專利名稱：一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌。
背景技術：
白蟻Termite屬于節肢動物門昆蟲綱有翅亞綱等翅目的昆蟲，是較為古老的社會性害蟲。每年因白蟻危害建筑物和農作物所造成的經濟損失達千億美元以上。現有的殺滅白蟻的藥劑均為化學藥劑，故都有很大的毒副作用，造成嚴重的環境污染。利用生物技術開發具有高效、無毒、殘效期長、對環境影響小的白蟻生物防治劑成為未來白蟻防治劑的主要方向。白蟻等昆蟲能消化木材中的木質纖維素，不是它們自身的本領，而是靠其后腸內的微生物的作用。白蟻若喪失了腸道中消化木質素和纖維素的微生物的作用，就會因為不能消化木材而死。研究者已經發現，美國路易斯安納州的Jimiperus virginiana和美國俄勒岡州的Chamaecyparis Iawsoniana具有抗白蟻、抗腐蝕等特性，且從這兩種樹中分離到香榧醇、香柏酮等十多種具有抗白蟻作用的生物活性物質。據推測內生菌的基因可以和其寄生的樹木基因相互傳遞，生活在植物體這一特殊環境中的內生菌能產生與宿主相同或相似的代謝產物，所以推測這類樹的抗白蟻化合物可能由內生菌產生。另外，國外的研究也表明了植物內生菌的代謝產物對防治植物蟲害具有潛在的應用和開發價值，所以從天然抗白蟻植物中篩選出可產生抗白蟻化合物的植物內生菌切實可行。目前，利用樹木內生菌生物發酵合成的代謝產物防治白蟻在國內外尚未見有報道。
發明內容
本發明提供了一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌，可以產殺/抗白蟻化合物，增加了能夠發酵生產殺/抗白蟻化合物的微生物的數量，為利用內生菌生物發酵合成的代謝產物防治白蟻奠定了物質基礎。本發明產殺/抗白蟻化合物的內生菌為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)，保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC NO =M 209162 ；本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47革蘭氏染色陽性，桿狀，多呈單個存在或呈鏈狀排列，菌體大小為(0. 6 μ m 0.9 μ m) X (1.4 μ m 1.7 μ m)，無莢膜，產芽孢，芽孢橢圓中生，孢囊無明顯膨脹，周生鞭毛，可運動，無伴孢晶體。枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 在牛肉膏蛋白胨培養基上菌落呈白色，近圓形，不透明，表面干燥、無光澤，無明顯皺褶狀突起，邊緣不整齊，中心略突出。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47可厭氧生長，具有運動性，過氧化酶試驗呈陽性，V. P試驗呈陽性，吲哚試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗呈陽性，明膠水解試驗呈陽性，酪蛋白水解呈陽性，淀粉水解試驗呈陽性，可利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽、尿素，不能水解酪氨酸和精氨酸，能夠分解葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇產酸。可在含有20g/LNaCl、50g/L NaCl或70g/L NaCl的培養基中生長，可在含有0. 001 % (質量)溶解酵素的培養基中生長。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. novHUB-I-47)通過16S rDNA序列比對分析，與芽孢桿菌屬(Bacillus)內各種之間有極高的同源性，同源性為99%以上。與參考菌株枯草芽孢桿菌ASl. 1098 (B. subtilis ASl. 1098)和枯草芽孢桿菌Ki-2-132 (B. subtilis Ki-2-132)相比，本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47的菌體大小明顯小于參考菌株(參考菌株菌體大小為0.7μπι 0. 8 μ mX 2. 0 μ m 3. 0 μ m，呈鏈狀排列)，且枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47在培養過程中不產色素，而參考菌株在培養后期能夠產生色素。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 與參考菌株相比生長溫度不同(參考菌株的最低生長溫度為15°C、最高生長溫度為50 55°C，最適生長溫度為37°C )。通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生化試驗和分子生物學鑒定結果確定枯草芽孢桿菌新亞種菌株HUB-I-47屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為枯草芽抱桿菌亞禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana D. P. Zhou, K. Zhao, J. Liu et W. X. Ping, subsp. nov)。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47可在牛肉膏蛋白胨培養基上生長。枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47的最低生長溫度為12°C、最高生長溫度為47°C，最適生長溫度為 31 "C。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47能夠產殺/抗白蟻化合物，可以殺死或抑制白蟻。將枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中培養2 3d，取上清濃縮制得發酵液，發酵液能夠很好的抑制白蟻體內共生菌，將浸泡發酵液的濾紙片喂食白蟻，可以殺死白蟻或抑制白蟻的活動。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. novHUB-I-47)屬于才古草芽 包桿菌亞禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana D. P. Zhou, K. Zhao, J.Liu et W. X. Ping, subsp. nov)，保藏在中國典型培養物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC NO :M 209162。
圖1為本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47放大20500倍的透射電鏡照片；圖2 為本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47與GenBank中收錄的相近菌株的16S rDNA所構建的系統發育樹；圖3為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液提取物的GC-MS圖譜。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式產殺/抗白蟻化合物的內生菌為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47(Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為 CCTCC NO :M 209162。
本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)革蘭氏染色陽性，桿狀，多呈單個存在或呈鏈狀排列，菌體大小為(0. 6 μ m 0. 9 μ m) X (1. 4 μ m 1. 7 μ m)，無莢膜，產芽孢，芽孢橢圓中生，孢囊無明顯膨脹，周生鞭毛，可運動，無伴孢晶體。枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47放大20500倍的透射電鏡照片如圖1所示。枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47在牛肉膏蛋白胨培養基上菌落呈白色，近圓形，不透明，表面干燥、無光澤，無明顯皺褶狀突起，邊緣不整齊，中心略突出。參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版和《常見細菌系統鑒定手冊》對枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)進行生理生化鑒定枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47可厭氧生長，具有運動性，過氧化氫酶試驗呈陽性， V. P試驗呈陽性，吲哚實驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗呈陽性，明膠水解試驗呈陽性，酪蛋白水解呈陽性，淀粉水解試驗呈陽性，可利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽、尿素，不能水解酪氨酸和精氨酸，能夠分解葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露醇產酸。本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47可在牛肉膏蛋白胨培養基上生長。其中牛肉膏蛋白胨培養基(IOOOmL)由3g牛肉膏、IOg蛋白胨、5g NaCl和余量的蒸餾水組成， 調節PH值至7. 0 7. 2，于121°C滅菌30min。本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47的最低生長溫度為12°C、最高生長溫度為47°C，最適生長溫度為31°C。
具體實施方式
二 本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)為北美圓柏(Juniperus virginiana)豐對皮中的內生細菌菌株，由北美圓柏Eastern-red-cedar (Juniperus virginiana)樹皮中分離得至Ij。 分離方法按以下步驟進行一、將Juniperus virginiana樹皮先用無菌水沖洗(去掉樹皮表面的塵土等雜質)，用無菌剪刀剪成1.5cmXl. OcmXO. 5cm的小段，再用0. 的升汞處理樹木小段1 2min，倒掉升汞，用蒸餾水清洗3次除去殘留的升汞；或者用75%乙醇處理樹木小段3 ％iin，用蒸餾水清洗3次；二、把處理過的小木塊接入水瓊脂浸汁培養基中， 3 5d分離培養基上長出菌；三、采用三區劃線法把長出菌接種于含有制霉菌素的牛肉膏蛋白胨培養基平板上后在37°C條件下恒溫培養2 3d ；四、采用現有常規發酵方法和發酵條件進行發酵，通過對發酵液的抗菌活性和殺/抗白蟻活性分析，選取產殺/抗白蟻化合物的微生物，即得到本實施方式的枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47。本實施方式所述水瓊脂浸汁培養基的制備過程為用滅過菌的解剖刀將5g紅柏木材切成小塊，加入IOOmL水煮沸30min，取20mL樹木浸汁，加入15 20g瓊脂，加水至 IOOOmL, 121°C高壓蒸汽滅菌30min后，分裝到培養皿內備用。對分離得到的枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47進行分子鑒定，按以下步驟進行提取菌株的總DNA，采用細菌的16S rDNA通用引物，以基因組DNA為模板進行PCR擴增。然后利用膠回收試劑盒(購自于大連寶生物工程有限公司)回收純化PCR產物，之后進行克隆、 轉化，篩選陽性克隆子菌落，經擴大培養后委托上海生工生物技術有限公司測序。枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47的16S rDNA序列長度為1468bp，其序列提交至 GenBank獲得的登錄號為GQ892930，測序結果與GenBank中的16S rDNA序列進行同源性比對，構建的系統發育樹如圖2所示，以確定菌株的種屬關系。同源性分析結果表明， 該序列與芽孢桿菌屬(Bacillus)內各種之間有極高的同源性，同源性為99%以上。與參考菌株枯草芽孢桿菌ASl. 1098 (B. subtilisAS11098)和枯草芽孢桿菌Ki_2_132 (B. subtilisKi-2-132)相比，本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47的菌體大小明顯小于參考菌株(參考菌株菌體大小為0. 7 μ m 0. 8 μ mX 2. 0 μ m 3. 0 μ m，呈鏈狀排列)，且枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47在培養過程中不產色素，而參考菌株在培養后期能夠產生色素。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47與參考菌株相比生長溫度不同(參考菌株的最低生長溫度為15°C、最高生長溫度為50 55°C，最適生長溫度為37°C )。通過結合菌體形態特征、生長條件、生理生化鑒定結果確定枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，為才古草芽子包桿菌亞禾中(Bacillus subtilis subsp. virginiana D. P. Zhou, K. Zhao, J. Liu et W. X. Ping, subsp. nov)。所述枯草芽孢桿菌ASl. 1098 (B. subtilis ASl. 1098)購買自中國普通微生物菌種保藏中心，枯草芽孢桿菌Ki-2-132 (B. subtilis Ki-2-132)來源于中國科學研究院遺傳與發育生物學研究所。PCR引物購買自上海生工生物技術有限公司，其它試劑均購自于大連寶生物工程有限公司。本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液的制備方法為將分離純化所得的樹木內生菌——枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在 37°C、100r/min的條件下細菌培養2 3d ；將培養液以3500r/min離心分離10 15min， 取上清液，傾入無菌錐形瓶，在無菌條件下，用旋轉蒸發儀在40°C恒溫水浴、150r/min條件下濃縮至其體積的十分之一，放入4°C冰箱中保存，即得到發酵液。采用瓊脂擴散法評價枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液對白蟻體內共生菌(指示菌)的抗菌活性，具體是參照Okeke et al. 2001報道的方法進行，記載于 Okeke, Μ. I. , C. U. Iroegbu, E N. Eze, A. S. Okoli, and C. 0. Esimone. 2001. Evaluation of extracts of the root of Landolphia owerrience for antibacterial activity. J Ethnopharmaco 1. 78 119-127 (Okeke, M. I. , C. U. Iroegbu, E. N. Eze, A. S. Okoli, and C. 0. Esimone. Landolphia owerrience根提取物的抗菌活性的評價.民族藥物學雜志.2001，78 :119-127)。實驗結果表明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液對白蟻體內共生菌具有較好的抑制作用。本實施方式枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液的殺/抗白蟻活性評價采用的白蟻飼喂試驗，按如下方法進行將枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液按0、2、10倍進行濃縮，用不同濃縮倍數發酵液分別浸泡濾紙(Whatman No. 3，)，濾紙重量為lg、直徑為 8. 5cm ；同時，以用蒸餾水處理的濾紙作為對照。之后，將每片處理過的濾紙平鋪在直徑為 9cm、高度為1. 5cm的培養皿內，向濾紙片上放300只活白蟻，蓋上培養皿蓋。然后，將培養皿放在溫度為26. 5°C、相對濕度80%的培養箱內。定期向每個培養皿內滴水。通過計算白蟻死亡率分析菌株HUB-I-47發酵液抗白蟻活性，觀察14d。試驗結果(如表1所示)表明 菌株HUB-I-47發酵液能夠殺死白蟻，菌株HUB-I-47發酵液的0、2、10倍濃縮液組白蟻死亡率均顯著高于對照組白蟻死亡率(P < 0. 05)，且菌株HUB-I-47發酵液的2、10倍濃縮液組在14d時白蟻死亡率為100%。菌株HUB-I-47發酵液的0、2、10倍濃縮液組第14d時白蟻死亡率差異不顯著(P > 0. 05)。本試驗結果說明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液中含有殺/抗白蟻的化合物。
表1枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47發酵液抗白蟻活性
權利要求
1. 一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌，其特征在于產殺/抗白蟻化合物的內生菌為枯草芽孢桿菌新亞禾中 HUB-I-47 (Bacillus subtilis subsp. virginiana subsp. nov HUB-I-47)，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武漢市武漢大學，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC NO =M 209162。
全文摘要
一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌，涉及一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌。本發明提供了一株產殺/抗白蟻化合物的內生菌，可以產殺/抗白蟻化合物，增加了能夠發酵生產殺/抗白蟻化合物的微生物的數量，為利用內生菌生物發酵合成的代謝產物防治白蟻奠定了物質基礎。本發明產殺/抗白蟻化合物的內生菌為枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47，保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2009年7月22日，保藏編號為CCTCC NOM209162。本發明枯草芽孢桿菌新亞種HUB-I-47能夠產殺/抗白蟻化合物，可以殺死或抑制白蟻。
文檔編號C12N1/20GK102321555SQ20111026141
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月5日 優先權日2011年9月5日
發明者劉軍, 周東坡, 平文祥, 趙凱 申請人:黑龍江大學