專利名稱：一種傷寒沙門氏菌基因缺失菌株及由其制備的疫苗和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種不含抗性標記 的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株，由其構建的疫苗及該疫苗的應用，屬于動物細菌基因工程技術領域。
背景技術：
沙門氏菌(Salmonella)是寄生于人和動物體內的一種革蘭氏陰性桿菌。在人、家畜、家禽、野生動物、嚙齒動物體內常分離到沙門氏菌，本屬細菌也常存在于水、乳、肉、蛋中及其他食品和飼料中。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。某些沙門氏菌是重要的人畜共患病原，有些是動物疾病病原，有些是人和動物食物中毒或飼料中毒常見病原性細菌，因而本屬細菌在食品衛生、外貿出口、人畜疾病發生中均十分重要。據統計在世界各國的各種細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。細胞免疫在抗沙門氏菌感染中具有重要作用。細胞免疫反應性與大劑量沙門氏菌攻擊動物的保護性通常呈現很好的相關性。但體液抗體可加速病原菌的排出。動物接觸環境中的沙門氏菌或在注射疫苗后，其體液免疫應答主要是IgM抗體。在疾病康復或口服弱毒苗感染的動物腸道中，可出現特異性分泌型IgA。動物在感染沙門氏菌病愈后，可獲得堅強的免疫力，能抵抗再次感染。目前應用的獸用疫苗多限于預防各種家畜特有的沙門氏菌病，例如豬霍亂沙門氏菌(S. choleraesuis)、馬流產沙門氏菌(S. abortusequi)以及牛、羊都柏林沙門氏菌(S. dublin)等滅活疫苗，在國內外均已應用，兩次接種即可預防孕畜流產或幼畜感染。據報道，用減毒或無毒活菌注射或口服免疫動物，效果優于滅活菌苗。人類感染的沙門氏菌主要來源于畜禽，而沙門氏菌感染家畜后可引起一系列的臨床疾病并成為肉制品污染的一個重要來源。因此，國內外動物檢疫規程均把沙門氏菌列為重要的衛生檢出指標之一。傷寒沙門氏菌(S.typhi)是一種常見、重要的人畜共患腸道病原菌，不僅能導致雞白痢、家畜流產等動物性疾病發生，還能使人類發生傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒等疾病。1877年幾乎同時由德國細菌學家Karl Joseph Eberth和RobertKoch從傷寒病人糞便中發現傷寒沙門氏菌，1884年德國細菌學家Georg T. A. Gaffky從病人脾臟中再次分離到該病原菌，并鑒定出其抗原結構式為9，12，[Vi]:d:-，為革蘭氏陰性桿菌，兼性厭氧，具周身鞭毛，能運動，不形成芽孢。傷寒沙門氏菌能引起人和動物全身性、急性、發熱性的感染，致病菌主要侵入網狀內皮系統、腸道淋巴結及膽囊，并導致廣泛的全身性臨床癥狀，主要表現為持續性高熱、腹痛及小腸結腸炎等癥狀。在成人和年長兒童常出現便秘，而幼齡兒童則常出現腹瀉。雖然隨著社會衛生條件的改善，可降低傷寒的發病率，但由于耐藥菌株的不斷增多，應用免疫預防手段仍然是控制本病的有效措施，因此傷寒疫苗的研究對預防傷寒病的發生具有更實際的意義。目前在全世界各地獲準使用的傷寒沙門氏菌疫苗主要有熱滅活-酚防腐全菌體疫苗或經丙酮滅活凍干全菌體疫苗，純化Vi多糖疫苗，口服減毒Ty21a減毒活疫苗。由于滅活苗具容易引起全身及局部反應、只能激發體液免疫、不能提供交叉保護、需多次加強免疫等缺點，此類疫苗的應用受到限制。多糖結合疫苗生產工藝較難、成本高，在發展中國家推廣仍有一定困難。隨后，人們發現弱毒沙門氏菌在誘導體液和細胞免疫反應方面比滅活疫苗或亞單位疫苗更為有效。于是,盡管傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗一直在沿用，但由于免疫效果不佳，免疫途徑不方便而逐漸被弱毒活疫苗所取代。各種沙門氏菌弱毒苗在世界范圍內得到了廣泛應用，取得了良好的預防效果(Curtiss R，III，Doggett T,Nayak A,Srinivasan J. 1996. Strategies for the use of live recombinantavirulent bacterial vaccines for mucosal immunization,p. 499-511. In H. Kiyono andM. F. Kagnoff (ed. ), Essentials of mucosal immunology. Academic Press, San Diego,Calif ；Sirard J C,Niedergang F,Kraehenbuhl J P. 1999. Live attenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 :5_26)。Ty21a 是由野生型 Ty2 經化學劑亞硝基胍處理而獲得的株，該株毒力明顯降低，可提供67 79%的免疫保護力，因此許多國家生產并應用該型減毒活疫苗，使傷寒病得到有效控制。但該弱毒疫 苗菌株由野生強毒株經過化學致弱方法制得，遺傳背景不清，存在毒力返強的風險。因此，仍然需要開發遺傳背景清楚、性狀穩定、更符合生物安全性的新型傷寒沙門氏菌弱毒疫苗。隨著現代分子生物學和DNA重組技術的發展以及許多其他毒力或毒力相關基因的不斷發現，許多研究者仍在不斷以改進某些毒力或毒力相關基因來制備新的弱毒活疫苗。使用基因工程手段致弱沙門氏菌從而篩選獲得弱毒疫苗株已經成為國際上的研究熱點。這主要是因為新型弱毒沙門氏菌疫苗不僅能用于沙門氏菌病的防制，而且能作為開發其它多種傳染病疫苗的載體(Sirard J C, Niedergang F, Kraehenbuhl J P. 1999. Liveattenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Tmmunol. Rev. 171 5~26 ；Spreng S, Dietrich G. Weidinger G. . 2006. Rational design of Salmonella-basedvaccination strategies. Methods 38 :133-143)。與致病性密切相關的沙門氏菌毒力因子主要包括脂多糖、腸毒素、細胞毒素、侵襲力與毒力基因及毒力調節基因等。人們嘗試通過各種基因工程手段缺失其中的某些毒力相關基因，致使沙門氏菌毒力降低，但仍保留其免疫原性，最終篩選獲得沙門氏菌基因缺失弱毒疫苗株。研制中的減毒傷寒沙門氏菌口服疫苗主要有以下幾種aroA (編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)和purA (編碼嘌呤的生物合成)株541Ty、aroA和aroD株CVD906、cya (編碼環化腺苷酸合成酶)和crp (編碼cAMP受體蛋白)株X 3927、cya、crp和cdt (編碼深部組織的繁殖)株x 4073、phoP/phoQ基因(編碼轉錄激活因子/傳感器激酶)株Ty800 (Hohmann E L，Oletta C A7MillerS I.1996.Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonellatyphi vaccine strain in human volunteers. Vaccine, 14(1) :19-24)等等。理想的弱毒活疫苗應具備下列條件(I)完全無毒力株的殘余毒性一般不被接受。(2)對后代無害疫苗所誘導的保護性免疫應能傳給下一代，而疫苗本身不應垂直傳播。(3)不能回復防止回復的發生，降低毒力返強的風險。(4)高度免疫原性活疫苗應能夠有效的刺激機體產生特異性免疫反應。(5)對環境不造成污染疫苗應在體內存留特定的時間，誘導免疫反應后被某種機制清除并不滯留于環境。(6)經濟且方便使用諸如口服、滴鼻、肌肉注射等免疫方法比較簡單、方便。沙門氏菌活疫苗可以侵入淋巴系統，能更有效地激發宿主的體液和細胞免疫，并通過自然感染途徑如口服或鼻內接種，激發系統和粘膜免疫反應(Curtiss R, III, Doggett T, Nayak A, Srinivasan J. 1996. Strategiesfor the use of live recombinant avirulent bacterial vaccines for mucosalimmunization,p. 499-511. In H. Kiyono and M. R Kagnoff (ed.)，Essentials of mucosalimmunology. Academic Press，San Diego, Calif ；Sirard J C，Niedergang F，KraehenbuhlJ P. 1999. Live attenuated Salmonella a paradigm of mucosal vaccines. Immunol.Rev. 171 :5-26) 0這樣，弱毒活疫苗也許是解決當前商品化疫苗不足的一種可行方法。已有的構建沙門氏菌基因缺失弱毒疫苗株的基因工程手段仍存在不少缺陷。例如，利用轉座子介導的方法存在隨機性，只適合于表型發生明顯變化子的篩選，而不導致明顯表型變化的菌株就不能夠通過這些方法獲得；傳統的利用同源重組導致靶基因方法雖然精確，但獲得的菌株最后往往含有抗性標記，由于不符合生物安全性要求不能作為疫苗株用于疫苗生產。
發明內容
本發明的一個目的在于提供一種免疫原性更好和安全性更強的傷寒沙門氏菌基 因缺失菌株。進一步地，本發明的第二個目的在于提供了一種利用傷寒沙門氏菌基因缺失菌株制備的傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗。更進一步地，本發明的第三個目的在于提供一種傷寒沙門氏菌基因缺失菌株在制備傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗中的應用。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種不含抗性標記的傷寒沙門氏菌(分類命名Salmonella typhi) crp基因缺失菌株AcrpST-I (簡稱AcrpST-l,下同)，于2011年11月3日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號=CCTCC NO M2011373。所述的不含抗性標記的傷寒沙門氏菌基因缺失了傷寒沙門氏菌的主要毒力調節基因crp，缺失后傷寒沙門氏菌株毒力顯著減弱，但仍具有很好免疫原性。本發明的不含抗性標記傷寒沙門氏菌基因缺失菌株AcrpST-l，其基因工程菌株衍生于傷寒沙門氏菌ST-I (簡稱ST-1，下同)。其中，ST-I為分離自豬的野生型傷寒沙門氏菌強毒菌株，血清型為9，12，[Vi] :d:-，于2011年11月3日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為 CCTCC NO M2011372o所述的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株AcrpST-l，其主要毒力調節基因crp缺失了320bp的DNA片段，導致該細菌不能從哺乳動物中攝取cAMP，生長比較緩慢，且毒力大大降低，因而具有很高的安全性。但經動物試驗證實，該基因缺失菌株具有很好的免疫保護力。本發明的基本構建方法是利用基因工程技術缺失了傷寒沙門氏菌野生型強毒株ST-I的毒力調節基因crp，從而構建成新的株AcrpST-l。通過大量的生物學實驗數據證明本發明制備的基因缺失菌株AcrpST-I可用于制備針對傷寒沙門氏菌感染的弱毒活疫苗。本發明的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保護性，且毒力較弱，對免疫豬無任何不良副作用，跟傳統該類疫苗相比更安全。因此，用該親本菌株構建的基因缺失菌株制成疫苗，具有廣闊的市場應用前景。另外，本發明傷寒沙門氏菌基因缺失菌株保留了針對傷寒沙門氏菌感染的免疫保護效力，而且遺傳背景清晰，性狀穩定，因而具有更好的生物安全性。本發明傷寒沙門氏菌基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。
序列I是本發明構建傷寒沙門氏菌crp基因缺失株所用的上游同源臂的序列(1048bp)；序列2是本發明的來源菌株傷寒沙門氏菌野生菌ST-I中缺失的部分crp基因序列(32Ibp)；序列3是本發明構建傷寒沙門氏菌crp基因缺失株所用的下游同源臂的序列 (1743bp)；圖I為本發明制備的轉移質粒pREcrpl2的物理圖譜；圖2為本發明制備的轉移質粒pREcrpl2構建的流程圖；圖3為本發明所使用的基因同源重組原理示意圖；圖4為本發明中不含抗性標記的傷寒沙門氏菌crp基因缺失菌株Λ crpST-1的PCR檢測電泳圖譜；圖4A : Λ crpST-1 株 PCR 鑒定圖(Pr5/Pr6)，圖中 M 為 DNAmarker (DL 2，000) ； I 和2為篩選的Δ crpST-Ι株(599bp) ；3為H2O對照；4和5為親本菌株ST-I對照(918bp)；圖 4B : Λ crpST-1 株 PCR 鑒定圖(Pr7/Pr6)，圖中 M 為 DNAmarker (DL 2，000) ; I、2和3為篩選的Λ crpST-1株(1412bp) ；4為H2O對照；5為pRE112質粒對照；6和7為親本菌株 ST-I 對照(1731bp)；圖5為本發明中的不含抗性標記的傷寒沙門氏菌株AcrpST-I在加I %麥芽糖的麥康凱瓊脂上的菌落形態；圖5中的A和A’分別為親本菌株ST-I和缺失菌株Λ crpST-1在LB培養基上的菌落形態和B’分別為親本菌株ST-I (無色)和缺失菌株△ crpST-Ι (無色)在麥康凱瓊脂上的菌落形態；C和C’分別為親本菌株ST-I (紅色)和缺失菌株Λ crpST-1 (無色)在含有I %麥芽糖的麥康凱瓊脂上的菌落形態；圖6 :是本發明中的傷寒沙門氏菌株Λ crpST-1的生長特性試驗結果；圖7 :是本發明中一種傷寒沙門氏菌株Λ crpST-1的遺傳穩定性實驗結果。注是引物Pr5/Pr6對缺失菌株Λ crpST-1遺傳穩定性的PCR鑒定圖，圖中M =DNAmarker (DL 2，000) ；1為H2O對照;2 7為I、10、20、30、40和50代缺失菌株模板的擴增結
果O
具體實施例方式實施例I傷寒沙門氏菌ST-Icrp基因缺失菌株的構建I、引物設計(用于基因克隆和分子檢測)參照文獻(郁川，等.豬霍亂沙門氏菌C78-1株Λ crp缺失菌株的構建及其生物學特性初步研究.畜牧獸醫學報，2010，41(5) =587-593)和已報道的傷寒沙門氏菌株Ty2的crp基因序列(GenBank No AE016847)設計2對引物(prl/pr2和pr3/pr4,見表I),從傷寒沙門氏菌強毒株ST-UST-I為分離自豬的野生型傷寒沙門氏菌強毒菌株，于2011年11月3日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC NO :M2011372。)基因組中分別擴增crp基因上下游片段crpl (上臂)和crp2 (下臂)，擴增片段大小分別為1048bp和1743bp，上臂兩端分別引入Xba I和BamH I酶切位點，下臂兩端分別引入Xho I和KpnI酶切位點。另設計2對引物(pr5/pr6和pr7/pr6,見表I)進行ST-I親本菌株和crp缺失菌株的鑒定。引物均由上海生物工程有限公司合成。表1:PCR 引物
權利要求
1.ー種傷寒沙門氏菌基因缺失菌株，其特征在干該菌株是傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi) Λ crpST-1，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:M2011373。
2.根據權利要求I所述的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株，其特征在于該菌株的缺失了環化腺苷酸(cAMP)受體蛋白基因crp中320bp的DNA片段。
3.一種由權利要求I所述的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株在制備傷寒沙門氏菌基因缺 失疫苗的應用。
4.ー種由傷寒沙門氏菌基因缺失菌株制備的缺失菌株制備的傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗。
5.根據權利要求4所述的傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗，其特征在于所述的傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗為傷寒沙門氏菌基因缺失弱毒活疫苗。
6.ー種傷寒沙門氏菌基因缺失菌株在制備傷寒沙門氏菌基因缺失疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種傷寒沙門氏菌基因缺失菌株及由其制備的疫苗和應用，該菌株是傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)ΔcrpST-1，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM2011373。本發明的傷寒沙門氏菌基因缺失菌株具有很好的免疫保護性，且毒力較弱，對免疫豬無任何不良副作用，跟傳統該類疫苗相比更安全。因此，用該親本菌株構建的基因缺失菌株制成疫苗，具有廣闊的市場應用前景。另外，本發明傷寒沙門氏菌基因缺失菌株保留了針對傷寒沙門氏菌感染的免疫保護效力，而且遺傳背景清晰，性狀穩定，因而具有更好的生物安全性。本發明傷寒沙門氏菌基因缺失菌株不含抗性標記，完全符合疫苗生物安全性要求。
文檔編號C12N1/20GK102676419SQ20111040201
公開日2012年9月19日 申請日期2011年12月6日 優先權日2011年12月6日
發明者周金龍, 王浩, 王臣, 薛云, 趙戰勤 申請人:河南科技大學