專利名稱：抑制PAR-1基因表達的siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制PAR-I (蛋白酶激活受體-1)基因表達的SiRNA(小分子干擾RNA) 及其應用。
背景技術：
幾乎所有肝病均具有炎癥壞死，而只要有炎癥壞死，肝纖維化即發生。肝纖維化的不斷發展，引起肝小葉結構改建和假小葉形成，導致肝硬化；纖維組織壓迫血管，引起門脈高壓和肝缺血，進而加劇肝細胞壞死和炎癥，如此形成惡性循環。因此，阻斷肝纖維化的發生和發展，對防治肝硬化具有重要意義。而且我國肝病發病率是比較高的國家之一，所以尋找有效途徑抑制肝纖維化，有相當重要的意義。肝纖維化和它導致的最后階段的肝硬化，通常是由病毒感染，過度使用損害肝臟的藥物，代謝系統疾病，和遺傳因素引起的。肝纖維化的病理進程，實際上是正常的肝組織被疤痕類似的膠原蛋白代替，導致肝功能的喪失，過去認為這個過程是一個不可逆的過程， 直到最近才認為這個過程在早期是可以挽救的。根據目前的研究，表明星狀細胞在這個過程中起了關鍵作用。正常的肝臟中，星狀細胞大約占肝體積的1.4%，相當于每100個肝細胞中大約有3. 6-6個星狀細胞。纖維化的過程實際上是來自于門靜脈和竇周的α平滑肌細胞骨架陽性的肌纖維母細胞產生和增殖的過程。雖然這種細胞有不止一種的潛在來源， 但被研究的最為清楚的就是肝星狀細胞，在它們沒有被活化成α平滑肌細胞骨架陽性表型的細胞之前，它們的主要功能是貯存維生素Α，調節維甲酸的水平。可一旦被活化后，它們就成為肝纖維化中纖維膠原的主要來源，而且它們通過收縮和釋放致炎和致纖維因子，潛在的調節竇間隙的血流量。活化的星狀細胞還能產生基質金屬蛋白酶組織抑制劑，導致基質金屬蛋白酶降解肝細胞外基質的功能受損，從而使細胞外基質向膠原和纖維化轉變。隨著RNAi作為制藥技術的成熟，已有SiRNA藥物進入臨床實驗，siRNA藥物具有如下優點(1)、特異性強，堿基的順序決定了它的特異性；(2)、設計便利，由于人類基因庫已經完成，這為siRNA的設計帶來了極大的便利，可以說幾乎沒有基因不能作為siRNA的靶標；03)、臨床研究便利，siRNA藥物作為核酸類藥物，不管何種siRNA都具有大致相同的藥物代謝，藥物分布，藥物毒性，這為進入臨床研究帶來了極大的便利；、由于RNAi —開始就已將特定基因作為靶標，所以siRNA分子藥理學明確。
發明內容
本發明的目的在于利用RNAi (RNA干擾)技術，對候選的靶標基因進行效用、量效關系及特異性的評定，以提供能夠抑制PAR-I (蛋白酶激活受體-1)基因表達的siRNA(小分子干擾RNA)，并進一步地提供該siRNA在臨床上的應用。按照本發明提供的技術方案，所述siRNA為下述PAR-1-01 PAR-1-08中的任意一種，PAR-1-01 PAR-1-08 分別為PAR-1-01
正義鏈序列SEQIDNO.1為5'-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.2為5，-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3 ’
PAR-1-02
正義鏈序列SEQIDNO.3為5'-CGGCC⑶GGUGUACAUGCU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.4為5'-AGCAUGUACACCACGGCCG-3 ‘
PAR-1-03
正義鏈序列SEQIDNO.5為5'-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.6為5'-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3‘
PAR-1-04
正義鏈序列SEQIDNO.7為5'-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.8為5'-AUGAUGGAGGCGUACAU⑶-3‘
PAR-1-05
正義鏈序列SEQIDNO.9為5'-GCAUCUUCAUC⑶CUGCUU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.10 為 5'-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3‘
PAR-1-06
正義鏈序列SEQIDNO.11 為 5'-CCACCAAC⑶CCUCCUGAU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.12 為 5'-AUCAGGAGGAC⑶UG⑶GG-3‘
PAR-1-07
正義鏈序列SEQIDNO.13 為 5'-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.14 為 5'-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3‘
PAR-1-08
正義鏈序列SEQIDNO.15 為 5'-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.16 為 5'-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3‘
上述的各siRNA序列的3‘端垂懸兩個dTdT，該垂懸不與mRNA序列互補，使正義鏈3'端更容易解鏈，從而增加其沉默效率。
上述的各siRNA序列可用于制備治療肝纖維化的藥物。
siRNA是RNAi途徑中的中間產物，是RNAi發揮效應所必需的因子。siRNA的形
成主要由Dicer和Rde-I調控完成。由于RNA病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重復序列轉錄等原因，細胞中出現了 dsRNA，Rde-I (RNAi缺陷基因-1)編碼的蛋白質識別外源 dsRNA,當dsRNA達到一定量的時候，Rde-I引導dsRNA與Rde-I編碼的Dicer (Dicer是一種 RNaseIII活性核酸內切酶，具有四個結構域=Argonaute家族的PAZ結構域，III型RNA酶活性區域，dsRNA結合區域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區)結合，形成酶-dsRNA復合體。 在Dicer酶的作用下，細胞中的單鏈靶mRNA(與dsRNA具有同源序列)與dsRNA的正義鏈互換，原來dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA復合物中釋放出來，然后，在ATP的參與下，細胞中存在的一種RNA誘導的沉默復合體RNA-induced silencing complex (RISC, 由核酸內切酶、核酸外切酶、解旋酶等構成，作用是對靶mRNA進行識別和切割)利用結合在其上的核酸內切酶的活性來切割dsRNA上處于原來正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA 反義鏈互補的區域，形成21-23nt的dsRNA小片段，這些小片段即為siRNA。RNAi干涉的關鍵步驟是組裝RISC和合成介導特異性反應的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后與靶標基因編碼區或UTR區完全配對，降解靶標基因，因此說siRNA只降解與其序列互補配對的 mRNA。其調控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達，所以是一種典型的負調控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的。而且它的合成非常簡便，已經成為一項很成熟的技術。本發明針對PAR-I基因設計合成了 8對siRNA，該8對siRNA能夠有效抑制PAR-I 基因的表達；同時由于siRNA技術越來越成熟，也為治療肝纖維化提供了可行的藥物。
圖1為可見光源條件下的siRNA轉染效率照片。圖2為熒光激發條件下的siRNA轉染效率照片。圖3為熒光定量PCR檢測轉染不同siRNA的PAR-I基因表達水平圖。圖中M0CK是未轉染任何siRNA的空白對照組；si-control是轉染si-control的 siRNA 的無關對照組；PAR-1-01 PAR-1-08 是轉染 PAR-1-01 PAR-1-08 的 siRNA 組圖4為熒光定量PCR檢測肝纖維化病理過程(天數)與PAR-I的mRNA的表達水平關系圖。圖中天數用于衡量肝纖維化病理過程圖5為熒光定量PCR檢測肝纖維化病理過程(天數)與TGF-betal的mRNA的表達水平關系圖。圖中天數用于衡量肝纖維化病理過程圖6為熒光定量PCR檢測肝纖維化病理過程(天數)與Collal的mRNA的表達水平關系圖。圖中天數用于衡量肝纖維化病理過程圖7為PAR-1-01的siRNA在不同濃度下的量效曲線。圖8為原代肝星型細胞體外培養不同時間的細胞形態圖。圖9為熒光定量PCR檢測轉染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞(體外培養 48小時)的PAR-I基因表達水平圖。圖10為熒光定量PCR檢測轉染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞(體外培養 48小時)的TGF-betal、Collal基因表達水平圖。圖11為熒光定量PCR檢測轉染不同濃度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞 (體外培養48小時)的TGF-betal、Collal基因表達水平圖。圖12為熒光定量PCR檢測轉染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞(體外培養 5天)的PAR-I基因表達水平圖。圖13為熒光定量PCR檢測轉染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞(體外培養 5天)的TGF-betal、Collal基因表達水平圖。圖14為熒光定量PCR檢測轉染不同濃度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細胞 (體外培養5天)的TGF-betal、Collal基因表達水平圖。
具體實施例方式下面結合具體附圖和實施例對本發明作進一步說明。本發明利用PCR和Wfesternblot技術確定了 HSC-T6肝星型細胞能夠在RNA和蛋白水平大量表達PAR-I基因，所以本發明采用大鼠HSC-T6肝星型細胞系(來自于湘雅醫學院細胞庫)作為siRNA篩選細胞，該細胞常規培養在DMEM高糖培養劑(含10%體積比的胎牛血清中)，培養條件為37°C，5%體積比的二氧化碳，每三天傳代一次。1、siRNA的設計合成根據siRNA設計原理，針對PAR-I基因的mRNA序列設計了 8對siRNA(參見表 1)。PAR-1-01 PAR-1-06設計成大小鼠同源的siRNA，目的主要是為了能夠利用大鼠的 HSC-T6細胞系進行siRNA的篩選，而不必從大鼠或小鼠的肝臟中分離肝星型細胞，同時在后續的動物實驗中能夠利用小鼠作為病理模型，由于小鼠體重較大鼠輕很多，所以給藥劑量可以大大減少，可以大大減低siRNA合成費用。設計方法及步驟為(1)利用NCBI的核苷酸數據庫分別找到大鼠和小鼠PAR-I基因的RNA序列，它們在NCBI的Accessions分別為NM_012950. 2和NM_010169. 3 ； (2)利用CLUSTAL X (2. 0)序列比對軟件將兩條序列進行比對并找到同源部分；(3)利用Whitehead Institute在其網站(網址為:http//jura, wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php)上發布的siRNA設計軟件，針對同源部分進行設計；(4)利用NCBI的blastn的程序，調用數據庫nt/nr進行分析，結果顯示設計的這6對 siRNA不會與大鼠、小鼠除PAR-I基因之外的其它基因的序列同源。PAR-1-07 PAR-1-08 是僅針對大鼠PAR-I基因的siRNA設計，目的在于去除同源序列這個限制因素，使得siRNA 的設計結果更加可靠。上述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供合成。為提高所述siRNA的基因沉默效率，所述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA的 3'端垂懸有兩個由脫氧核苷組成的堿基TT。
權利要求
1.抑制PAR-I基因表達的siRNA，其特征在于，所述siRNA為 PAR-1-03 正義鏈序歹Ij SEQ ID NO. 5 為 5，- CCUUCAAGAUCAGCUACUA - 3， 反義鏈序列 SEQ ID NO. 6 為 5，- UAGUAGCUGAUCUUGAAGG- 3，。
2.如權利要求1所述的抑制PAR-I基因表達的siRNA，其特征還在于，所述siRNA的3’ 端垂懸有兩個用于提高基因沉默效率的由脫氧核苷組成的懸掛堿基TT。
3.如權利要求1或2所述的抑制PAR-I基因表達的siRNA，其特征于，所述siRNA序列用于制備治療肝纖維化的藥物。
全文摘要
本發明根據siRNA設計原理，針對PAR-1基因的mRNA序列設計了8對siRNA，該8對siRNA可以用于抑制PAR-1基因表達的siRNA，由于PAR-1基因的表達水平與肝纖維化密切相關，抑制PAR-1基因的表達就能有效延緩甚至阻斷肝纖維化的病理進程，達到治療肝硬化的目的。上述8對siRNA序列可用于制備治療肝纖維化的藥物。
文檔編號C12N15/113GK102382833SQ201110377138
公開日2012年3月21日 申請日期2010年1月22日 優先權日2010年1月22日
發明者張紅, 潘振華, 盛青松 申請人:無錫奧瑞生物醫藥科技有限公司