，相對于傳統的體細胞克隆和顯微注射法轉基因動物的生產方法，其具有簡單、效率高的優點。在人類，可能開發利用卵巢上的眾多潛在雌性生殖細胞，為生殖醫學研究和臨床開發新的珍貴卵母細胞來源。將有助于研究生殖細胞和卵子發生、凋亡等機理；對動物物種保藏、再生醫學及卵巢功能早衰等不孕癥的治療將產生深遠的影響。雌性生殖干細胞在線蟲、果蠅和小鼠等模式動物上取得了一些進展，如建立了小鼠 FGSCs 的培養體系(Zou 等，Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nat Cell Biol. 2009May ； 11 (5) :631-6.； Zou 等，Improved efficiency of female germline stem cell purification using Fragilis-based magnetic bead sorting. Stem Cells Dev. 201IMay 26. [Epub ahead of print].)。但對家畜如豬、牛、羊等的生殖干細胞，人們了解的仍很不夠，尚未見有雌性生殖干細胞的分離培養方法。
發明內容
本發明解決的問題在于提供一種雌性生殖干細胞的體外分離及培養方法，從雌性哺乳動物的卵巢體外分離克隆雌性生殖干細胞，并對分離到的雌性生殖干細胞體外培養， 為研究雌性生殖細胞發生奠定基礎。本發明是通過以下技術方案來實現一種雌性生殖干細胞的體外分離方法，包括以下步驟1)分離細胞將從無菌采集的卵巢中分離的卵巢生殖上皮剪碎至碎塊，用包含體積分數10% FBS的DMEM/F12培養液重懸2 3次，靜置之后得到下層的組織團；然后用包含質量分數 0. 1 %的Collagenase I、10 μ g/ml DNase和質量分數0. 1 %透明質酸酶的混合液消化處理組織團2 3次，每次20 30min，再用包含體積分數10% FBS的DMEM/F12培養液重懸， 分離得到卵巢源生殖細胞；2)雌性生殖干細胞的原代培養將得到的卵巢源生殖細胞以2X IO5個/mL的密度接種在經質量分數0. 2%的明膠 37°C包被30min的塑料培養皿，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；所述雌性生殖干細胞分離培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分體積分數20%的胎牛血清與血清替代品(KSR)當中的一種、2mmol/L L-谷氨酰胺、 lmmol/L丙酮酸鈉、0. lmmol/Lβ -巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、5 10ng/mL的堿性成纖維生長因子、2. 5ymol/L BIO(6-bromoindirubin-30-oxime), 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL鏈霉素；培養Ia1后將未貼壁的細胞轉到經Matrigel基質膜4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁的細胞第一次轉移培養1 后，將轉移培養后再次未貼壁的細胞轉移培養到經Matrigel基質膜4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁細胞第二次轉移培養后，2d更換1次培養液；細胞生長3 7天后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落；3)雌性生殖干細胞的傳代培養待致密胚胎干細胞樣集落生長至周邊開始出現分化細胞時，將致密胚胎干細胞樣集落吸出，在PBS中洗滌2次；再移到TrypLE細胞消化液或質量分數0. 05%的胰蛋白酶中消化2 3min，并吹吸5 20次；將離散開的單細胞或小細胞團轉移到經Matrigel基質膜4°C包被1 池的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；37°C、5% CO2 飽和濕度條件下培養；培養3 7d后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落，即為雌性生殖干細胞。上述雌性生殖干細胞的體外培養方法，包括以下步驟將雌性生殖干細胞接種到MEF飼養層上，培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分體積分數20%的血清替代品或20%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、 0. lmmol/Li3-巰基乙醇、100IU/mL青霉素、lOOmg/mL鏈霉素、質量分數的非必需氨基酸、2. 5μ mol/L BIO、5 10ng/mL堿性成纖維生長因子和質量分數1 %的ITS ;2 3d更換
一次培養液。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明提供的雌性生殖干細胞的體外分離方法，適用于哺乳動物的雌性生殖干細胞的分離培養。所分離克隆的雌性生殖干細胞形成典型的致密胚胎干細胞樣集落，具有胚胎干細胞特性，其堿性磷酸酶(AP)呈陽性或弱陽性，SSEAl、SSEA4、CD49f、0ct4、C-myc、 Sox2、Klf4、Nanog等也呈陽性；分離培養的雌性生殖干細胞較大，細胞透亮、遮光性強、核大，培養后3 7天形成典型的致密細胞克隆，類似ES細胞克隆。2、豬是一種重要的經濟動物，同時豬的大小、解剖和生理結構與人類非常接近，是人們看好的除靈長類動物外最理想的人類疾病模型和器官移植的供體。如何獲得、保持我國優質地方種質遺傳資源，對現有種群進行改良，成為豬養殖和育種的迫切問題，對豬生殖干細胞的研究可望成為解決種質遺傳資源的重要手段之一。具體對于豬雌性生殖干細胞的分離來說，分離克隆的豬雌性生殖干細胞分離克隆的豬雌性生殖干細胞呈Dazl、Vasa陽性，部分細胞也呈Filga、ZP3、Stra8, Scp3等也呈陽性；分離克隆的豬雌性生殖干細胞具有三胚層的分化潛能，能分化形成類胚體、肌肉樣細胞、脂肪樣細胞和三胚層標記陽性細胞，其中包括PDXl、DeSmin、A-ACTIN和NSE陽性細胞神經細胞、心肌細胞和卵母細胞樣細胞；尤其是具有卵母細胞樣細胞的分化潛能對于豬優質種質資源的獲得、保持、改良具有重要的意義。3、本發明提供的雌性生殖干細胞的體外分離方法，為哺乳動物雌性生殖干細胞的體外分離提供了新的方法，方便于后續的使用和研究。
圖1為豬雌性生殖干細胞的生物學特性和染色檢測結果；其中，A為單個豬雌性生殖干細胞聚集形成的致密胚胎干細胞樣克隆，100X ；B為豬雌性生殖干細胞呈堿性磷酸酶染色呈紅色，陽性，200 X。圖2為豬雌性生殖干細胞表面標記的免疫熒光化學檢測結果；其中，A圖當中的中列分別為SSEA1、SSEA4和⑶49F陽性，左列分別為SSEA1、SSEA4和⑶49F染色的核顯色，右列為SSEA1、SSEA4和CD49F染色和其核的Merge ；B圖中的中列分別為0ct4、C_myc、Klf4、 Sox2陽性，左列分別為0ct4、C-myc、Klf4、Sox2染色的核顯色，右列為0ct4、C_myc、Klf4、 Sox2染色和其核的Merge。圖3為豬雌性生殖干細胞的分化潛能檢測；中列分別為Dazl、Vasa, Filga、ZP3、 Stra8和陽性，左列分別為其對應染色的核顯色，右列為Dazl、Vasa、Filga、ZP3、Mra8 和染色和其核的Merge。Bar = 200 μ m。圖4為豬雌性生殖干細胞的分化潛能檢測；懸浮培養3d形成的類胚體(EB)，A， bar = 40 μ m ；B, bar = IOOym ；C, bar = 200 μ m ；D, bar = 400 μ m ；Ε,類胚體貝占壁分化形成類似長梭形的肌肉細胞(中胚層)，bar = 200 μ m;F，類胚體貼壁分化形成脂肪樣細胞 (中胚層)，呈油紅0染色陽性，bar = 200 μ m ；類胚體貼壁IOd分化形成PDXl (內胚層)、 Desmin (中胚層)、A-ACTIN (中胚層)和NSE陽性細胞(外胚層)。圖5為小鼠雌性生殖干細胞的生物學特性和染色檢測結果；其中，A、B為單個豬雌性生殖干細胞聚集形成的致密胚胎干細胞樣克隆，100X ；C為豬雌性生殖干細胞呈堿性磷酸酶染色呈紅色，陽性，200 X。
具體實施例方式本發明提供一種高效分離克隆哺乳動物雌性生殖干細胞的培養體系，包括雌性生殖干細胞的分離、雌性生殖干細胞的檢測和體外培養。以成年哺乳動物卵巢作為原始材料來源；雌性生殖干細胞的分離純化方法采用 0. 2%明膠和Matrigel差速貼壁結合克隆法，將未貼壁的雌性生殖干細胞與貼壁培養的其他細胞區分、分離。以下具體以豬雌性生殖干細胞的體外分離來進行說明a、豬雌性生殖干細胞的體外分離方法，具體包括以下步驟1)分離豬卵巢細胞用無菌含雙抗(500IU/mL青霉素、500mg/mL鏈霉素)的生理鹽水將無菌采集的豬卵巢洗滌3遍，再用含雙抗的PBS (磷酸鹽緩沖液)洗滌3遍，在無菌培養皿內剝去豬卵巢外膜，分離生殖上皮；將生殖上皮剪碎至Imm3的小碎塊，用DMEM/F12+體積分數10 %的FBS培養液重懸 (500轉以下離心)生殖上皮碎塊，重復2 3次，靜置2 5分鐘之后，得到下層生殖上皮細胞團；然后用質量分數為0. 的 Collagenase I (膠原酶 I，hvitrogen)+10 μ g/mLDNase (DNA酶)+質量分數0. 1 %的透明質酸酶的混合液消化處理2 3次，每次20 30min，再用DMEM/F12+10% FBS重懸培養液(500轉以下離心)，分離得到生殖上皮細胞；如果細胞團仍較大，則用質量分數為0. 25%的胰蛋白酶處理3 5min，用DMEM/ F12+10% (體積分數)FBS重懸，細胞計數；2)雌性生殖干細胞的原代培養將得到的生殖上皮細胞以5X IO5個/mL的密度接種在經質量分數為0. 2%的明膠 37°C包被30min的塑料培養皿，添加雌性生殖干細胞分離培養液；所述雌性生殖干細胞分離培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分體積分數20%的胎牛血清(或20%血清替代品，KSR)、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmol/ L丙酮酸鈉、0. lmmol/L3-巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸(NEAA，美國hvitrogen公司產品)、5 10ng/mL的堿性成纖維生長因子(bFGF)、2· 5 μ mol/L BI0U00IU/ml青霉素、 100mg/mL鏈霉素；培養1 后將未貼壁的細胞轉到經Matrigel基質膜(BD公司)4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁的細胞第一次轉移培養1 后，將轉移培養后再次未貼壁的細胞轉移培養到經Matrigel基質膜4°C包被Ih的培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁細胞第二次轉移培養后，2 3d更換1次培養液；細胞生長5 7d后，開始出現較典型的致密胚胎干細胞樣集落；3)雌性生殖干細胞的傳代培養待致密胚胎干細胞樣集落生長至周邊開始出現分化細胞，即周邊細胞變大，界限明顯時，將致密胚胎干細胞樣集落吸出，在100 μ L PBS中洗滌2次；再移到100 μ L TrypLE 細胞消化液(商品化的細胞消化液，^witrogen公司的TrypLE Express)或質量分數 0. 05%的胰蛋白酶中消化2 3min，并用10 μ L移液槍吹吸5 20次離散細胞；將離散開的單細胞或小細胞團移到經Matrigel 4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養；細胞生長3 7d后，開始出現較典型的致密胚胎干細胞樣集落，即為分離得到的豬雌性生殖干細胞。b、分離到的豬雌性生殖干細胞的細胞檢測1)堿性磷酸酶檢測將傳代培養分離到的致密胚胎干細胞樣集落的豬雌性生殖干細胞用4%多聚甲醛固定3 5min后，用無鈣鎂的PBS洗兩遍，用堿性磷酸酶染液Qmg α -萘酚磷酸鹽和IOmg 堅固紅溶于IOmL PH 8. 2 8. 4的Tris-Cl溶液中)染色8min，吸出染色液，PBS洗2次， 照相記錄；分離克隆的豬雌性生殖干細胞具有ES細胞特性和生殖干細胞的生物學特性，形成典型的集落，如圖IA所示；豬雌性生殖干細胞的堿性磷酸酶染色呈紅色，如圖B所示，為堿性磷酸酶(AP)陽性，即具有多能性干細胞的特性。2)免疫組化或免疫熒光檢測將培養的豬雌性生殖干細胞用4%多聚甲醛固定15min，用PBS洗兩遍，3% H2O2室溫孵育10min，PBS洗兩遍，10%胎牛血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min，傾去血清，分別滴加 0ct4(l 500), SSEAKl 200)、SSEA4(1 200) ,Nanog(l 200)、CD49f (1 200)、 DazKl 500)、Vasa(l 1000)、C_myc (1 200)、Sox2(l 200)、Klf4(l 200)、 Filgad 100)、ZP3(1 200)、Stra8(l 500)和 Scp3(l 300) —抗工作液，4°C過夜， PBS洗兩遍，滴加二抗(羊抗兔FITC或羊抗鼠FITC或Cy3，l 500)工作液，室溫孵育lh， PBS洗兩遍，每次5min，熒光顯微鏡下觀察照相記錄結果；上述免疫熒光的一抗標志均為ES細胞和生殖干細胞的標記，檢測結果分別如圖 2、圖 3 所示，其中，SSEAl、SSEA4、CD49F (圖 2A)、0ct4、C_myc、Klf4、Sox2 (圖 2B)，Dazl、 Vasa, Filga、ZP3、Stra8和(圖；3)等生殖細胞、卵母細胞和減數分裂等特異標記均呈陽性。3)細胞體外分化潛能以1000個細胞/25 μ L的小滴懸滴培養制作類胚體，3d后體視顯微鏡下檢查類胚體形成情況，豬雌性生殖干細胞懸浮培養形成的類胚體(ΕΒ)，如圖4Α所示；收集ΕΒ，培養在 0. 明膠貼附的48空培養板上(培養基為去除bFGF和BIO的豬雌性生殖干細胞分離液， 即以DMEM/F12高糖培養基為基礎培養基，添加體積分數20%的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmol/L丙酮酸鈉、0. lmmol/Lβ -巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、100IU/mL青霉素和lOOmg/mL鏈霉素)，1 3周檢查EB脫落出的細胞類型；分離克隆的豬雌性生殖干細胞具有三胚層的分化潛能，能夠分化形成EB (圖4A D所示)、肌肉細胞(圖4E所示)、脂肪細胞(圖4F所示，油紅0陽性)和卵母細胞樣細胞 (圖4E所示)；貼壁IOd EB分化形成PDX1(內胚層)、DeSmin(中胚層)、A-ACTIN(中胚層) 和NSE陽性細胞(外胚層)。按照上述豬雌性生殖干細胞的分離培養方法，以小鼠卵巢的生殖上皮作為來源， 進行雌性生殖干細胞的分離，同樣分離到了致密胚胎干細胞樣集落的小鼠雌性生殖干細胞。圖5為小鼠雌性生殖干細胞的生物學特性和染色檢測結果，其中A、B為單個豬雌性生殖干細胞聚集形成的致密胚胎干細胞樣克隆，100X ；C為豬雌性生殖干細胞呈堿性磷酸酶染色呈紅色，陽性，200 X。C、對于分離得到的雌性生殖干細胞，其體外離體培養方法為將雌性生殖干細胞接種到MEF飼養層上(即小鼠胚胎成纖維細胞飼養層，用懷孕12-16d的昆白小鼠胚胎成纖維細胞經1(^8/1^絲裂霉素處理2-汕，以50000個/cm2 的密度鋪附在經0. 1 %明膠處理的塑料培養板上)，培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分體積分數20%的血清替代品(KSR，InvitrogerOdmmol/L谷氨酰胺、0. lmmol/L β -巰基乙醇、100IU/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素、0. lmmol/L非必需氨基酸 (NEAA)、2. 5ymol/L BI0、5 10ng/mL堿性成纖維生長因子(bFGF), 1 % ITS (胰島素+轉鐵蛋白+亞硒酸鈉，Sigma公司)。
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權利要求
1.一種雌性生殖干細胞的體外分離方法，其特征在于，包括以下步驟1)分離細胞將從無菌采集的卵巢中分離的卵巢生殖上皮剪碎至碎塊，用包含體積分數10% FBS的 DMEM/F12培養液重懸2 3次，靜置之后得到下層的組織團；然后用包含質量分數0. 1% 的Collagenase IUOyg/ml DNase和質量分數0. 1 %透明質酸酶的混合液消化處理組織團 2 3次，每次20 30分鐘，再用包含體積分數10% FBS的DMEM/F12培養液重懸，分離得到卵巢源生殖細胞；2)雌性生殖干細胞的原代培養將得到的卵巢源生殖細胞以2X IO5個/mL的密度接種在經質量分數0.2%的明膠37°C 包被30min的塑料培養皿，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；所述雌性生殖干細胞分離培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分 體積分數20%的胎牛血清與血清替代品(KSR)當中的一種、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmo 1/L 丙酮酸鈉、0. lmmol/Li3 -巰基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、5 lOng/mL的堿性成纖維生長因子、2. 5ymol/L BIO(6-bromoindirubin-30-oxime), 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 鏈霄素；培養1 后將未貼壁的細胞轉到經Matrigel基質膜4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁的細胞第一次轉移培養1 后，將轉移培養后再次未貼壁的細胞轉移培養到經 Matrigel基質膜4°C包被Ih的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；未貼壁細胞第二次轉移培養后，2d更換1次培養液；細胞生長3 7d后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落；3)雌性生殖干細胞的傳代培養待致密胚胎干細胞樣集落生長至周邊開始出現分化細胞時，將致密胚胎干細胞樣集落吸出，在PBS中洗滌2次；再移到TrypLE細胞消化液或質量分數0. 05%的胰蛋白酶中消化 2 3min，并吹吸5 20次；將離散開的單細胞或小細胞團轉移到經Matrigel基質膜4°C 包被1 池的塑料培養皿培養，培養液為雌性生殖干細胞分離培養液；37°C、5% CO2飽和濕度條件下培養；培養3 7d后，開始出現致密胚胎干細胞樣集落，即為雌性生殖干細胞。
2.—種雌性生殖干細胞的體外培養方法，其特征在于，將雌性生殖干細胞接種到MEF 飼養層上，培養液以DMEM/F12培養基為基礎培養基，還包括以下組分體積分數20%的血清替代品、2mmol/L谷氨酰胺、0. lmmol/L β -巰基乙醇、100IU/mL青霉素、100mg/mL鏈霉素、 質量分數的非必需氨基酸、2. 5μπι01/1 ΒΙ0、5 lOng/mL堿性成纖維生長因子和質量分數的ITS ；2 3d更換一次培養液。
全文摘要
本發明公開了一種雌性生殖干細胞的體外分離及培養方法，從雌性哺乳動物的卵巢的生殖上皮得到細胞，雌性生殖干細胞的分離純化方法采用0.2％明膠和Matrigel差速貼壁結合克隆法，將未貼壁的雌性生殖干細胞與貼壁培養的其他細胞區分、分離。分離到的雌性性生殖干細胞培養在MEF飼養層上。分離到的雌性生殖干細胞具有ES細胞特性和向肌肉細胞、脂肪細胞和卵母細胞樣細胞以及三個胚層在內的多種細胞的分化潛能。
文檔編號C12N5/071GK102250830SQ20111018576
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月5日 優先權日2011年7月5日
發明者華進聯, 白耀富, 胡玥 申請人:西北農林科技大學