一種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑及其應用方法

專利名稱：一種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑及其應用方法
技術領域：
本發明涉及應用于稻草秸稈的就地還田高效穩定成肥使用的ー種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑及其應用方法。
背景技術：
農作物秸稈作為ー種可再生資源，我國毎年農業生產過程中要產生近2億噸稻草。由于自然腐解需要時間較長，焚燒處理仍在大量使用，稻草的快速腐解并用于還田處理是倍受關注的問題。所以，農作物秸稈分解利用對于解決未來的能源危機與環境問題意義重大。湖南是農業大省，糧食作物以雙季水稻為主。毎年總秸稈量約3200萬噸，其中稻草秸稈約2755萬噸。正值國家啟動的“秸稈還田提升土壌有機質”項目和湖南省水稻秸稈綜合利用示范區創建的時期，本研究所針對南方生態、環境條件和耕作制度，擬研制出適應能力強和降解效率高的有機物料腐熟劑。該技術及其產品的應用可以加快秸稈的腐熟速率，提高土壌中有機質、速效鉀等的含量，可以加速水稻營養供應、促進有效分蘗，從而增加株高和有效穗，提升水稻產量。從而有效地提高了秸稈綜合利用率，可取得較好的經濟效益、生態效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的在于提供一種適合于秸稈田間就地還田條件、能夠快速高效腐解秸稈、具有一定穩定性的ー種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑及其應用方法。本發明所采用的技術方案ー種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑中含有含菌量配比1 :1:1 的康寧木霉 CGMCC NO. 3.似90 ；地衣芽孢桿菌(Bacillus 1 icheniformis)CGMCC NO. 4835 ； 枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414 ；所述的菌劑由以下三種成分混合組成康寧木霉CGMCC NO. 3. 4290依次經過液體發酵、固體發酵培養后的產物、地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物、枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物。所述的康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290于25_28°C固體發酵培養45-4 ,產物中菌含量不低于IO8個/g，所述的枯草芽孢桿菌在34-37°C培養22-24h，所述的地衣芽孢桿菌在 45-55°C培養36-40h后，分別將培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均不低于IO9個/g，所述的菌含量包括菌體和芽孢總的含量。所述的菌劑中菌含量不低于2 X IO8個/g，菌劑細度不超過0. 18mm,含水量不高于 30%。4.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290固體發酵具體過程如下首先將所述的康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，培養時間22-Mh，溫度25-28°C，轉速 120-150rpm ；通氣量0. 4-0. 5VVM ；接種量占培養基體積的10-15%，發酵罐中培養基裝量占發酵罐體積的60-70%，液體發酵培養基配制方法為蔗糖20g，酵母粉0. 2g，麥芽粉3. Og, NaCl 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, KH2PO4 1. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，(NH4)2SO4 0. 5g，加蒸餾水至 1L, pH6. 5，121°C,0. IMPa 高壓滅菌 30min ；然后接種占固體培養基重量10-15%的發酵培養種子液，25-觀で固體發酵培養45-48h ；固體發酵培養基的配制方法為玉米粉10g，麥麩90g, (NH4)2SO4 1. 0g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 05g，80mL蒸餾水，121°C,0. IMPa高壓滅菌30min,固體發酵罐中培養基的裝量為體積的60-70%。所述的地衣芽孢桿菌CGMCC NO. 4835經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，所用液體發酵培養基的配制方法為淀粉 5. 0g，糊精 20g，豆餅粉 25g，酵母粉 3. 0g，CaCO3 12g，(NH4)2SO4 10g, NaCl 4. 0g, KH2PO4 0. 2g，加蒸餾水至1L，ρΗ7· 2-7. 4,121 °C,0. IMPa高壓滅菌30min ；培養時間36_40h，溫度 45-55°C，轉速180-200rpm，通氣量0. 8-1. 0VVM,接種量占培養基體積的8_10 %，發酵罐中培養基的裝液量為發酵罐體積的55-65%。所述的枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，所用液體發酵培養基的配制方法為葡萄糖 5. 0g，蔗糖 3. 0g，豆餅粉 15g，酵母粉 10g，蛋白胨 5. 0g，CaCO3 1. 0g, FeCl3 · 6H20 0. lg, KH2PO4 4. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MnSO4 · H2O 0. 062g，加蒸溜水至 1L, ρΗ7· 2，121°C,0. IMPa 高壓滅菌30min ；培養時間22_24h，溫度；34_37で，轉速180_200rpm，通氣量0. 8-1. 0VVM，接種量占培養基體積的8-10%，發酵罐中培養基的裝液量為發酵罐體積的55-65%。上述菌劑制備過程中，麥麩吸附吋，其重量比例占70-80%。所述的菌劑用于提高水稻性狀和產量；具體是添加到稻草秸稈中，用于加速稻草秸稈腐熟、提高土壌中有機質、速效鉀的含量，加速水稻營養供應、促進有效分蘗，從而增加株高和有效穗，提升水稻產量。本發明的組合菌株的原理及有益效果是本發明針對秸稈的組成，以多種木質素酶活力、纖維素酶活力、半纖維素酶活力及秸稈降解率為檢測指標，特別選取康寧木霉 CGMCC N0. 3. 4290 ；地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835 ；枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414。再將三種菌株培養的產物混合制備而成的菌劑應用于稻草就地還田田間小區試驗。由于在對秸稈結構進行研究以后，人們發現木質素與半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋在其中，形成ー種天然屏障，使纖維素酶等不易與纖維素分子接觸，而木質素的非水溶性、化學結構的復雜性，導致了秸稈的難降解性。因此要徹底降解纖維素，首先必須解決木質素的降解問題。首先利用康寧木霉針對秸稈外層難分解成分蠟質和木質素優先降解；再通過結合纖維素降解菌(地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌)能動構建出提高稻草類秸稈腐解效率的菌株組合。針對秸稈由木質素、纖維素、半纖維素等組成，本發明將能分泌高活性的木質素酶、纖維素酶和半纖維素酶的康寧木霉、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌菌株進行組合。由于該菌種組合具有多種菌株，具有一定穩定性，而且所有菌都以芽孢形式存在，生長條件適用廣，易存活繁殖，尤其在碳源利用上具有很強的協同性，因此易于提高秸稈腐熟效率。該秸稈降解菌劑組合在降解秸稈的14天內，PH值保持穩定，木質素酶、纖維素酶活力及有效活菌數量始終保持在IO7個/g以上，秸稈降解率不斷増加，說明該秸稈降解菌劑對PH具有很強適應和調節能力，能夠保持性質穩定，同時在功能發揮上也具有一定穩定性。該菌劑以孢子為主要存在形式，且細度在0. 18mm水平級，適應性強，在應用于稻草秸稈的就地還田成肥中，適于撒施、噴施，易于機械化操作，可以大大降低勞動強度，縮短使用周期，加速秸稈腐熟，有利于大規模使用。本發明菌種組合中地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)保藏號為CGMCC NO. 4835，是由本申請人自己篩選的菌株，并于2011年5月9日在位于中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，而且申請了專利，申請號為201110166962.0。枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 11414和康寧木霉CGMCC NO. 3. 4290均購買于中科院微生物研究所。
具體實施例方式以下結合實施例旨在進ー步說明本發明，而非限制本發明。實施例1本發明菌劑制備1)將康寧木霉CGMCC NO. 3. 4290經過斜面種子、搖瓶種子培養后至液體發酵罐發酵培養，最終在固體發酵罐中培養產抱，斜面種子培養所用培養基的配制方法為蛋白胨 6. 0g，土豆 200g，NaCl 2. 0g, MgSO4 1. 0g，蔗糖20g，KH2PO4 1. 0g，瓊脂 18_20g，加蒸餾水至 lL，pH自然，121°C,0. IMPa高壓滅菌30min。斜面種子培養時間30_36h，溫度25_28°C。斜面種子接種ニ至三環至搖瓶種子培養，在500mL三角搖瓶中培養基裝量為100mL。搖瓶種子所用培養基的配制方法為豆餅粉1. 5g，蔗糖20g, MgSO4 1. 5g，KH2PO4 3. 0g，加蒸餾水至1L， pH 自然，121°C,0. IMPa 高壓滅菌 30min，培養時間 22_24h，溫度 25_28°C，轉速 120_150rpm， 液體發酵罐培養基中培養，培養時間22h，溫度觀で，轉速150rpm，通氣量0. 5VVM。液體發酵培養基配制方法為蔗糖20g，酵母粉0. 2g，麥芽粉3. 0g, NaCl 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. Ig, KH2PO4 1. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，(NH4)2SO4 0. 5g，加蒸餾水至 1L，ρΗ6· 5，121°C,0. IMPa 高壓滅菌30min ；接種量占培養基體積的15%，發酵罐中培養基裝量占體積的70%。2)然后接種占固體培養基重量15%的液體發酵培養種子液，25°C固體發酵培養48h ；固體培養基的配制方法為玉米粉10g，麥麩90g，(NH4)2SO4 1. Og，KH2PO4 0. 2g, MgSO4 · 7H200. 05g,80mL蒸餾水，121°C,0. IMPa高壓滅菌30min。固體發酵罐中培養基的裝量為體積的70%。產物中菌含量在3-6X IO8個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。幻地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835先經過斜面種子、搖瓶種子培養后至發酵培養， 其中地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835斜面種子培養所用培養基的配制方法為葡萄糖4. Og, 酵母膏4. Og,麥芽粉10. 0g, CaCO3 2. Og,瓊脂20g,加蒸餾水至1L，ρΗ7· 2，培養時間24-26h, 溫度45-55°C。斜面種子接種ー環至搖瓶種子培養，在500mL三角搖瓶中培養基裝量為 100mL。所用培養基的配制方法為淀粉30. 0g，豆餅粉5. 0g，酵母膏5. 0g，CaCO3 5. 0g, (NH4)2S044. 0g, NaCl 5. 0g, KH2PO4 0. 12g，加蒸餾水至 1L，ρΗ7· 2，121°C,0. IMPa 高壓滅菌 30min。培養時間M-30h，溫度45-55°C，轉速200-220rpm。然后接種占發酵培養基體積8% 的種子培養液到發酵培養基中培養36h，溫度55°C，轉速200rpm，通氣量0. 8VVM。發酵罐中培養基的裝液量為65%。所用發酵培養基的配制方法為淀粉5. 0g，糊精20g，豆餅粉25g， 酵母粉 3.0g，CaCO3 12g，(NH4)2SO4 10g, NaCl 4. 0g, KH2PO4 0. 2g，加蒸餾水至 1L，ρΗ7· 2， 121°C,0. IMPa 高壓滅菌 30min。將發酵培養的培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均在4-6X IO9個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。4)枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414先經過斜面種子培養、搖瓶種子培養后至發酵培養，所用斜面種子培養基的配制方法為牛肉膏3. 0蛋白胨10. 0氯化鈉5. 0，加蒸餾水至1L, pH7. 2,121 °C, 0. IMPa高壓滅菌30min ；培養時間22_Mh，溫度;34-37 °C。斜面種子接種ー環至搖瓶種子培養，在500mL三角搖瓶中培養基裝量為100mL。搖瓶種子培養所用培養基的配制方法為牛肉膏5. 0酵母提取物5. 0蛋白胨10. 0葡萄糖5. 0氯化鈉5. 0 蒸餾水 1000mlpH7. 0,121 °C,0. IMPa 高壓滅菌 30min。培養時間 22_24h，溫度 34_37°C，轉速200-220rpm。接種8%的搖瓶種子培養液至發酵培養基中，發酵罐中培養基的裝液量為 65 %。所用發酵培養基的配制方法為葡萄糖5. Og,蔗糖3. Og,豆餅粉15g，酵母粉10g， 蛋白胨 5. 0g, CaCO3L 0g, FeCl3 · 6H20 0. lg, KH2PO4 4. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MnSO4 · H2O 0. 062g，加蒸餾水至1L，ρΗ7· 2，121°C，0. IMPa高壓滅菌30min。培養時間22h，溫度37°C，轉速200rpm，通氣量0. 8VVM。將發酵培養的培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均在6_8X IO9 個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。5)將上述康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290依次經過液體發酵、固體發酵培養后的產物；與地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物、枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物混合后得到的菌劑。 麥麩吸附的重量比例為70%，含菌量配比1 1 1的康寧木霉CGMCC N0. 3.似90;地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835 ；枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414 ；菌劑中菌含量為2X108個/g ；菌劑細度為0. 18mm，含水量不高于30%。實施例2菌劑制備方法同實施例1，只是康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290液體發酵罐培養基中培養時的培養時間為Mh，溫度25°C，轉速120rpm，通氣量0. 4VVM，。接種量占培養基體積的10%，發酵罐中培養基裝量是60%。然后接種占固體培養基重量10%的液體培養種子液，28°C固體發酵培養45h;固體發酵罐中培養基的裝量為體積的60%。產物中菌含量在 3-6 X IO8個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。地衣芽孢桿菌CGMCC N0. 4835，接種占發酵培養基體積10 %的種子培養液到發酵培養基中培養40h，溫度45°C，轉速180rpm，通氣量1. 0VVM,。發酵罐中培養基的裝液量為 55 %。將培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均在4-6 X IO9個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414，接種10%的搖瓶種子培養液至發酵培養基中，培養時間Mh，溫度35°C，轉速180rpm，通氣量1. 0VVM，。發酵罐中培養基的裝液量為55%。 將發酵培養的培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均在6-8X IO9個/g，菌含量包括菌體和芽孢總的含量。麥麩吸附的重量比例為80%，最后得到的菌劑中菌含量為2X108個/g，菌劑細度為0. 18mm，含水量不高于30%。
實施例3菌劑秸稈降解率對比稻草秸稈降解率測定培養基的培養方法為新鮮稻草秸稈剪成Icm長的短稈，稱取20g加入500mL的三角瓶，每瓶再加入50g的以下菌劑和IOOmL蒸餾水，混合均勻，自然 PH 值，于 121°C、0. IMPa 下滅菌 30min。首先將纖維素降解菌(即本發明的兩種芽孢桿菌)分別于34°C培養24h后麥麩吸附制成濃度為IO8個/g的孢子粉劑，按照1 1體積比混合，秸稈降解率為39.6%，高于單株菌；而本發明將兩種纖維素降解菌和木質素降解菌復配，秸稈降解率提高到50. 2%。說明這種組合中的菌株存在著一定的協同性，他們之間沒有拮抗性。本發明菌種組合菌劑以稻草秸稈降解率為指標，其對稻草秸稈的降解率比單菌種有明顯提高，達到了 50.2%。實施例4本發明菌劑在縮短稻草秸稈腐熟時間中的應用試驗設5個處理，3次重復。處理1 常規施肥+稻草還田+合緣牌牌有機物料腐熟劑；處理2 常規施肥+稻草還田+本發明的菌劑；處理3 常規施肥+稻草還田+谷霖牌有機物料腐熟劑；處理4 常規施肥+稻草還田；處理5 常規施肥；晚稻試驗區隨機排列，小區面積33. 3M2。試驗結果為處理2比處理4縮短腐熟時間，較處理1和處理3為優(見表 1)。表1不同處理稻草腐熟程度記載表
權利要求
1.ー種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑，其特征在干，所述的菌劑中含有含菌量配比1 ι 1的康寧木霉CGMCC NO. 3.似90 ；地衣芽孢桿菌CGMCC NO. 4835 ； 枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414 ；所述的菌劑由以下三種成分混合組成康寧木霉CGMCC NO. 3. 4290依次經過液體發酵、固體發酵培養后的產物、地衣芽孢桿菌CGMCC NO. 4835液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物、枯草芽孢桿菌CGMCC NO. 1. 1414液體發酵培養后的培養物和麥麩吸附的產物。
2.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的康寧木霉CGMCCNO. 3. 4290于 25-觀で固體發酵培養45-4 ，產物中菌含量不低于IO8個/g，所述的枯草芽孢桿菌在 34-37°C培養22-24h，所述的地衣芽孢桿菌在45_55°C培養36_40h后，分別將培養物與麥麩吸附，產物中菌含量均不低于IO9個/g，所述的菌含量包括菌體和芽孢總的含量。
3.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的菌劑中菌含量不低于2XIO8個/ g，菌劑細度不超過0. 18mm,含水量不高于30 %。
4.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的康寧木霉CGMCCN0. 3. 4290固體發酵具體過程如下首先將所述的康寧木霉CGMCC N0. 3. 4290經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，培養時間22-Mh，溫度25-28°C，轉速 120-150rpm ；通氣量0. 4-0. 5VVM ；接種量占培養基體積的10-15%，發酵罐中培養基裝量占發酵罐體積的60-70%，液體發酵培養基配制方法為蔗糖20g，酵母粉0. 2g，麥芽粉3. Og, NaCl 0. lg, CaCl2 · 2H20 0. lg, KH2PO4 1. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g，(NH4)2SO4 0. 5g，加蒸餾水至 1L, pH6. 5，121°C,0. IMPa 高壓滅菌 30min ；然后接種占固體培養基重量10-15%的發酵培養種子液，25- °C固體發酵培養 45-48h ；固體發酵培養基的配制方法為玉米粉10g，麥麩90g，(NH4)2SO4 1. 0g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 05g，80mL蒸餾水，121°C,0. IMPa高壓滅菌30min,固體發酵罐中培養基的裝量為體積的60-70%。
5.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的地衣芽孢桿菌CGMCCN0. 4835經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，所用液體發酵培養基的配制方法為淀粉5. 0g，糊精20g，豆餅粉25g，酵母粉3. 0g, CaCO3 12g， (NH4)2SO4 10g，NaCl 4. 0g, KH2PO4 0. 2g，加蒸餾水至 1L，ρΗ7· 2-7. 4，121°C,0. IMPa 高壓滅菌30min ；培養時間36_40h，溫度45_55°C，轉速180_200rpm，通氣量0. 8-1. 0VVM，接種量占培養基體積的8-10%，發酵罐中培養基的裝液量為發酵罐體積的55-65%。
6.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，所述的枯草芽孢桿菌CGMCCNO. 1. 1414經過斜面種子活化、搖瓶種子培養后，將搖瓶種子培養液接種到液體發酵罐培養基中培養，所用液體發酵培養基的配制方法為葡萄糖5. 0g，蔗糖3. 0g，豆餅粉15g，酵母粉10g，蛋白胨 5. 0g, CaCO3 1. 0g, FeCl3 · 6H20 0. lg, KH2PO4 4. 0g, MgSO4 · 7H20 0. 5g, MnSO4 · H2O 0. 062g, 加蒸餾水至1L，ρΗ7· 2，121°C,0. IMPa高壓滅菌30min ；培養時間22_24h，溫度34_37°C，轉速180-200rpm，通氣量0. 8_1. 0VVM，接種量占培養基體積的8_10 %，發酵罐中培養基的裝液量為發酵罐體積的55-65%。
7.根據權利要求1所述的菌劑，其特征在干，麥麩吸附吋，其重量比例占70-80%。
8.權利要求1-7任意一項所述的菌劑的應用方法，其特征在干，用于提高水稻性狀和產量。
9.根據權利要求8所述的應用方法，其特征在干，添加到稻草秸稈中，用于加速稻草秸稈腐熟、提高土壌中有機質、速效鉀的含量，加速水稻營養供應、促進有效分蘗，從而增加株高和有效穗，提升水稻產量。
全文摘要
本發明公開了應用于稻草的就地還田高效穩定成肥使用的一種快速降解稻草秸稈的有機物料腐熟組合菌劑及其應用方法。所述的菌劑中含有含菌量配比1∶1∶1的康寧木霉CGMCC NO.3.4290；地衣芽孢桿菌CGMCC NO.4835；枯草芽孢桿菌CGMCC NO.1.1414；所述的菌劑是將所述的康寧木霉固體發酵培養后的產物；與兩種芽孢桿菌液體培養后的培養物和麥麩吸附的產物混合后得到的菌劑。其細度不超過0.18mm，含水量低于30％。由于本發明的菌劑以孢子為主要存在形式，適應性強，適于噴施、撒施，易于機械化操作，可以大大降低勞動強度，縮短使用周期，加速秸稈腐熟，有利于大規模使用。
文檔編號C12N1/14GK102533553SQ20111045005
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者吳迎奔, 尹紅梅, 王震, 許麗娟, 賀月林, 陳薇 申請人:湖南省微生物研究所