專利名稱：一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測技術，尤其涉及一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器。
背景技術：
細胞外環境毒物種類非常廣泛，如細菌，病毒，有毒藥物，重金屬毒物等，也開發了檢測這些環境毒物的傳感器及檢測手段。與此同時，細胞自身代謝傳感器及檢測方法也飛速地發展，如膜片鉗法，安培計法，膜電容法等，這些技術也正在向商業化發展。然而，現有還沒有可以同時檢測細胞外環境毒物重金屬離子的濃度與細胞代謝離子濃度的傳感器及檢測方法，因此，無法定量地研究胞外重金屬離子濃度高低對細胞代謝的作用，并且無法給出兩者之間的定量化關系，這成為阻礙細胞外環境毒物與細胞代謝機理分析快速發展的瓶 頸。
實用新型內容本實用新型的目的在于針對現有技術的不足，提供一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器，本實用新型可以實時快速并行檢測和分析環境毒物中重金屬離子與細胞代謝的離子濃度。本實用新型的目的是通過以下技術方案來實現的一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器，包括微型培養腔、注射泵、培養液注射器、藥物注射器、第一硅膠導管、廢液缸、單片機、紅外LED、傳感器單元加熱塊、流路加熱塊和第二硅膠導管。其中，微型培養腔主要由腔蓋、固定柱、鉬絲電極、活塞、硅膠圈、小培養腔、大培養腔、固定腔、環狀薄墊片、光尋址電位傳感器、標準電話機接口、傳感器電路板和傳感器底座組成，固定腔中空，固定在傳感器電路板上，標準電話機接口焊接在傳感器電路板上；光尋址電位傳感器在固定腔內，并通過導電膠粘結在傳感器電路板上；大培養腔置于光尋址電位傳感器上，大培養腔底部的第二半透膜與光尋址電位傳感器接觸，環狀薄墊片置于大培養腔底部的第二半透膜上，小培養腔置于環狀薄墊片上，固定柱、活塞和硅膠圈從上至下依次置于小培養腔底部的第一半透膜上，腔蓋位于固定柱頂部，傳感器底座位于傳感器電路板底部，紅外LED位于傳感器底座的空腔內并焊接在傳感器電路板底部，傳感器底座置于傳感器單元加熱塊上；腔蓋、固定腔、傳感器電路板和傳感器底座通過固定螺桿固定。鉬絲電極、第一硅膠導管、第二硅膠導管的一端均依次穿過腔蓋、固定柱和活塞到達小培養腔內，鉬絲電極的另一端通過電極引線與傳感器電路板相連，第一硅膠導管的另一端穿過流路加熱塊后分別與培養液注射器和藥物注射器相連，培養液注射器和藥物注射器分別位于兩個注射泵內；第二硅膠導管的另一端伸入廢液缸內。標準電話機接口、傳感器單元加熱塊、流路加熱塊和兩個注射泵均與單片機相連。進一步地，所述光尋址電位傳感器上同時沉積了 Zn2+硫系玻璃敏感膜和Cl—聚氯乙烯敏感膜。[0006]本實用新型的有益效果，本實用新型采用Zn2+硫系玻璃敏感膜和Cl—聚氯乙烯敏感膜同時沉積在結合光尋址電位傳感器表面，形成Zn2+硫系玻璃敏感膜-Cr聚氯乙烯敏感膜-光尋址電位傳感器，可以快速同時檢測檢測細胞外環境毒物中Zn2+濃度與細胞代謝Cl—離子濃度的傳感器，可有效用于同時檢測環境毒物重金屬Zn2+離子濃度與細胞代謝Cl—離子濃度、并推斷出重金屬Zn2+離子濃度與細胞代謝之間的定量化關系。采用具有良好生物相容性半透膜培養細胞更利于細胞貼附和生長保持原有的生理狀態，構建的微型腔體可以提高離子濃度的靈敏度，傳感器整體單元的固定，使微腔體和流路腔具有良好的密封性，同時又能保證檢測條件的一致性，整個傳感器單元的所有配件均采用可分離獨立式設計，便于傳感器單元各部分的配件快速更換，極大的降低更換配件成本，提高傳感器封裝單元的使用壽命。以上這些優點和功能可以滿足同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的檢測要求，可廣泛用于重金屬濃度對細胞代謝機理研究的相關領域。
圖I是本實用新型同時檢測環境毒物與細胞代謝的傳感器的整體結構圖； 圖2是本實用新型傳感器單元細胞培養檢測腔體的結構圖；圖3是本實用新型Zn2+硫系玻璃敏感膜-Cr聚氯乙烯敏感膜-光尋址電位傳感器的結構圖；圖4是本實用新型細胞培養檢測腔體和獨立分離式的傳感器的組裝結構圖；圖5是本實用新型單片機工作流程圖。圖6是本實用新型的傳感器單元檢測環境毒物中Zn2+濃度的結果圖；圖7是本實用新型的傳感器單元檢測細胞代謝產生的Cl—濃度的結果圖；圖中，注射泵I、培養液注射器2、藥物注射器3、固定螺桿4、腔蓋5、固定柱6、鉬絲電極7、活塞8、小培養腔9、大培養腔10、固定腔11、第一娃膠導管12、娃膠圈13、第一半透膜14、環狀薄墊片15、第二半透膜16、光尋址電位傳感器17、標準電話機接口 18、傳感器電路板19、傳感器底座20、廢液缸21、單片機22、紅外LED23、傳感器單元加熱塊24、流路加熱塊25、電極引線26、第二硅膠導管27、Zn2+硫系玻璃敏感膜28、Cl_聚氯乙烯敏感膜29、第一掩膜30、第二掩膜31。
具體實施方式
下面詳細介紹所使用光尋址電位傳感器的基本原理和Zn2+硫系玻璃敏感膜、Cr聚氯乙烯敏感膜檢測離子的基本原理。光尋址電位傳感器核心是電解液/絕緣層/半導體結構，光尋址電位傳感器利用了半導體的內光電效應，即當半導體受到一定波長的光照射時，半導體吸收光子，發生禁帶到導帶的躍遷也就產生了電子空穴對。在傳感器兩側外加偏置電壓時，半導體中產生耗盡層，這些光生載流子對中的一部分總能在未重新復合前到達耗盡層，于是電子和空穴被耗盡層的強電場分離，此過程中電子空穴對的移動即形成光電流。光尋址電位傳感器采用強度調制的光照射在器件的表面，則外電路中就可以檢測到交替變化的光電流。光電流的大小與傳感器兩端電勢差的大小相關，其頻率等于照射光強變化的頻率。Zn2+硫系玻璃和Cl—聚氯乙烯敏感膜的表面膜上的活性物質一般含有帶正電荷或負電荷的有機離子或絡合離子，它們與相應的金屬離子會形成離子交換鹽類。敏感膜的選擇性敏感機制，定量表現為被測離子在膜表面發生的物理、化學反應，從而產生電勢差。該電勢差的大小與溶液中離子分子等的種類和濃度有關。通過對此電勢差的測量，可以達到對溶液中待測離子濃度的檢測。
以下結合附圖和實施例進一步說明本實用新型，本實用新型的目的和效果將變得更加明顯。如圖1-4所示，本實用新型同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的檢測系統，包括微型培養腔、注射泵I、培養液注射器2、藥物注射器3、第一娃膠導管12、廢液缸21、單片機22、兩個紅外LED23、傳感器單元加熱塊24、流路加熱塊25和第二硅膠導管27。其中，微型培養腔主要由腔蓋5、固定柱6、鉬絲電極7、活塞8、硅膠圈13、小培養腔9、大培養腔10、固定腔11、環狀薄墊片15、光尋址電位傳感器17、標準電話機接口 18、傳感器電路板19和傳感器底座20組成，固定腔11中空，固定在傳感器電路板19上，標準電話機接口 18焊接在傳感器電路板19上；光尋址電位傳感器17在固定腔11內，并通過導電膠粘結在傳感器電路板19上；大培養腔10置于光尋址電位傳感器17上，大培養腔10底部的第二半透膜·16與光尋址電位傳感器17接觸，環狀薄墊片15置于大培養腔10底部的第二半透膜16上，小培養腔9置于環狀薄墊片15上，固定柱6、活塞8和硅膠圈13從上至下依次置于小培養腔9底部的第一半透膜14上,腔蓋5位于固定柱6頂部,傳感器底座20位于傳感器電路板19底部，兩個紅外LED23位于傳感器底座20的空腔內并焊接在傳感器電路板19底部，傳感器電路板19相應兩個紅外LED23的位置上具有2個通孔，傳感器底座20置于傳感器單元加熱塊24上；腔蓋5、固定腔11、傳感器電路板19和傳感器底座20通過固定螺桿4固定。鉬絲電極7、第一硅膠導管12、第二硅膠導管27的一端均依次穿過腔蓋5、固定柱6和活塞8到達小培養腔9內，鉬絲電極7的另一端通過電極引線26與傳感器電路板19相連，第一硅膠導管12的另一端穿過流路加熱塊25后分別與培養液注射器2和藥物注射器3相連，培養液注射器2和藥物注射器3分別位于兩個注射泵I內；第二硅膠導管27的另一端伸入廢液缸21內。標準電話機接口 18、傳感器單元加熱塊24、流路加熱塊25和兩個注射泵I均與單片機22相連。本實用新型的工作過程如下；將細胞培養至大培養腔10中的第二半透膜16上，依次將環狀薄墊片15和小培養腔9的第一半透膜14蓋在細胞上方，形成細胞培養微腔體，用于細胞的培養和檢測。然后將硅膠圈13和活塞8，依次放置在第一半透膜14的上方，形成流路培養腔，通過注射泵I、培養液注射器2、藥物注射器3、第一硅膠導管12對細胞培養液進行更新，細胞廢液通過第二硅膠導管27流入廢液缸21中。如圖3所示，光尋址電位傳感器17上同時沉積了 Zn2+硫系玻璃敏感膜28、Cl—聚氯乙烯敏感膜29。采用導電膠將光尋址電位傳感器17粘在傳感器電路板19上，將兩個紅外LED23、電極引線26和標準電話機接口 18焊接在傳感器電路板19上。利用中間帶IcmX Icm方孔第一掩膜30,選用現有的芯片點樣儀在芯片表面懸涂溶解在四氫呋喃中的Cl—聚氯乙烯敏感膜29，在4° C條件下密封避光保存10小時以上，待四氫呋喃揮發即可在光尋址電位傳感器17上形成面積為IcmX Icm厚度為400nm Cl-聚氯乙烯敏感膜29。利用中間帶IcmX Icm方孔第二掩膜31，選用現有的脈沖激光沉積技術進行成膜，脈沖激光沉積技術利用短脈沖高能激光束，在基底溫度為373K、壓力為20Pa N2的真空腔中，采用能量密度為O. 2J · cm_2、波長248nm、脈沖寬度為30ns、重復頻率為I. 3Hz的脈沖激光，沉積時間為30min,將Zn2+硫系玻璃敏感膜28從靶材上蒸發材料到光尋址電位傳感器17上形成面積為IcmX Icm厚度為300nm Zn2+硫系玻璃敏感膜28。細胞代謝過程中產生Cl_，引起細胞培養微型腔內對應離子濃度的變化，Cl—的特異性Cr聚氯乙烯敏感膜29會特異性結合Cl_，從而引起表面電勢的變化，使光尋址電位傳感器17輸出光生電流信號，環境毒物中的毒性離子Zn2+，引起微型腔內Zn2+濃度的變化，Zn2+的特異性Zn2+硫系玻璃敏感膜29會特異性結合Zn2+，從而引起表面電勢的變化，引起光尋址電位傳感器17輸出光生電流信號幅值的變化。如圖5所示，單片機的工作流程如下單片機22產生兩個頻率在IkHz-IOkHz的PWM波，其中，一個PWM波驅動一個紅外LED23工作，該紅外LED23穿過傳感器電路板19的通孔照射光尋址電位傳感器17上Zn2+硫系玻璃敏感膜28所在區域的背面；Zn2+硫系玻璃敏感膜28所在區域產生與該PWM波的頻率相同的光生電流信號；另一個PWM波驅動另一個紅外LED23工作，該紅外LED23穿過傳感器電路板19的通孔照射光尋址電位傳感器17 上Cl—聚氯乙烯敏感膜29所在區域的背面；C1_聚氯乙烯敏感膜29所在區域產生與該PWM波的頻率相同的光生電流信號，兩個光生電流信號疊加，形成傳感器信號。單片機22通過標準電話機接口 18接收傳感器信號，然后通過快速傅里葉變換計算出傳感器兩個檢測區域產生的兩個光生電流信號的幅值，在鉬絲電極上加載從-IV到+IV的工作電壓，記錄對應工作電壓的光生電流信號幅值，構成ι-v曲線，通過求導算法計算曲線斜率絕對值最大值對應的工作電壓。本實用新型的工作過程如下I、將細胞培養至大培養腔10中的第二半透膜16上，依次將環狀薄墊片15和小培養腔9蓋在細胞上方，形成細胞培養微腔體，用于細胞的培養和檢測；2、單片機22初始化后，采用PID算法對傳感器單元加熱塊24和流路加熱塊25進行37°C的恒溫控制，在鉬絲電極7上加載工作電壓，單片機22控制培養液注射器2和藥物注射器3向細胞培養微腔體內注射入細胞培養液和藥物；細胞培養液可以采用RPMI1640培養基，藥物可以采用Zn (NO3)2溶液，其濃度為KTmol/L-K^mol/L。3、單片機22產生兩個頻率在IkHz-IOkHz的PWM波，其中，一個PWM波驅動一個紅外LED23工作，該紅外LED23穿過傳感器電路板19的通孔照射光尋址電位傳感器17上Zn2+硫系玻璃敏感膜28所在區域的背面；Zn2+硫系玻璃敏感膜28所在區域產生與該PWM波的頻率相同的光生電流信號；另一個PWM波驅動另一個紅外LED23工作，該紅外LED23穿過傳感器電路板19的通孔照射光尋址電位傳感器17上Cl—聚氯乙烯敏感膜29所在區域的背面；Cl—聚氯乙烯敏感膜29所在區域產生與該PWM波的頻率相同的光生電流信號，兩個光生電流信號疊加，形成傳感器信號。4、單片機22通過標準電話機接口 18接收傳感器信號，然后通過快速傅里葉變換計算出傳感器兩個檢測區域產生的兩個光生電流信號的幅值，通過光尋址電位傳感器17的I-V曲線換算出Zn2+和Cl—離子產生的表面電勢，通過Zn2+的濃度標定曲線及其表面電勢計算出對應環境中Zn2+濃度，通過Cl—的濃度標定公式及其表面電勢計算出細胞代謝的Cl—濃度，最終實現同時檢測環境毒物和細胞代謝的離子濃度。光尋址電位傳感器17的I-V曲線的建立過程如下在鉬絲電極上加載從-IV到+IV的工作電壓，記錄對應工作電壓的光生電流信號幅值，構成I-V曲線。Cl—的濃度標定公式的建立過程如下通過檢測lOHmol/L、10_2mol/L、10_3mol/L、10-4mol/L、l(r5mol/L、10-6mol/L濃度的Zn2+表面電勢得到Zn2+的濃度與表面電勢關系式，檢測 KTmol/LUOimol/LUO—Smol/UlOimol/UlO—Smol/UlO—Smol/L 的 Cl—表面電勢得到CF的濃度與表面電勢關系式。下面給出本實用新型的應用案例。同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的檢測系統及方法主要應用于微環境中的毒性離子與細胞代謝離子的檢測。實驗中，采用傳感器單元中的光尋址電位傳感器檢測微環境中的Zn2+與細胞代謝Cl—的變化，采用人的乳腺癌MCF-7細胞，微環境中的毒性離子Zn2+實驗結果如圖6所示。由圖中可以看出，微環境中毒性離子的濃度與傳感器的響應成正比關系，隨著濃度的增加，傳感器響應信號也逐步增加，并成較好的線性關系；細胞生理代謝產生的離子Cl—實驗結果如圖7所示，由圖中可以看出，細胞代謝離子的濃度與傳感器 的響應成正比關系，隨著離子濃度的增加，傳感器響應信號也逐步增加，并成較好的線性關系。實驗結果表明本實用新型的傳感器及檢測方法具備同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝功能，能同時檢測毒物環境中的Zn2+濃度和細胞代謝產生Cr濃度。
權利要求1. 一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器，包括微型培養腔、注射泵(I)、培養液注射器(2)、藥物注射器(3)、第一硅膠導管(12)、廢液缸(21)、單片機(22)、紅外LED (23)、傳感器單元加熱塊(24)、流路加熱塊(25)和第二硅膠導管(27);其中，微型培養腔主要由腔蓋(5)、固定柱(6)、鉬絲電極(7)、活塞(8)、硅膠圈(13)、小培養腔(9)、大培養腔(10)、固定腔(11)、環狀薄墊片(15)、光尋址電位傳感器(17)、標準電話機接口(18)、傳感器電路板(19)和傳感器底座(20)組成，固定腔(11)中空，固定在傳感器電路板(19)上，標準電話機接口(18)焊接在傳感器電路板(19)上；光尋址電位傳感器(17)在固定腔(II)內，并通過導電膠粘結在傳感器電路板(19)上；大培養腔(10)置于光尋址電位傳感器(17)上，大培養腔(10)底部的第二半透膜(16)與光尋址電位傳感器(17)接觸，環狀薄墊片(15)置于大培養腔(10)底部的第二半透膜(16)上，小培養腔(9)置于環狀薄墊片(15)上，固定柱(6)、活塞(8)和硅膠圈(13)從上至下依次置于小培養腔(9)底部的第一半透膜(14)上，腔蓋(5)位于固定柱(6)頂部，傳感器底座(20)位于傳感器電路板(19)底部，兩個紅外LED (23)位于傳感器底座(20)的空腔內并焊接在傳感器電路板(19)底部，傳感器電路板(19)相應兩個紅外LED (23)的位置上具有兩個通孔，傳感器底座(20)置于傳感器單元加熱塊(24)上；腔蓋(5 )、固定腔(11)、傳感器電路板(19 )和傳感器底座(20 )通過固定螺桿(4)固定；鉬絲電極(7)、第一硅膠導管(12)、第二硅膠導管(27)的一端均依次穿過腔蓋(5)、固定柱(6)和活塞(8)到達小培養腔(9)內，鉬絲電極(7)的另一端通過電極引線(26)與傳感器電路板(19)相連，第一硅膠導管(12)的另一端穿過流路加熱塊(25)后分別與培養液注射器(2 )和藥物注射器(3 )相連，培養液注射器(2 )和藥物注射器(3 )分別位于兩個注射泵(I)內；第二硅膠導管(27)的另一端伸入廢液缸(21)內；標準電話機接口(18)、傳感器單元加熱塊(24)、流路加熱塊(25 )和兩個注射泵(I)均與單片機(22 )相連。
專利摘要本實用新型公開了一種同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的傳感器，本實用新型采用Zn2+硫系玻璃敏感膜和Cl-聚氯乙烯敏感膜同時沉積在結合光尋址電位傳感器表面，形成Zn2+硫系玻璃敏感膜-Cl-聚氯乙烯敏感膜-光尋址電位傳感器，可以快速同時檢測檢測細胞外環境毒物中Zn2+濃度與細胞代謝Cl-離子濃度，并推斷出兩者之間的定量化關系。構建的型腔體可以提高離子濃度的靈敏度，同時能保證檢測條件的一致性，極大地降低更換配件成本，提高傳感器封裝單元的使用壽命；以上這些特點可以滿足同時檢測細胞外環境毒物與細胞代謝的要求，可廣泛用于重金屬濃度對細胞代謝機理研究的相關領域。
文檔編號C12M1/34GK202595146SQ2011205206
公開日2012年12月12日 申請日期2011年12月14日 優先權日2011年12月14日
發明者王平, 胡寧, 哈達, 吳成雄, 程功, 王天星, 王江容, 周潔 申請人:浙江大學