專利名稱：一種jc病毒的檢測方法、其試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種病毒的檢測方法和試劑盒，具體講，涉及ー種JC病毒的檢測方法及其試劑盒。
背景技術：
JC病毒(JCV)屬人類多瘤病毒，是ー種小雙鏈DNA病毒。JCV由PADGETT于1971年等首先在進行性多灶性腦白質病(Progressive Multifocal Lukoenphalapathy,PML)患者中發現并分離出。該病毒只有ー種血清型，但可分為30多個基因型。JCV是ー種機會感染性病原，正常人群中血清學陽性率高達80%以上。初次感染 一般發生在兒童時期，并且多無癥狀。JCV可通過分娩(胎盤)、哺乳或長期共同生活接觸從母親傳播給子女，也可通過呼吸道、消化道傳播。初次感染后，JCV以潛伏狀態存在于人體組織，但是當宿主免疫力降低時，病毒可以重新激活復制，并且導致宿主病理改變。JCV具有明顯的嗜神經性特點，嚴重免疫抑制患者感染JCV后可引起進行性多灶性腦白質病(PML)。PML主要發生于淋巴網狀內皮細胞惡性腫瘤如慢性淋巴細胞性白血病、淋巴增生障礙(如淋巴瘤)、實質性器官瘤、重度免疫抑制的患者(包括愛滋病、系統性紅斑狼瘡、韋格肉芽腫病、硬皮病、皮肌炎、多發性肌炎及類風濕性關節炎等)和器官移植后藥物治療所致嚴重免疫抑制患者。JCV還能在腎臟組織中復制，并通過尿液排出病毒。器官移植后，免疫抑制劑的使用是誘導多瘤病毒激活復制的重要原因，其中，40%以上的腎移植患者可檢測到JCV的復制。與BK病毒(BKV) —祥，JCV的感染也可致腎移植患者的多瘤病毒相關性腎病(PVAN)。PVAN被認為是影響腎移植手術成功與否最關鍵的因素之一。形態學上，比如Decoy細胞檢測與腎組織活檢均不能區分BKV與JCV感染。JCV具有致瘤性。近年國外研究結果發現，JCV在體外可使人及動物多種組織類型正常細胞發生惡性轉化，在倉鼠及轉基因小鼠體內可誘發多種腫瘤形成，但其致瘤機制尚不清楚。目前沒有針對JCV有效的抗病毒藥物，早期診斷是JCV感染相關疾病防治的最好手段。確認JCV感染的檢測包括檢測血清中特異性VPl抗體；對感染者的尿液、腦脊液、血液及病變組織進行JCV DNA檢測；對活組織進行原位雜交及免疫組化檢測等。由于JCV在人群中感染率很高，抗體檢測并非確證活動性JCV感染的可靠方法。國外研究認為，利用聚合酶鏈式反應(PCR)對尿液、血液或腦脊液特異性地檢測JCV DNA是PVAN或PML早期診斷 及預測的最佳方法。PCR技術檢測方法的靈敏度為75%，特異度則高達96%，同時可以區分BKV與JCV的感染。熒光定量PCR比常規PCR具有更高的靈敏度、特異性，操作更加快速、方便，是用于JCV DNA檢測的理想手段。目前國內對JCV的研究尚屬空白，更沒有成熟的檢測方法或試劑。綜上亟需能夠實現快速、有效且準確檢測JC病毒的產品，以用于JC病毒載量的檢測，JC病毒相關性疾病的預測及治療監測。
發明內容
本發明的首要目的是提供ー種用于檢測JC病毒的方法；本發明的第二發明目的在于提出檢測JC病毒的試劑盒；本發明的第三發明目的在于提出該檢測JC病毒試劑盒的應用。為了完成本發明的目的，采用的技術方案為本發明涉及ー種JC病毒的檢測方法，包括以下步驟(I)針對JC病毒基因組設計特異性引物JCV-F和JCV-R，Taqman熒光探針JCV-P，
Taqman熒光探針JCV-P的5’端標記有熒光基團，在除5’端外的任意ー個位置上標記有淬滅基團，優選為3’端；(2)處理待測樣本，進行PCR反應；(3)通過熒光定量PCR儀檢測反應結果；其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中，SEQID NO 1 的核苷酸序列為 GGTATACACAGCAAAAGAAGCAACA，SEQ ID NO 2 的核苷酸序列為 CAGTGATGATGAAAACACAGGATCC，SEQ ID NO 3 的核苷酸序列為 GCATGCAGATCTACAGGAAAGTCTTTAGGGT。本發明的第一優選技術方案為，所述的Taqman突光探針的突光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー種；所述熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑I、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的至少ー種。本發明的第二優選技術方案為當突光淬滅基團選自4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸時,突光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷、六氯-6-甲基熒光素、花菁3中的至少ー種；當熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明時，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯或六氯-6-甲基熒光素中的至少ー種；當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑I吋，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷、六氯-6-甲基熒光素或花菁3中的至少ー種；當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑2時，熒光報告基團選自6-羧基四甲基羅丹明、花菁3、羧基-X-羅丹明或磺酰羅丹明中的至少ー種；
當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑3時，熒光報告基團選自花菁5或花菁5. 5中的ー種。最優選地，所述熒光報告基團為6-FAM ;所述熒光淬滅基團為BHQl。本發明的第三優選技術方案為，步驟(2)中PCR反應的反應體系包括PCR反應液19.84 1、0嫩聚合酶0.2“1、待檢模板5.(^1 ；其中，PCR反應液的組成為10X反應緩沖液2.5 μ 1，JCV-F(10 μ Μ)O. 6 μ I,JCV-R(IOyM)O. 3 μ I, JCV-P (10 μ Μ) O. 7 μ I, dNTP 3. O μ 1，最后用無菌超純水將反應體系補至 19. 8 μ I。
本發明的第四優選技術方案為步驟⑵中PCR反應的反應條件為92 95°C條件下反應3 5分鐘；然后92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共35 45個循環；優選94°C條件下反應4分鐘；然后94°C，15秒，60°C，35秒，共40個循環。本發明的第五優選技術方案為所述的PCR反應均設置陰性質控組和JC病毒定量標準品I IV組，其中陰性質控組的待測模板為純水，JC病毒定量標準品I-IV的待測模板分別為JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。本發明的第六優選技術方案為JCV定量標準品I IV的構建方法包括以下步驟(I)配制PCR反應體系，加入提純的病毒基因組，進行PCR反應；(2)將擴增產物插入T載體構建重組質粒，經基因測序確認正確后將重組質粒轉化細菌擴增；(3)提純重組質粒后利用紫外分析法測定吸光度，計算質粒濃度，最后將重組質粒稀釋成4個梯度5X IO5 5X 108COpieS/ml，分別作為試劑盒的JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。本發明的第七優選技術方案為所述的待測樣本的處理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化銨法。本發明的第八優選技術方案為熒光定量PCR儀檢測反應結果；如果檢測通道沒有出現S型擴增曲線，判為JC病毒陰性；如果檢測通道出現S型擴增曲線，則判定為陽性，并利用JCV定量標準品檢測所生成的標準曲線計算待測樣本的濃度(copies/ml)。 本發明的第九優選技術方案為熒光定量PCR儀檢測反應結果，采用熒光定量PCR儀，熒光信號收集時設定為FAM熒光素，熒光信號收集設在60°C。本發明還涉及ー種JC病毒的檢測試劑盒，所述的試劑盒包括PCR反應液、耐熱DNA聚合酶、待檢模板、陰性質控組和JC病毒定量標準品I IV組。其中，其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。本發明還涉及所述的JC病毒的檢測試劑盒在檢測和/或診斷JC病毒相關性疾病中的應用。JC病毒的感染與多瘤病毒相關性腎病、骨髄移植患者的出血性膀胱炎、進行性多灶性腦白質病、肺部疾病、腫瘤、自身免疫性疾病等有夫。下面對本發明的技術方案做進ー步的解釋和說明本發明的首要目的是解決目前缺乏JC病毒檢測產品的問題，提供一種檢測JC病毒的方法，使用該方法可以實現對JC病毒的快速、有效且準確的定量或定性檢測，來保證及時的JC病毒載量的檢測，JC病毒相關性疾病的預測及治療監測。本發明涉及ー種用于檢測JC病毒的試劑盒，該試劑盒具有敏感性高、特異性好、反應快速且成本低的優勢，適合于大規模臨床開展；可以實現對JC病毒的快速、有效且準確的定量檢測，因而能保證及時的病例診治及治療效果監測。本發明針對JC病毒基因組設計特異性引物JCV-F和JCV-R，Taqman熒光探針JCV-P7Taqman熒光探針JCV-P的5’端標記有熒光基團，在除5’端外的任意ー個位置上標記有淬滅基團，優選為3’端；本發明在PCR擴增時在加入ー對引物的同時加入一個特異性 的突光探針，該探針為ー寡核苷酸，兩端分別標記一個報告突光基團和ー個淬滅突光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時Taq酶的5’_3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同歩。所述熒光報告基團和所述熒光淬滅基團選自由6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、四氣-6-羧基滅光素(tetrachloro-6-carboxyfIuorescein, TET)、六氣 _6_ 甲基突光素(Hexachloro-6-methylfluorescein, HEX)、6_ 竣基四甲基羅丹明(6-carboxytetramethy lrhodamine, TAMRA)、橫酸羅丹明(Sulforhodamine 101,Texas Red)、羧基-X-羅丹明(Carboxy-x-rhodamine, R0X)、花菁 3(cyanine3, Cy3)、花菁3. 5 (cyanine3. 5, Cy3. 5)、花菁 5 (cyanine5，Cy5)、花菁 5· 5 (cyanine5. 5, Cy5. 5)、生物搜索技術公司(Biosearch Technologies, Inc)的黑洞萍滅劑 I (Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬滅劑 2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞淬滅劑 3 (Black Hole Quencher3，BHQ3)、4_(4_ ニ 甲基氛基苯偶氣基)苯甲酸(4-(4，-dimethy laminopheny Iazo)benzoic acid, DABCYL)、6_羧基_4’，5’ -ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷(6_Carboxy-4’，5’ -dichloro_2’，7’ -dimethoxyf luorescein, JOE)和美國應用生物系統公司的VIC熒光染料所組成的組中。優選地，所述熒光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷、花菁3、花菁5和花菁5. 5所組成的組中；所述熒光淬滅基團選自由6-羧基四甲基羅丹明、4- (4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸DABCYL、BHQ1、BHQ2和BHQ3所組成的組中。更優選地，按照下表I所不來選擇突光報告基團和突光淬滅基團。表I :
熒光淬滅基團熒光報告基團
DABCYL6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3 中的全少ー種
權利要求
1.ー種JC病毒的檢測方法，包括以下步驟 首先針對JC病毒基因組設計特異性引物JCV-F和JCV-R，Taqman熒光探針JCV-P，Taqman熒光探針JCV-P的5’端標記有熒光基團，在除5’端外的任意ー個位置上標記有淬滅基團，優選連接于3’端； 然后，處理待測樣本，加入所述的特異性引物及探針進行PCR反應； 最后通過熒光定量PCR儀檢測，得到反應結果； 其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列經取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述的Taqman熒光探針的熒光報告基團選自由6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，V - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー種； 所述熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑I、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的至少ー種；
3.根據權利要求2所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于， 當突光淬滅基團選自4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸時,突光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、六氯-6-甲基熒光素、花菁3中的至少ー種； 當熒光淬滅基團選自6-羧基四甲基羅丹明時，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯或六氯-6-甲基熒光素中的至少ー種； 當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑I吋，熒光報告基團選自6-羧基熒光素、四氯-6-羧基熒光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酷、六氯-6-甲基熒光素或花菁3中的至少一種； 當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑2時，熒光報告基團選自6-羧基四甲基羅丹明、花菁3、羧基-X-羅丹明或磺酰羅丹明中的至少ー種； 當熒光淬滅基團選自黑洞淬滅劑3吋，熒光報告基團選自花菁5或花菁5. 5中的ー種； 優選的，所述熒光報告基團為6-羧基熒光素；所述熒光淬滅基團為黑洞淬滅劑I。
4.根據權利要求I所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟⑵中PCR反應的反應體系為PCR反應液19. 8 μ 1.DNA聚合酶O. 2 μ I和待檢模板5. O μ I ; 其中，PCR反應液的組成為10Χ反應緩沖液2.5 μ 1，JCV-F(10 μ Μ) O. 60 μ 1，JCV-R(IOyM)O. 30 μ 1，JCV-P(IOyM)O. 70 μ 1，dNTP3. O μ 1，最后用無菌超純水將反應體系補至 19. 8 μ I。
5.根據權利要求I所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟⑵中PCR反應的反應條件為92 95°C保溫3 5分鐘后；92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共35 45個循環；優選為94°C保溫4分鐘后；94°C，15秒，60°C，35秒，共40個循環。
6.根據權利要求I所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中的PCR反應中，還設置陰性質控組和JC病毒定量標準品I IV組；其中，陰性質控組的待測模板為純水，JC病毒定量標準品I IV的待測模板分別為JCV定量標準品I、JCV定量標準品II、JCV定量標準品III、JCV定量標準品IV。
7.根據權利要求6所述的JC病毒的檢測方法，其特征在干，JCV定量標準品I IV的構建方法包括以下步驟 (1)配制PCR反應體系，加入提純的JC病毒基因組，進行PCR反應； (2)將擴增產物插入T載體構建重組質粒，經基因測序確認正確后，將重組質粒轉化細菌擴增； (3)提純重組質粒后利用紫外分析法測定吸光度，計算質粒濃度，最后將重組質粒稀釋成4個梯度5X 105、5X 106、5X 107、5X 108copies/ml，分別作為試劑盒的JCV定量標準品I、II、III、IV。
8.根據權利要求I 7任ー權利要求所述的JC病毒的檢測方法，其特征在于，所述的待測樣本的處理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化銨法，優選煮沸裂解法。
9.根據權利要求I 8任ー權利要求所述的JC病毒的檢測方法,其特征在于,突光定量PCR儀檢測反應結果吋，當檢測通道出現S型擴增曲線，判定為陽性，并利用JCV定量標準品檢測所生成的標準曲線計算待測樣本的濃度；當檢測通道沒有出現S型擴增曲線，判定為JC病毒陰性。
10.ー種JC病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括檢測組、陰性質控組和JC病毒定量標準品I IV組，其中，檢測組包括PCR反應液、耐熱DNA聚合酶、待檢模板，所述的PCR反應液中含有特異性引物JCV-F、特異性引物JCV-R和Taqman熒光探針JCV-P。
11.權利要求10所述的JC病毒的檢測試劑盒在檢測和/或診斷JC病毒相關性疾病中的應用，JC病毒相關性疾病選自多瘤病毒相關性腎病、骨髄移植患者的出血性膀胱炎、進行性多灶性腦白質病、肺部疾病、腫瘤或自身免疫性疾病。
全文摘要
本發明涉及一種病毒的檢測方法和試劑盒，具體講，涉及一種JC病毒的檢測方法及其試劑盒。本發明的檢測方法包括以下步驟首先針對JC病毒基因組設計特異性引物JCV-F和JCV-R，Taqman熒光探針JCV-P，Taqman熒光探針JCV-P的5’端標記有熒光基團，在除5’端外的任意一個位置上標記有淬滅基團；然后處理待測樣本，進行PCR反應；最后通過熒光定量PCR儀檢測反應結果。本發明的檢測方法可進行定性、定量檢測，具有敏感性高、特異性好、反應快速且成本低的優勢。本發明還涉及JC病毒的檢測試劑盒及其應用。
文檔編號C12Q1/68GK102690895SQ20111021189
公開日2012年9月26日 申請日期2011年7月27日 優先權日2011年7月27日
發明者葉鋒, 宋玉亮, 王新穎, 石炳毅, 范宇, 蔡明 , 解俊杰, 錢葉勇, 韓永 申請人:中國人民解放軍第三〇九醫院, 北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司