專利名稱：豬卵丘干細胞的分離方法
豬卵丘干細胞的分離方法本發明涉及動物干細胞的分離方法，尤其涉及一種豬卵丘干細胞的分離方法。 [背景技術]干細胞(Stem Cell)是一種尚未充分分化和成熟的細胞，在誘導環境條件下具有形成各種組織器官組成細胞的潛在功能，被醫學界稱之為“萬能細胞”。干細胞的用途非常廣泛，涉及到醫學的多個領域。干細胞及其衍生組織器官的廣泛臨床應用，將產生一種全新的醫療技術，也就是再造人體正常的甚至年輕的組織器官，從而使人類能夠用上自己的或他人的干細胞或由干細胞所衍生出的新的組織器官，來替換自身病變的或衰老的組織器官。干細胞的研究將為臨床醫學提供更為廣闊的應用前景。隨著基因工程、胚胎工程、細胞工程等各種生物技術的快速發展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養干細胞已成為可能，利用干細胞構建各種細胞、組織、器官作為移植器官的來源，這將成為干細胞應用的主要方向。當前，干細胞和再生醫學的研究已成為生命科學中最為引人注目的領域，其理論的日臻完善和技術的迅猛發展必將在疾病治療和生物醫藥等領域產生劃時代的成果，是對傳統醫療手段和醫療觀念的一場重大革命。干細胞作為起源細胞，具有多向分化潛能和自我復制能力的原始未分化細胞，是形成哺乳類各組織器官的祖宗細胞。干細胞在形態上通常具有共性，呈現出圓形或橢圓形形態，干細胞的體積較小，細胞核相對較高大。干細胞按其來源可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞(Embryonic Stem cell, ES細胞)來自早期受精卵囊胚的內細胞團， ES細胞是一種高度未分化細胞。它具有發育的全能性，能分化形成動物機體組織和器官的所有組成細胞，甚至包括生殖細胞精子和卵子。因此，研究和利用ES細胞是當前生物工程領域的熱點。但是由于ES細胞來源于早期囊胚的內細胞團，當胚胎在子宮內著床后囊胚的內細胞團將發育成為一個生命個體。因此，ES細胞的分離與一個生命個體的誕生存在兩者不可兼得的矛盾。另外，ES細胞誘導分化形成的細胞由于免疫排斥現象不能直接應用到患者體內。成體干細胞作為干細胞家族中的一種細胞類型，來源于動物機體的許多組織或器官。成體干細胞經過誘導分化后形成機體緊缺的細胞、組織或器官用于修復或替換受損的細胞、組織或器官，由于自身成體干細胞同動物機體基因型完全一致，干細胞移植可以有效避免免疫排斥現象。成體干細胞在動物機體的生長發育過程中作為細胞儲備發揮著關鍵的調節作用，維持組織或器官的動態平衡。目前，造血干細胞作為成體干細胞已成功應用于臨床醫學。造血干細胞是體內各種血細胞的唯一種子細胞來源，它主要存在于骨髓、外周血、 臍帶血中。造血干細胞的移植是治療血液系統疾病、先天性遺傳疾病以及多發性和轉移性惡性腫瘤疾病的最有效方法。造血干細胞存在于造血系統，對于白血病患者因造血系統的嚴重疾病，自身的造血干細胞受到破壞，分離培養出來源于其他組織或器官的成體干細胞具有著重要的使用價值和現實意義。目前人們已從皮膚、脂肪、神經、血液等組織中成功地分離出成體干細胞，其中造血干細胞已成功地應用于人類臨床。但是到目前為止還未見從動物機體的卵巢中分離出干細胞的報道。 [發明內容]本發明要解決的技術問題是提供一種豬卵丘干細胞的分離方法。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，一種豬卵丘干細胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟(1)豬卵丘細胞的采集從青年母豬卵巢表面抽取直徑36mm卵泡，挑選卵丘細胞包裹2層以上致密且胞質均勻的卵丘卵母細胞復合物，用TCM-199卵母細胞成熟液洗滌3遍，然后將每70-80個卵丘卵母細胞復合物移入24孔培養板中進行培養，每孔400 μ 1TCM-199卵母細胞成熟液，成熟液上面覆蓋石蠟油，在39°C、5% C02、100%濕度的培養箱中培養42士2h;成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物用lmg/ml透明質酸酶消化脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞，收集卵丘細胞用于豬卵丘干細胞的分離培養；(2)豬卵丘干細胞的分離與培養取采集到的豬卵丘細胞，經PBS液離心洗滌后，添加高糖的DMEM培養液于37°C條件下進行培養，待培養的纖維狀卵丘細胞中間出現圓形細胞形成的細胞集落后，更換為含 4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培養液繼續培養，胰酶消化圓形細胞集落，接種消化的細胞于小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM 培養液繼續培養，細胞每天半量換液，2-3d傳代一次。本發明的有益效果是介紹一種成功分離培養出豬卵丘細胞干細胞的方法，豬由于在個體大小、生理特征、組織器官大小等方面同人體較為相似，常成為用于研究人類疾病治療、組織器官移植的理想動物模型，通過對豬卵丘細胞干細胞分離培養方法的介紹將會為來源于人類自身機體的卵丘細胞干細胞分離培養和應用奠定基礎，同時也會為利用豬卵丘干細胞作為種子細胞進行遺傳操作應用豬的品種培育和改良等工作奠定基礎。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。
圖1是本發明實施例豬卵丘細胞的細胞形態。圖2是本發明實施例分離培養的豬卵丘干細胞的細胞集落形態。1試驗材料與方法1.1試驗材料實驗動物為杜長達三元雜交青年母豬；1.2試驗方法1. 2. 1豬卵丘細胞的分離從青年母豬卵巢表面抽取直徑3_6mm卵泡，挑選卵丘細胞包裹2層以上致密且胞質均勻的卵丘卵母細胞復合物，用TCM-199卵母細胞成熟液洗滌3遍，然后將每70-80個卵丘卵母細胞復合物移入24孔培養板中進行培養，每孔400 μ 1TCM-199卵母細胞成熟液，成熟液上面覆蓋石蠟油，在39°C、5% C02、100%濕度的培養箱中培養42士2h。成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物用lmg/ml透明質酸酶消化脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞，收集卵丘細胞用于豬卵丘干細胞的分離培養。1. 2. 2豬卵丘干細胞的分離與培養取收集到的豬卵丘細胞，經PBS液離心洗滌后，添加高糖的DMEM培養液37°C條件下進行培養，待培養的纖維狀卵丘細胞中間出現圓形細胞形成的細胞集落后，更換為含 4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培養液繼續培養，胰酶消化圓形細胞集落，接種消化的細胞于小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM 培養液繼續培養，細胞每天半量換液，2-3d傳代一次。1. 2. 3豬卵丘干細胞多能性標記的表達檢測豬卵丘干細胞經4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30分鐘，添加一抗為兔抗0ct4、山羊抗Nanog、小鼠抗SSEAl按1 200稀釋后4°C孵育過夜。PBS洗 3次，CY3紅色熒光標記的二抗按1 200稀釋后室溫避光孵育lh，PBS洗3次，用1 μ g/ml 的DAPI進行細胞核染色Imin后熒光鏡下觀察結果。1. 2. 4豬卵丘干細胞體外分化能力的檢測Dispase消化卵丘干細胞，將消化的細胞集落吹打形成較小的細胞集落，高糖的 DMEM培養液離心洗滌后，接種細胞集落于細菌培養皿中添加高糖的DMEM培養液進行懸浮培養，7d懸浮培養后將形成的細胞團塊接種到明膠包被的培養皿中使細胞團塊貼壁生長， 細胞團塊貼壁生長7d后，4%多聚甲醛固定，牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30分鐘，添加一抗為山羊抗神經纖維、山羊抗α-肌動蛋白、山羊抗甲胎蛋白按1 200稀釋后4°C孵育過夜。PBS洗3次，CY3紅色熒光標記的二抗按1 200稀釋后室溫避光孵育lh，PBS洗 3次，用1 μ g/ml的DAPI進行細胞核染色Imin后熒光鏡下觀察結果。2試驗結果2. 1豬卵丘干細胞的集落形態收集從豬卵丘卵母細胞復合物中消化脫落的卵丘細胞，在高糖的DMEM培養液中培養Id后，豬卵丘細胞貼壁生長，絕大部分豬卵丘細胞呈現纖維狀生長形態(圖1)，細胞生長速度緩慢，繼續培養4d后，可見少數細胞呈現圓形細胞形態，分裂增殖的圓形細胞逐漸增多形成細胞集落，細胞集落向上隆起形成鳥巢狀形態，在細胞集落中圓形細胞的細胞核較大，生長較纖維狀卵丘細胞生長速度快。Dispase消化細胞集落后接種到小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，分散的細胞集落在高糖的DMEM培養液中呈現退化現象，細胞不增殖并逐漸退化減少。在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培養液中細胞集落生長迅速，細胞狀態較好，細胞集落突出飼養層表面比較明顯，形成典型的鳥巢狀形態(圖2)，細胞集落每2-3d傳代一次，每次按1 4進行消化傳代，經過多次消化傳代細胞集落仍然表現出穩定的生長性能，一致的細胞集落形態，凍存和復蘇對細胞的生長性能沒有明顯影響。2. 2豬卵丘干細胞的干細胞標記表達分離培養的豬卵丘干細胞集落在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖的DMEM 培養液中生長性能穩定，經過4%多聚甲醛固定及免疫細胞化學染色檢測分析之后顯示，豬卵丘干細胞表達干細胞特異性標記0ct4、Nanog和SSEA1，其中0ct4和Nanog在豬卵丘干細胞中為核表達，檢測結果與干細胞特異性標記和核特異性染料DAPI的結果相一致。SSEAl 表達在豬卵丘干細胞的細胞膜表面，在豬卵丘干細胞集落中呈現細胞差異性表達，即在細胞集落中部分細胞SSEAl膜蛋白表達為強陽性，部分細胞SSEAl膜蛋白表達為弱陽性，這是在目前所報道的干細胞集落中唯一一種性能獨特的干細胞集落，在其它類型的干細胞集落中SSEAl膜蛋白表達呈現均一一致性，結果顯示出豬卵丘干細胞基因表達的獨特性。2. 3豬卵丘干細胞體外三胚層的分化豬卵丘干細胞集落在含4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖的DMEM培養液生長性能穩定，制作的擬胚體經過7d懸浮培養和7d貼壁培養，4%多聚甲醛固定及免疫細胞化學染色檢測分析后顯示，豬卵丘干細胞在體外能夠自發向機體內三個胚層細胞進行分化，在豬卵丘干細胞擬胚體中，部分細胞分化形成外胚層神經細胞，表現為神經細胞特異性抗體神經纖維表達檢測為陽性，部分細胞分化形成中胚層肌肉細胞，表現為肌肉細胞特異性抗體α-肌動蛋白表達檢測為陽性，并且誘導分化誕生的肌肉細胞形成環形的括約肌形態。 在擬胚體中部分細胞則分化表達內胚層肝臟細胞特異性標記甲胎蛋白，分析檢測證實豬卵丘干細胞具有向機體三個胚層分化的能力，呈現出干細胞特有的特征。
權利要求
1. 一種豬卵丘干細胞的分離方法，其特征在于，包括以下步驟(1)豬卵丘細胞的采集從青年母豬卵巢表面抽取直徑3-6mm卵泡，挑選卵丘細胞包裹2層以上致密且胞質均勻的卵丘卵母細胞復合物，用TCM-199卵母細胞成熟液洗滌3遍，然后將每70-80個卵丘卵母細胞復合物移入24孔培養板中進行培養，每孔400 μ 1TCM-199卵母細胞成熟液，成熟液上面覆蓋石蠟油，在39°C、5 % C02、100 %濕度的培養箱中培養42 士 2h ；成熟培養后的卵丘卵母細胞復合物用lmg/ml透明質酸酶消化脫去卵母細胞周圍的卵丘細胞，收集卵丘細胞用于豬卵丘干細胞的分離培養；(2)豬卵丘干細胞的分離與培養取采集到的豬卵丘細胞，經PBS液離心洗滌后，添加高糖的DMEM培養液于37°C條件下進行培養，待培養的纖維狀卵丘細胞中間出現圓形細胞形成的細胞集落后，更換為含4yg/ ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培養液繼續培養，胰酶消化圓形細胞集落，接種消化的細胞于小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上，添加4 μ g/ml bFGF和10U/ml LIF的高糖DMEM培養液繼續培養，細胞每天半量換液，2-3d傳代一次。
全文摘要
本發明公開了一種豬卵丘干細胞的分離方法。其方法是抽取青年母豬卵丘卵母細胞復合物，卵母細胞體外成熟培養后，消化脫離卵丘細胞，收集消化的卵丘細胞進行培養，待有細胞集落出現并形成較大的細胞集落后，消化傳代接種到飼養層上，在含有細胞因子的培養液中進行培養，分離培養的卵丘干細胞具有鳥巢狀細胞生長形態，細胞圓形、核較大，細胞表達干細胞特有的標記Oct4、Nanog、SSEA1，體外分化能夠形成來源于三個胚層的神經細胞、肌肉細胞和肝臟細胞，結果顯示從豬卵丘細胞中分離培養了卵丘干細胞。
文檔編號C12N5/074GK102268404SQ201110204169
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者丁建平, 任春環, 劉亞, 劉洪瑜, 張子軍, 張運海, 方富貴, 曹鴻國, 李運生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請人:安徽農業大學