專利名稱：一種利用組織培養方法生產甘草多糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養方法，具體的說涉及一種甘草細胞培養生產甘草多糖的方法。
背景技術：
甘草作為一種傳統中藥，自古以來就有“十方九草”的美譽，甘草多糖是甘草中三大主要活性成分之一。甘草作為我國常用的大宗藥材，國家二級保護植物；是國家專控藥材，甘草中有效成分，生物活性強，應用廣，價格高，市場需求日益強勁，而野生甘草種子出芽率低，加上掠奪性開采；供求矛盾日益嚴重；沙漠嚴重，利用組織培養技術生產甘草活性成分具有廣闊的發展前景。自本世紀初，利用植物細胞，組織和器官培養的方法生產藥用活性物質的研究取得了驚人的進展，已有近1000種植物進行過細胞培養方面的研究，據估計，已經從400多種植物中建立了組織和細胞培養物，并從中分離出600多種代謝產物， 甘草懸浮細胞生產出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、 免疫調節活性，具有很強的免疫調節、抗疲勞的作用，具有廣闊的開發前景。甘草細胞懸浮培養，利用本實驗室自行研發的一種適合細胞懸浮培養的生物反應器，中國專利申請號 201110255311. 9發明名稱一種植物組織培養用鼓泡式生物反應器。同時經對現有技術文獻的檢索發現，中國專利申請號200810040456. 5，發明名稱為利用組織培養生產大豆異黃酮的方法的專利中公開了一種利用大豆愈傷組織生產大豆異黃酮的方法，該方法的成功為組織培養技術生產目的產物提供一種可能。目前甘草資源缺乏，通過細胞培養方式生產甘草多糖具有廣闊前景，并還未見報道。
發明內容
為了現有技術中的問題，本發明提供了一種甘草細胞培養生產甘草多糖的方法， 解決目前甘草資源缺乏的問題。本發明是通過如下技術方案實現的一種利用組織培養方法生產甘草多糖的方法，包括如下步驟(1)培養誘導甘草無菌苗取成熟的甘草種子，用消毒液消毒滅菌，然后將無菌種子接種到萌發培養基上，經過培養得到甘草無菌苗；(2)利用無菌苗頸段誘導愈傷組織切取上一步得到的無菌苗頸段，接到愈傷組織誘導培養基中，每觀天繼代培養1次，連續繼代培養3次得到穩定的愈傷組織；(3)甘草懸浮細胞的誘導挑選形狀松散、顏色淺的愈傷組織誘導懸浮細胞，經挑選，繼代培養得到穩定高產的細胞系；(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器的培養挑選穩定高產的細胞系，利用自行研發設計的鼓泡式生物反應器培養，得到成熟的甘草細胞；(5)甘草多糖的提取用水提醇沉法提取步驟(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。
所述步驟(1)甘草無菌苗的誘導方法為挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子， 用5% 15%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉速為200r/min 500r/ min，溫度為20°C 30°C，滅菌時間20min 40min，MS培養中含2% 蔗糖，滅菌前pH 5 6，接種在含MS固體培養基的三角瓶內，放在20 光照培養箱中，培養30 35 天，得到甘草無菌苗。所述步驟O)甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經多次篩選繼代后，生長狀態穩定；愈傷組織繼代培養基為MS培養基，附加2，4-D(0. 5 2mg · Γ1)， NAA (0. 5 2mg · L"1), 6-BA (0. 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，滅菌前 pH 5 6，繼代周期 25 30天。所述步驟(3)甘草懸浮細胞培養基成分為3/4MS培養基，附加2，4_D(0.5 2mg · Γ1)，NAA (0. 5 2mg · Γ1)，6-BA (0. 1 0. 3mg · Γ1)，2 5 % 蔗糖，初次培養 3 5 天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔15 20天繼代一次；搖床轉速110 120r · mirT1，培養溫度(20 28) V ；經過數次傳代篩選，最終獲得性能優異的細胞系。所述步驟(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養是指利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為5 % 10 %的鮮重甘草細胞，發酵罐通氣量為200L/min 500L/min，培養基成分為 3/4MS 培養基，附加 2，4-D(0. 5 2mg · L—1)，NAA(0. 5 2mg · L—1)，6_ΒΑ(0· 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，PH值為5 9，培養周期為15 20天。所述步驟( 甘草多糖的提取是指取甘草細胞粉末，加入15 25倍重量的蒸餾水，靜置5 12h，水浴1 5次，每次1 池，重復水浴2 5次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調制終濃度為50 90%，0 6°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白， 干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。本發明的有益效果為本發明的生產方法利用甘草愈傷組織，誘導產生甘草懸浮細胞，在鼓泡式發酵罐中生產甘草多糖，懸浮細胞生產出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節活性，具有很強的免疫調節、抗疲勞的作用，這種方法不受季節及地域的限制，方便，易操作，具有廣闊的開發前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。第一步，甘草無菌苗的獲得挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子，用10%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉速為300r/min，溫度為25°C，滅菌時間 30min，MS培養中含3%蔗糖，滅菌前pH 5. 9，接種在含MS固體培養基50ml的三角瓶內，放在25°C光照培養箱中，培養30天，得到甘草無菌苗。第二步，甘草愈傷組織的獲得甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經多次篩選繼代后，生長狀態穩定。愈傷組織繼代培養基為MS培養基，附加2，4-D (lmg O， NAAdmg · L—1)，6-BA(0. 2mg · L—1)，3%蔗糖，滅菌前 pH 5. 9，繼代周期 28 天。第三步，甘草懸浮細胞的獲得選擇生長速度快、質地松散、淡黃色的甘草愈傷組織，用鑷子夾碎后轉移到液體培養基中進行懸浮培養。培養及成分為3/4MS培養基，附加2， 4-D(lmg · L-1)，NAAdmg · L—1)，6_BA(0. 2mg · L—1)，3%蔗糖，初次培養 3 天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔18天繼代一次。搖床轉速110 120r ^mirT1,培養溫度(20 28) °C。經過數次傳代篩選，最終獲得性能優異的細胞系。第四步，甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為8 %的鮮重甘草細胞，發酵罐通氣量為300L//min，培養及成分為3/4MS培養基，附加 2，4-D(lmg · L-1)，NAA (Img · 1^),61(0. 2mg · 1^)，3%蔗糖，PH 值為 5. 9，培養周期為 18天。第五步，甘草多糖的提取取甘草細胞粉末，加入20倍重量的蒸餾水，靜置12h，沸水浴提取，提取時間lh。重復水浴提取3次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調制終濃度為75 %，4°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎得到甘草多糖粉末。經過本發明方法誘導出的高產細胞系結合生物反應器的培養，使得甘草細胞干重增值倍數達到11倍，甘草多糖含量達到10%。本發明的方法工藝簡單，為生產甘草多糖提供一種新的途徑，此方法是中藥生物工程的一種，不受季節和地域的限制。
權利要求
1.一種利用組織培養方法生產甘草多糖的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)培養誘導甘草無菌苗取成熟的甘草種子，用消毒液消毒滅菌，然后將無菌種子接種到萌發培養基上，經過培養得到甘草無菌苗；(2)利用無菌苗頸段誘導愈傷組織切取上一步得到的無菌苗頸段，接到愈傷組織誘導培養基中，每觀天繼代培養1次，連續繼代培養3次得到穩定的愈傷組織；(3)甘草懸浮細胞的誘導挑選形狀松散、顏色淺的愈傷組織誘導懸浮細胞，經挑選， 繼代培養得到穩定高產的細胞系；(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器的培養挑選穩定高產的細胞系，利用自行研發設計的鼓泡式生物反應器培養，得到成熟的甘草細胞；(5)甘草多糖的提取用水提醇沉法提取步驟(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。
2.根據權利要求1所述生產甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)甘草無菌苗的誘導方法為挑選顆粒飽滿，呈深綠色的甘草種子，用5% 15%的次氯酸鈉在磁力攪拌器上對種子進行攪拌滅菌，轉速為200r/min 500r/min，溫度為20°C 30°C，滅菌時間 20min 40min，MS培養中含2% 蔗糖，滅菌前pH 5 6，接種在含MS固體培養基的三角瓶內，放在20 光照培養箱中，培養30 35天，得到甘草無菌苗。
3.根據權利要求1所述生產甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟( 甘草愈傷組織是從甘草無菌苗下胚軸誘導得來，經多次篩選繼代后，生長狀態穩定；愈傷組織繼代培養基為 MS 培養基，附加 2，4-D(0. 5 2mg .廠1)，ΝΑΑ(0· 5 2mg .171)，6_BA(0. 1 0. 3mg .171)， 2 5%蔗糖，滅菌前pH 5 6，繼代周期25 30天。
4.根據權利要求1所述生產甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟C3)甘草懸浮細胞培養基成分為 3/4MS 培養基，附加 2，4-D (0. 5 2mg .L—1)，NAA (0. 5 2mg .L—1)，6-BA (0. 1 0. 3mg · L—1)，2 5%蔗糖，初次培養3 5天后，將懸浮的大塊愈傷組織過濾除去，懸浮細胞每隔15 20天繼代一次；搖床轉速110 120r · mirT1，培養溫度QO 28) V ；經過數次傳代篩選，最終獲得性能優異的細胞系。
5.根據權利要求1所述生產甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(4)甘草懸浮細胞鼓泡式反應器培養是指利用自行設計的5L鼓泡式反應器，接種量為5% 10%的鮮重甘草細胞，發酵罐通氣量為200L/min 500L/min，培養基成分為3/4MS培養基，附加2， 4-D (0. 5 2mg · L-1)，NAA(0. 5 2mg · L-1)，6_BA(0. 1 0. 3mg · L-1)，2 5%蔗糖，PH 值為5 9，培養周期為15 20天。
6.根據權利要求1所述生產甘草多糖的方法，其特征在于，所述步驟(5)甘草多糖的提取是指取甘草細胞粉末，加入15 25倍重量的蒸餾水，靜置5 12h，水浴1 5次，每次1 池，重復水浴2 5次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調制終濃度為50 90%，0 6°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。
全文摘要
本發明公開了一種利用組織培養方法生產甘草多糖的方法，包括如下步驟(1)培養誘導甘草無菌苗；(2)從甘草無菌苗下胚軸誘導甘草愈傷組織；(3)選擇生長速度快、質地松散、淡黃色的甘草愈傷組織，用鑷子夾碎后轉移到液體培養基中進行懸浮培養，獲得甘草懸浮細胞；(4)鼓泡式反應器培養甘草懸浮細胞；(5)從步驟(4)所得甘草懸浮細胞中提取甘草多糖得甘草多糖粉末。本發明的懸浮細胞生產出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明顯的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節活性，具有很強的免疫調節、抗疲勞的作用，這種方法不受季節及地域的限制，方便，易操作，具有廣闊的開發前景。
文檔編號C12N5/04GK102532337SQ20111045122
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者劉輝, 呂連媛, 滿淑麗, 王娟, 董艷艷, 郭松波, 高文遠 申請人:天津大學